馬藍， 彭晴， 徐小輕， 楊碩， 張宇微， 田丹丹， 施琳波， 石波， 喬宇

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京100081）

細菌生物被膜是細菌受到環(huán)境壓力如營養(yǎng)缺乏、低pH或抗菌物質(zhì)存在時，黏附在非生物或生物基質(zhì)表面，分泌大量由多糖、蛋白質(zhì)、脂類、核酸等組成的胞外多聚物將菌體包裹在其中而形成的膜狀物[1]。據(jù)統(tǒng)計，80%以上的細菌感染都與生物被膜的形成有關(guān)[2]。生物被膜對細菌有保護作用，使細菌免受抗生素以及宿主防御系統(tǒng)的攻擊。持留菌是對抗生素耐受的細胞亞群[3]，生物被膜中存在少部分持留菌也會引起抗生素的失效[4]。分泌生物被膜的致病菌對抗生素的耐受性可以提高10～1 000倍，且對宿主免疫防御的抗性也增強數(shù)倍[5]，致使許多細菌感染難以得到控制，嚴(yán)重威脅食品安全和人類健康。

細菌生物被膜的形成過程是細菌從浮游狀態(tài)向多細胞聚集的微生物群落狀態(tài)轉(zhuǎn)變的過程。在營養(yǎng)充足的液體培養(yǎng)基中，細菌以單細胞浮游狀態(tài)生存；當(dāng)營養(yǎng)耗盡時，細菌生長進入靜止期，鞭毛驅(qū)動的運動和趨化力幫助細菌細胞選擇最有利的生態(tài)位，黏附在基質(zhì)表面形成生物被膜[6]。細菌最初通過細胞表面結(jié)構(gòu)（如菌毛、鞭毛、卷曲纖維和表面蛋白）黏附到生物或非生物基質(zhì)表面，移動性減弱進而以表面附著的形式發(fā)生細胞分裂，與胞外大分子形成微菌落并最終形成成熟的生物被膜[7]。黏附是生物被膜形成的關(guān)鍵步驟，細菌能同時表達多種黏附素，黏附素聚集在細絲狀的菌毛細胞器上。不同黏附素賦予細菌表面不同的特性，以識別不同的生物（組織、細胞等）或非生物基質(zhì)（玻璃、塑料等）表面。表面附著的細菌微菌落擴展成高度組織的群體結(jié)構(gòu)受多因素影響，涉及細胞間的群體感應(yīng)、細菌運動性（朝營養(yǎng)豐富的區(qū)域移動）以及物質(zhì)能量代謝（適應(yīng)多細胞共生方式、產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物）等多種生理代謝活動的改變[8]。

不同細菌形成生物被膜的機制各不相同，通常取決于環(huán)境條件和特定的菌株屬性[4]。了解細菌在生物被膜狀態(tài)下特異表達的基因?qū)τ诮沂炯毦诓煌h(huán)境中生物被膜形成的分子機制至關(guān)重要。腸出血性大腸桿菌（enterohemorrhagicEscherichia coli, EHEC）是人畜共患的病原菌，引發(fā)出血性結(jié)腸炎、溶血性尿毒癥和血栓性血小板減少性紫癜等多種疾病[9]。大腸桿菌作為模式生物，雖然已經(jīng)有很多研究報道了其生物被膜形成的分子機制，大腸桿菌O157∶H7為食源性致病菌，還未對該菌在生物被膜狀態(tài)下基因特異表達的研究。本研究以大腸桿菌O157∶H7為試驗菌株，研究其在生物被膜狀態(tài)和浮游狀態(tài)2種條件下基因表達的差異，通過轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq)以及GO（gene ontology）和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)富集分析，確定生物被膜形成的關(guān)鍵基因和代謝通路，為進一步研究生物被膜形成的分子調(diào)控和病原菌生物被膜的防治提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

