吳雅婷， 汪笑宇， 湯青平， 武尊， 高浩峰， 何學(xué)欣，楊張磊， 賈旭穎， 邵蓬*

（1.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384；2.天津市水產(chǎn)研究所，天津 300221）

半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevisGunther）, 國內(nèi)俗稱“牛舌頭”“鰨目”, 主要分布在我國的黃海和渤海海域, 體型大、生長快、經(jīng)濟(jì)價值高，已成為我國北方沿海地區(qū)重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類[1]。隨著養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，各種疾病也隨之發(fā)生，其中皮膚潰瘍病給天津地區(qū)半滑舌鰨的養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。半滑舌鰨的體表潰瘍癥大多與弧菌病有關(guān)，包括哈維氏弧菌(Vibrio harveyi) 、鰻弧菌(V.anguillarum)、需鈉弧菌(V.natriegens)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、燦爛弧菌(V.splendidus)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、輪蟲弧菌(V.rotiferianus)、創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus)、殺鮭弧菌(V.salmonicida)、海利斯頓氏菌(V.pelagius)、美人魚弧菌(V.damsela)、奧氏弧菌(V.ordalii)、費氏弧菌(V.fischeri)以及最小弧菌(V.mimicus)等[3-4]。其中，哈維氏弧菌導(dǎo)致的水產(chǎn)動物死亡已經(jīng)引起廣泛關(guān)注。陳政強(qiáng)等[2]從體表潰瘍的半滑舌鰨體內(nèi)分離出輪蟲弧菌和哈維氏弧菌；許悅等[5]從體表潰瘍的石斑魚體內(nèi)分離出9株菌，經(jīng)鑒定全部為哈維氏弧菌。

哈維氏弧菌（ATCC 14126T）最早從死片腳類動物中分離出來，并于1935年命名為Achromobacter harveyi[6]，分類到發(fā)光桿菌屬，之后又被分到貝內(nèi)克氏菌屬。貝內(nèi)克氏菌屬被廢除后最終被分到弧菌屬[7]。哈維氏弧菌是最常見的1種海洋弧菌，可能與海洋動物的腸道菌群有關(guān)[8]，可以感染很多海洋魚類或無脊椎動物[9]。該病具有死亡率高、流行性強(qiáng)且分布廣的特點[10]，對海水魚類的危害極大。病魚的癥狀主要表現(xiàn)為腹水，腸道外翻，腎臟及脾臟充血，體表鱗片脫落、潰瘍，嚴(yán)重時潰瘍處不斷擴(kuò)大形成潰爛，病魚停止攝食，最終死亡[1]。

本研究對某養(yǎng)殖場患病半滑舌鰨進(jìn)行了臨床診斷、病原菌分離、人工感染、藥敏分析以及病理組織切片分析，以期為科學(xué)防治由該菌導(dǎo)致的半滑舌鰨疾病提供參考依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 患病魚的臨床檢查

患病魚體取自天津某半滑舌鰨養(yǎng)殖場，體表觀察后取患病魚的鰓絲及體表黏液制成水浸片于顯微鏡(DM750，Leica)下觀察有無寄生蟲和真菌感染，將病魚解剖進(jìn)一步觀察魚體腸道、肝臟及脾臟等內(nèi)部器官的癥狀。

1.2 病原菌的分離與培養(yǎng)

在無菌條件下分別從病魚的肝臟、腎臟、脾臟等處取樣并接種于2216E和TCBS培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司)，28 ℃培養(yǎng)24 h。根據(jù)菌落形態(tài)分為不同種菌株，挑取單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。純化后的菌株轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中加20%甘油，放于冰箱-80 ℃保存。