大腸桿菌（Escherchia coli）O157∶H7（CICC 10907）購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 菌體培養(yǎng)

將保存在-80 ℃的大腸桿菌O157∶H7于胰酪大豆胨（tryticase soy broth, TSB，海博生物技術(shù)有限公司）固體平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接種于3 mL TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h；再用新鮮的TSB培養(yǎng)基將菌液濃度調(diào)至106CFU·mL-1，按1 mL·孔-1加入聚苯乙烯材質(zhì)的24孔細胞培養(yǎng)板（無錫耐思生命科技股份有限公司，型號702001）中，浮游狀態(tài)（planktonic， PLA）的菌體于37 ℃、100 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)12 h；生物被膜狀態(tài)（biofilm, BIO）的菌體于37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。

1.3 大腸桿菌生物被膜的熒光顯微鏡觀察

吖啶橙熒光染料（北京索萊寶科技有限公司）可嵌入雙鏈DNA的雙鏈堿基對，能結(jié)合到細菌生物被膜的eDNA上，用于細菌生物被膜的定性定量分析[10]。將培養(yǎng)的菌液加入24孔細胞培養(yǎng)板中，將滅菌的矩形蓋玻片（1 cm×1 cm）斜插入24孔板中，大腸桿菌分別在浮游狀態(tài)和生物被膜形成狀態(tài)下培養(yǎng)，培養(yǎng)完成后，取出蓋玻片，用PBS緩沖液小心清洗，蓋玻片上的生物被膜用0.01%吖啶橙溶液染色5 min[11]，熒光顯微鏡（LSM 700，德國蔡司公司）觀察2種生長模式下生物被膜的形成。

1.4 RNA-Seq測序分析

1.4.1 樣品準(zhǔn)備 按1.2的方法培養(yǎng)菌體，菌液經(jīng)8 000 r·min-1離心10 min后，用無菌PBS緩沖液清洗菌體3遍，立即用液氮速凍，放置-80 ℃冰箱，用于RNA-Seq分析，每組設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，分別命名為PLA_1、PLA_2、PLA_3和BIO_1、BIO_2、BIO_3。

1.4.2 建庫測序 采用天根生化科技有限公司的細菌試劑盒DP 430提取大腸桿菌總RNA，去除Total RNA中的核糖體RNA，獲得mRNA。將得到的mRNA隨機打斷成短片段，采用紐英倫生物技術(shù)有限公司的RNA超快速定向文庫制備試劑盒——Illumina，按照鏈特異性建庫的方式建庫。文庫構(gòu)建完成后，稀釋文庫至1.5 ng·μL-1，把不同文庫按照有效濃度及目標(biāo)下機數(shù)據(jù)量的需求pooling后進行Illumina測序。

1.4.3 差異表達基因比較分析 用DESeq 2軟件分析在不同條件下轉(zhuǎn)錄組的差異表達，找出不同樣本間存在的差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs），計算log2(FoldChange)及其校正后的統(tǒng)計檢驗（Padj值）。本研究以|log2(FoldChange)|≥1、Padj≤0.05作為篩選差異表達基因的閾值。

1.4.4 差異表達基因聚類分析 通過聚類分析發(fā)現(xiàn)基因或樣本間未知的生物學(xué)聯(lián)系和差異。使用R軟件包中的Pheatmap軟件對差異基因進行聚類分析，確定不同生長模式下大腸桿菌轉(zhuǎn)錄本的表達模式。

1.4.5 差異表達基因的GO和KEGG富集分析用Cluster Profiler軟件對差異基因集進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。應(yīng)用超幾何分布計算差異表達基因顯著富集的GO功能條目和KEGG通路，均以Padj≤0.05作為顯著性富集的閾值。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌O157∶H7在浮游狀態(tài)和生物被膜狀態(tài)下的生物被膜形成情況

生物被膜中營養(yǎng)物質(zhì)的擴散速度較慢，形成了細胞代謝不活躍的細菌群落，與細菌生長靜止期的細胞代謝類似[4]。參考Schembri等[8]的研究結(jié)果，將浮游狀態(tài)的大腸桿菌O157∶H7在37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h，菌體OD600nm為1.3時收集細胞，此時細菌處于生長的靜止期；而生物被膜狀態(tài)的大腸桿菌O157∶H7在37 ℃靜置培養(yǎng)，通氣量較浮游狀態(tài)小，生長速率降低，24 h后形成穩(wěn)定的生物被膜，此時處于生物被膜形成初期。

2種狀態(tài)下的大腸桿菌O157∶H7經(jīng)吖啶橙染色后，用熒光顯微鏡觀察（40×），結(jié)果如圖1所示。浮游狀態(tài)的大腸桿菌O157∶H7呈單個細菌形態(tài)，未觀察到胞外生物被膜結(jié)構(gòu)（圖1A）；靜置培養(yǎng)后的大腸桿菌O157∶H7胞外呈現(xiàn)大量不規(guī)則結(jié)構(gòu)，形成明顯的生物被膜（圖1B）。由此可見，在本試驗的培養(yǎng)條件下，大腸桿菌在浮游狀態(tài)下不產(chǎn)生生物被膜，而在靜置培養(yǎng)狀態(tài)下產(chǎn)生大量的生物被膜。

圖1 不同狀態(tài)下的大腸桿菌O157∶H7生物被膜Fig.1 E.coli O157∶H7 biofilm during different growth states

2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

2.2.1 數(shù)據(jù)質(zhì)控 由表1可知，樣品的GC含量為52.73%～52.94%；將有效數(shù)據(jù)和參考基因組比對，比對率均達到93.57%以上，且Q20和Q30均大于94%。綜上所述，轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)控良好，有效數(shù)據(jù)質(zhì)量合格，適合于后續(xù)分析。

表1 RNA-Seq數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 1 RNA-Seq data statistics

2.2.2 基因差異表達分析 與浮游狀態(tài)相比，大腸桿菌O157∶H7在生物被膜形成狀態(tài)下檢測到1 652個顯著的差異表達基因（DEGs），3 642個無差異表達的基因。上調(diào)表達基因821個，占全基因比例15.51%；下調(diào)表達基因831個，占15.70%（圖2）。

圖2 大腸桿菌O157∶H7在浮游狀態(tài)和生物被膜形成狀態(tài)下差異表達基因火山圖Fig.2 Volcano map of DEGs in E.coli O157∶H7 during planktonic growth state and biofilm growth state

2.2.3 差異基因的聚類分析 基于顯著差異表達基因進行聚類分析，結(jié)果（圖3）顯示，生物被膜形成狀態(tài)的大腸桿菌聚為一類，浮游狀態(tài)的大腸桿菌聚為另一類，即不同狀態(tài)的大腸桿菌差異較大，呈現(xiàn)出2種不同的生長模式；而同一狀態(tài)下的3個生物學(xué)重復(fù)間相似性較高。

圖3 大腸桿菌O157∶H7在浮游狀態(tài)和生物被膜形成狀態(tài)下差異表達基因聚類分析Fig.3 Cluster analysis of DEGs in E.coli O157∶H7 during planktonic growth state and biofilm growth state