1.3 人工感染試驗及LD50測定

健康半滑舌鰨取自天津市濱海新區(qū)某半滑舌鰨養(yǎng)殖公司，體長為18～24 cm，體質(zhì)量35～45 g。根據(jù)養(yǎng)殖場養(yǎng)殖條件（水溫26 ℃，鹽度20）于循環(huán)水中暫養(yǎng)1周，早晚各投喂1次并進(jìn)行池底吸污，1周后開始攻毒試驗。試驗共設(shè)置5個處理組，4個試驗組和1個對照組，每組10尾魚。試驗前將-80 ℃甘油保存的菌株放室溫下復(fù)蘇，經(jīng)2216E平板活化、純化，選擇生長良好的單菌落接種到BHI液體培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司)，28 ℃震蕩培養(yǎng)24 h，待菌體生長是指數(shù)生長期時，12 000 r·min-1離心5 min收集菌體，采用麥?zhǔn)媳葷岱╗11]將菌懸液稀釋為4個水平，依次為1.0×104、1.0×105、1.0×106、1.0×107CFU·mL-1。，每尾魚采用腹腔注射法進(jìn)行感染，注射量均為0.2 mL，對照組注射等量生理鹽水，觀察7 d內(nèi)魚的死亡情況并記錄，用Bliss法測定試驗魚7 d的半數(shù)致死劑量[12]。

1.4 革蘭氏染色及生理生化鑒定

在2216E培養(yǎng)基上取單個菌落置于載玻片上進(jìn)行革蘭氏染色，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)并拍攝記錄。依據(jù)說明書，使用API 20NE試劑盒（法國梅里埃生物中國有限公司）對生理生化鑒定, 依據(jù)《伯杰氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊》[13]選取標(biāo)準(zhǔn)菌進(jìn)行比對。

1.5 16S rRNA擴(kuò)增

用滅菌接種環(huán)挑取單菌落懸浮于100 μL無菌去離子水中,100 ℃水浴10 min, 12 000 r· min-1離心10 min, 取2 μL上清液進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：TaqDNA聚合酶25 μL、10 μmol·L-1的上下游引物各1.5 μL（表1）、滅菌雙蒸水20 μL、DNA模板2 μL。PCR反應(yīng)程序∶95 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s，55 ℃復(fù)性15 s，72 ℃延伸10 s，30個循環(huán)；72 ℃溫育5 min。用1%瓊脂凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，將特異性條帶切膠回收后送至三博遠(yuǎn)志公司測序。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

16S rRNA及gyrB、ftsZ、gapA序列通過NCBI的Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/)進(jìn)行檢索，用 MEGA 7.0 軟件建樹后進(jìn)行序列同源性分析。

1.6 病理組織切片

取病魚的皮膚、腸道、腎臟及脾臟等病變明顯的組織用4%多聚甲醛固定的組織器官進(jìn)行修剪、脫水、透明、石蠟包埋、修蠟、切片等操作，切好的蠟片進(jìn)行貼片并干燥后，進(jìn)行HE染色，使用二甲苯封片[14]。對病理切片進(jìn)行鏡檢分析。

1.7 藥敏試驗

采用瓊脂紙片擴(kuò)散法（K-B）對病原菌進(jìn)行藥敏試驗[12]。用瓊脂培養(yǎng)基對病菌進(jìn)行復(fù)蘇后制成菌懸液，用無菌棉簽蘸取菌液涂布于BHI固體培養(yǎng)基，然后貼上藥敏紙片(購自溫州市康泰生物科技有限公司)，每個平板貼6片。24 ℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈的直徑，根據(jù)說明書對藥敏試驗結(jié)果敏感性進(jìn)行判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 患病魚臨床癥狀表現(xiàn)

患病魚出現(xiàn)游動緩慢、離群、停止攝食、魚體消瘦、體色暗沉等現(xiàn)象；病魚身體四周出現(xiàn)輕微充血現(xiàn)象，病魚腹部輕微腫脹潰瘍，并伴隨鱗片脫落（圖1A、B），部分病魚腸道脫出肛門并伴隨大量腸道腹水（圖1C）；解剖后可見腸道空乏無食物并伴有大量腹水、腎臟、脾臟出現(xiàn)腫大充血現(xiàn)象（圖1D、E）；部分病魚出現(xiàn)肝臟暗紅出血癥狀（圖1F）。

圖1 患病半滑舌鰨臨床癥狀Fig.1 Clinical symptoms of ill half smooth tongue sole

2.2 病原菌分離及人工感染結(jié)果分析

從病魚的脾臟和腎臟分離出2株優(yōu)勢菌株，分別命名為8-0634、8-0635。細(xì)菌的培養(yǎng)結(jié)果顯示，這2株菌均在2216E培養(yǎng)基上生長，為白色不透明菌落；菌株8-0635在TCBS培養(yǎng)基上生長為黃色、不透明且邊緣完整的圓形菌落（圖2）；菌株8-0634在TCBS培養(yǎng)基上不生長。