2.2.4 GO功能注釋及富集分析 為明確大腸桿菌O157∶H7在浮游狀態(tài)和生物被膜形成狀態(tài)下差異基因的生物學(xué)功能，對顯著差異表達基因進行GO功能注釋和富集分析，1 652個顯著差異基因中有448個被注釋到GO功能，其中260個與生物過程（biological process，BP）有關(guān)；29個與細胞組成（cellular component，CC）有關(guān)；159個與分子功能（molecular function，MF）有關(guān)。表2列出了前30個富集的GO功能注釋，包括29條BP途徑和1條CC途徑。大腸桿菌O157∶H7在生物被膜形成狀態(tài)下富集的GO功能條目涉及細菌運動、物質(zhì)轉(zhuǎn)運、物質(zhì)代謝等生物過程，除谷氨酸代謝、硫代謝和多生物過程外，其他GO功能條目中的上調(diào)基因數(shù)量均高于下調(diào)基因數(shù)量。移動并黏附至基質(zhì)表面是大腸桿菌生物被膜形成的初始關(guān)鍵步驟[12]，生物被膜狀態(tài)下，上調(diào)的GO途徑中與細菌運動相關(guān)的有7個，其運動方式以鞭毛驅(qū)動為主；生物被膜狀態(tài)下的細菌與浮游生長的靜止期生理狀態(tài)相似，會產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物[4]，但生物被膜狀態(tài)的細菌還需合成生物被膜的組分，包括胞外多糖、蛋白質(zhì)、脂類、核酸等物質(zhì)，因此與單糖及碳水化合物合成和代謝、氨基酸及蛋白質(zhì)合成和代謝、核酸合成和代謝等途徑有關(guān)的基因表達上調(diào)；合成物質(zhì)轉(zhuǎn)運至胞外需要膜轉(zhuǎn)運子，因此與膜離子轉(zhuǎn)運過程相關(guān)的基因表達上調(diào)；細胞的氧化還原途徑參與細胞的呼吸作用，其相關(guān)基因在生物被膜狀態(tài)下表達發(fā)生變化。本試驗還發(fā)現(xiàn)，在生物被膜狀態(tài)下的大腸桿菌O157∶H7硫化合物代謝過程上調(diào)，很多研究也發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象，但具體機制尚不清楚[13]。

2.2.5 KEGG富集分析 利用KEGG數(shù)據(jù)庫對顯著差異基因進行代謝通路分析，結(jié)果（圖4）顯示，上調(diào)的DEGs共注釋到73條通路中，有8條具有顯著性差異，包括與細菌運動相關(guān)的代謝通路是細菌趨化性（bacterial chemotaxis）和鞭毛裝配（flagellar assembly），與細菌氧化還原反應(yīng)相關(guān)的代謝路徑是氧化磷酸化（oxidative phosphorylation），與生物大分子合成相關(guān)的代謝路徑是碳代謝（carbon metabolism）、嘧啶代謝（pyrimidine metabolism）、葉酸及一碳代謝（onecarbon pool by folate）和半胱氨酸及甲硫氨酸代謝（cysteine and methionine metabolism），與生物被膜合成調(diào)控相關(guān)的是雙組分系統(tǒng)（two-component system）；表達下調(diào)的DEGs共注釋到60條通路，有4條具有顯著性差異。生物被膜狀態(tài)下，ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)（ABC transporters）基因下調(diào)，離子型跨膜轉(zhuǎn)運系統(tǒng)基因上調(diào)，即細菌的膜轉(zhuǎn)運過程由耗能的ABC轉(zhuǎn)運轉(zhuǎn)變?yōu)殡x子型跨膜轉(zhuǎn)運；賴氨酸降解（lysine degradation）、精氨酸和脯氨酸代謝（arginine and proline metabolism）和不同環(huán)境中的微生物代謝（microbial metabolism in diverse environments）相關(guān)基因下調(diào)，以適應(yīng)生物被膜狀態(tài)下的營養(yǎng)及合成生物大分子的需要。

圖4 大腸桿菌O157：H7在浮游狀態(tài)和生物被膜形成狀態(tài)下差異表達基因KEGG富集分析Fig.4 KEGG enrichment analysis of DEGs in E.coli O157：H7 during planktonic growth state and biofilm growth state

2.2.6 差異表達基因分類及注釋 將大腸桿菌在生物被膜形成狀態(tài)和浮游狀態(tài)下表達水平發(fā)生改變的基因參照KEGG網(wǎng)站進行分類和功能說明，結(jié)果如表3所示。

表3 大腸桿菌O157：H7浮游狀態(tài)和生物被膜形成狀態(tài)表達水平發(fā)生改變的基因Table 3DEGs in E.coli O157：H7during planktonic growth state and biofilmgrowthstate

趨化性是細菌調(diào)控并對外界環(huán)境做出反應(yīng)的感受系統(tǒng)之一，細菌利用復(fù)雜有序的趨化系統(tǒng)趨向有利條件，增加對環(huán)境的適應(yīng)性。生物被膜形成過程伴隨著細菌趨化性的增加。KEGG途徑富集的細菌趨化性基因共15個，基因表達水平均為上調(diào)，包括趨化受體基因mglB、tar、tap、aer以及趨化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因cheA、cheR、cheW、cheY、cheB（表3）。趨化反應(yīng)通過處于細胞兩極的受體復(fù)合體和隨機分布于細胞四周或埋于細胞膜中的鞭毛-馬達復(fù)合體調(diào)節(jié)甲基趨化受體蛋白（methylaccepting chemotaxis proteins， MCPs）感知刺激物（或環(huán)境）信號，信號通過組氨酸激酶CheA和CheY傳遞給鞭毛馬達。CheA可發(fā)生自身磷酸化，并將高能磷酸基團傳遞給CheA的同源應(yīng)答調(diào)控分子CheY，磷酸化的CheY與鞭毛馬達蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)鞭毛的旋轉(zhuǎn)方向。磷酸化的CheA同時調(diào)節(jié)甲基酯酶CheB的磷酸化，磷酸化的CheB和甲基轉(zhuǎn)移酶CheR分別調(diào)節(jié)MCPs的去甲基化和甲基化，使細菌適應(yīng)環(huán)境，做出運動改變[14-15]。

具有運動性的細菌可以通過趨化過程感知環(huán)境，移向更利于其生長的基質(zhì)表面，細菌的運動主要由鞭毛驅(qū)動。2種狀態(tài)下，與鞭毛組裝有關(guān)的差異基因共26個，在生物被膜形成階段表達水平上調(diào)的基因共23個，包括基底蛋白基因（fliA、fliG、fliS）、棒狀蛋白基因（flgB、flgC、flgD、flgE、flgF、flgG、flgK、flgL）、絲狀帽蓋基因（fliD、fliT）、開關(guān)基因（motA、motB）和調(diào)節(jié)基因（motA、flgM、flgN、rpoD、flhC）。生物被膜狀態(tài)下菌體鞭毛運動性增強，是其趨化作用的結(jié)果，磷酸化的CheY能與鞭毛馬達相互作用，增加鞭毛旋轉(zhuǎn)方向逆轉(zhuǎn)的頻率，導(dǎo)致菌體的翻滾，從而游動方向發(fā)生改變[14]。

雙組分系統(tǒng)是由組氨酸和天門冬氨酸磷酸化組成的信號系統(tǒng)，是原核細胞中重要的表達調(diào)控系統(tǒng)，是細菌感受和應(yīng)答外界信號的基礎(chǔ)，也是調(diào)控生物膜主要因素。雙組分調(diào)控系統(tǒng)中差異表達基因共80個，其中上調(diào)表達基因56個，下調(diào)表達基因24個。上調(diào)基因主要為感應(yīng)碳源、氮源、磷源及金屬離子含量變化的調(diào)控基因phoP/phoQ、narP/narQ、glnA/glnL、rcsF、basR、maeA和感應(yīng)環(huán)境因素，如滲透壓、蛋白折疊錯誤的調(diào)控基因envZ/ompF、rstB、cpxA等。在生物被膜形成過程中，營養(yǎng)物質(zhì)缺乏以及環(huán)境壓力脅迫致使細菌多個感應(yīng)環(huán)境因素的雙組分調(diào)控蛋白表達上調(diào)，這些基因的上調(diào)是細菌響應(yīng)環(huán)境壓力，從浮游狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樯锉荒顟B(tài)的信號分子。