圖2 菌株8-0635在TCBS上生長Fig.2 Growth of strain 8-0635 on TCBS media

對2株優(yōu)勢菌分別進(jìn)行人工感染試驗，發(fā)現(xiàn)只有菌株8-0635感染魚后能引起魚類死亡，感染8-0635的半滑舌鰨1周內(nèi)的死亡情況如表2所示，其半數(shù)致死劑量LD50為3.7×105CFU·mL-1。這與之前的患病魚癥狀相似，因此對這株優(yōu)勢菌進(jìn)行鑒定。

表2 半滑舌鰨人工回歸感染結(jié)果Table 2 Results of artificial regression infection of Cynoglossus semilaevis

2.3 革蘭氏染色及生理生化鑒定結(jié)果

菌株8-0635在2216E上生長表現(xiàn)為白色不透明的圓形菌落，邊緣光滑。經(jīng)革蘭氏染色后在鏡下觀察為短桿狀細(xì)菌，兩端鈍圓，菌體大小為1～4 μm（圖3）。

圖3 菌株8-0635革蘭氏染色Fig.3 Gram staining of strain 8-0635

對菌株8-0635分別進(jìn)行了8.5‰和20.0‰NaCl下的生理生化試驗，結(jié)果（表3）顯示與哈維氏弧菌最為接近，依據(jù)《伯杰氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊》[13]選取了3株哈維氏弧菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株與優(yōu)勢菌株8-0635進(jìn)行比對，結(jié)果顯示菌株8-0635雖然與標(biāo)準(zhǔn)菌株的生理生化結(jié)果近似，但仍有差異。

表3 菌株8-0635的主要生理生化指標(biāo)檢測結(jié)果Table 3 Test results of main physiological and biochemical indexes of strain 8-0635

2.4 分子鑒定結(jié)果分析

對菌株8-0635進(jìn)行了分子鑒定，測序結(jié)果與其他9株菌構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)菌株8-0635與8種菌株的序列同源性均較低（圖4），無法區(qū)分該菌株。在此基礎(chǔ)之上，將16S rRNA和3個保守基因（gyrB、ftsZ、gapA）的片段與原菌株基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)菌株8-0635與V.harveyi的同源性較高（圖5），故判斷菌株8-0635為哈維氏弧菌。

圖4 菌株8-0635的16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 16S rRNA phylogenetic tree of strain 8-0635

圖5 菌株8-0635的多位點系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Multi-site phylogenetic tree of strain 8-0635

2.5 病理組織切片分析

依次取發(fā)病的半滑舌鰨的腎臟、脾臟、性腺及腸道切片觀察。腎臟組織的結(jié)構(gòu)模糊,其細(xì)胞排列不整齊,與哈維氏弧菌感染癥狀一致[15]。腎小管上皮受損嚴(yán)重，表現(xiàn)為上皮脫落，細(xì)胞裂解死亡（圖6A）；脾臟出血嚴(yán)重，血管破裂，血細(xì)胞滲出（圖6B）；病魚的前中后腸均有嚴(yán)重病變，表現(xiàn)為腸黏膜受損脫落，充血嚴(yán)重，伴有血管破損，血液滲出（圖6C）。肌肉受損，表現(xiàn)為肌纖維斷裂（圖6D）。各組織中均有明顯炎細(xì)胞浸潤現(xiàn)象。

圖6 病理組織切片觀察Fig.6 Observation of pathological sections

2.6 藥敏試驗結(jié)果分析

通過對42種抗菌藥物藥敏試驗結(jié)果（表4）顯示，菌株8-0635對頭孢哌酮、氟苯尼考、氯霉素、氨芐西林等16種藥物高度敏感；對紅霉素、克拉霉素、替卡西林、恩諾沙星、卡那霉素等9種藥物中度敏感；對土霉素、四環(huán)素、萘啶酸、萬古霉素、鏈霉素等17種藥物不敏感。

表4 菌株8-0635的藥敏試驗結(jié)果Table 4 Drug sensitivity test results of strain 8-0635

3 討論

本研究生理生化鑒定結(jié)果與Schleifer[7]方法略有不同，很難確定病原菌種類。結(jié)合16S rRNA及系統(tǒng)發(fā)育樹對菌株8-0635進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)菌株8-0635與NCBI上所選取的標(biāo)準(zhǔn)菌株同源性較低。由此可見，隨著弧菌的進(jìn)化和發(fā)展，單純的16S rRNA與生理生化鑒定方法已經(jīng)無法滿足弧菌的準(zhǔn)確鑒定，本研究引入了管家基因[16]進(jìn)行多位點測序（multilocus sequence analysis）。Wan等[17]通過16S rRNA和3種管家基因gyrB、ftsZ、gapA準(zhǔn)確地鑒定出了哈維氏弧菌，因此通過保守的蛋白質(zhì)編碼基因（16S rRNA、gyrB、ftsZ、gapA）能可靠地檢測和鑒定這些物種。經(jīng)多位點測序的方法重新建立的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，菌株8-0635與哈維氏弧菌的同源性較高，故可鑒定菌株8-0635為哈維氏弧菌。

皮膚潰瘍病也被稱為皮膚潰爛病，是水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的常見病，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[18]。崔婧等[4]研究表明，哈維氏弧菌易感染紅鰭笛鯛、珍珠龍膽等，不僅可引起感染對象鱗片脫落、皮膚壞死、肌肉潰爛等嚴(yán)重病灶，而且還會引起病魚的肝臟、脾臟、頭腎等多種內(nèi)臟器官充血、產(chǎn)生白斑等病變；張鳳萍等[19]研究表明，鮸魚感染哈維氏弧菌會表現(xiàn)出厭食、游動遲緩、尾柄和胸鰭基部呈出血性潰瘍。Liu等[20]研究表明，感染哈維氏弧菌的軍曹魚會出現(xiàn)腸胃炎等癥狀。與上述研究一致，本文患病魚體表現(xiàn)為體表皮膚潰爛出血、腹水、眼球突出，食欲不振等癥狀，最終停止攝食導(dǎo)致死亡，經(jīng)鑒定從半滑舌鰨腎臟中分離出的哈維氏弧菌是主要的致病菌，人工感染試驗得出半數(shù)致死量LD50為3.7×105CFU·mL-1，與徐曉麗等[1]從半滑舌鰨所分離菌的半數(shù)致死量（LD50）為7.15×105CFU·mL-1相比較高，可能是不同菌株的毒力不同導(dǎo)致。對感染哈維氏弧菌的半滑舌鰨的肌肉、脾臟、腎臟和腸道的組織切片進(jìn)行觀察，可見各組織間均有大量的炎細(xì)胞浸潤，肌肉表現(xiàn)為肌纖維斷裂，脾臟有血細(xì)胞滲出現(xiàn)象，腎臟病變嚴(yán)重表現(xiàn)為腎小管空腔消失，腎小管上皮受損，細(xì)胞裂解死亡；腸道表現(xiàn)為腸黏膜受損脫落，血管破裂，血細(xì)胞流入間質(zhì)。

感染哈維氏弧菌的魚類疾病多爆發(fā)于每年的5—10月，易發(fā)生在養(yǎng)殖密度較高、水溫較高的魚類之間，多種不同生長時期的魚類都可發(fā)病[4]。研究表明，弧菌病多是通過肌肉受損感染[21]，但由于哈維氏弧菌的致病機(jī)制尚不清楚，還沒有有效的方法來控制其傳播[22]。目前哈維弧菌的防治方法主要有抗生素、中草藥、生物防治和免疫防治等[10]。此外，也可以利用微生物制劑、群感效應(yīng)等手段對其進(jìn)行防治[23]。隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，弧菌病在水體中擴(kuò)散加上我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)給藥合理性的欠缺，抗生素的濫用導(dǎo)致了不同地區(qū)來源的哈維氏弧菌具有豐富的耐藥譜[24]。本研究中半滑舌鰨感染哈維氏弧菌的藥敏試驗顯示，其對頭孢噻吩、頭孢唑酮、阿莫西林、慶大霉素、氟苯尼考等藥物敏感，為該地區(qū)哈維氏弧菌的防治提供了參考。