細胞膜將細胞和亞細胞成分與外界環(huán)境隔離開，細胞生存需要特異的分子物質(zhì)選擇性地穿過膜成分。物質(zhì)穿越細胞膜的運動通過轉(zhuǎn)運體的特化膜蛋白實現(xiàn)。ABC轉(zhuǎn)運體是轉(zhuǎn)運體蛋白中最主要的種類之一，能夠通過ATP的結(jié)合與水解實現(xiàn)多種底物穿越細胞膜[16]。大腸桿菌O157∶H7在2種生長狀態(tài)下，ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)中差異表達基因共62個，其中在生物被膜狀態(tài)下上調(diào)表達基因16個，下調(diào)表達基因46個。下調(diào)基因編碼的轉(zhuǎn)運子包括運輸小分子和有機物（ugpE、gpB、ysT、potF、araH）、金屬離子和維生素B12（fepD、fhuB）和磷酸和氨基酸（pstS、phnC、artP、gltK）等（表3）。一方面可能是在生物被膜狀態(tài)下，有機物、金屬離子和維生素等物質(zhì)運輸減少；另一方面可能是細胞為了節(jié)省能量，下調(diào)耗能的ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，以適應(yīng)生物被膜狀態(tài)下細胞的能量需要。

生物被膜的形成伴隨物質(zhì)代謝途徑的改變，處于生物被膜狀態(tài)下的大腸桿菌O157∶H7在碳代謝、氮代謝、氨基酸代謝、核酸代謝、脂肪酸代謝以及能量產(chǎn)生途徑都發(fā)生了變化（表3）。在形成生物被膜過程中，菌體由于趨化運動移向基質(zhì)表面，并以聚集方式生長，分泌胞外多聚物直至成熟生物被膜的形成，每個步驟都涉及物質(zhì)代謝和能量代謝，細胞內(nèi)的代謝流也朝著適應(yīng)多細胞共生方式、產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物如胞外多糖、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等方向轉(zhuǎn)變。

3 討論

生物被膜使細菌能夠有效抵御不良環(huán)境及抗菌藥物的滲透，并加強細菌內(nèi)部間的信息交流、代謝交換和基因傳遞等[17]，使細菌耐藥性增強[18]，但是目前對于生物被膜的形成機理和分子調(diào)控機制研究仍不夠深入。解析致病菌生物被膜形成的關(guān)鍵基因及調(diào)控通路，為防治致病菌生物被膜形成提供了新的思路。

生物被膜內(nèi)表層菌易于獲得營養(yǎng)，代謝活躍；而內(nèi)層菌缺乏氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)，代謝處于休眠狀態(tài)，因此生物被膜內(nèi)細菌具有異質(zhì)性[19]。Schembri等[8]研究表明，浮游細菌在對數(shù)生長期、穩(wěn)定期以及在生物被膜形成初期和后期，基因表達都存在差異，一些基因的表達與特定的生長階段相關(guān)。因此，本研究比較了大腸桿菌O157∶H7處于穩(wěn)定期的浮游態(tài)和處于生物被膜形成初期2個特定階段的基因表達差異，但整個浮游狀態(tài)和生物被膜形成狀態(tài)需進一步研究。

本研究在2種不同狀態(tài)下的大腸桿菌中共檢測到1 652個存在顯著差異的表達基因，占全部基因的31.21%，而Schembri等[8]報道大腸桿菌K-12在生物被膜階段差異表達的基因僅占13.55%，這可能是兩者的試驗方法和統(tǒng)計方式不同造成。在生物被膜形成初期，很多基因瞬時表達在細菌從浮游狀態(tài)向生物被膜形成狀態(tài)發(fā)揮作用；而在生物被膜成熟階段，這些基因的表達水平不再上升，甚至在生物被膜形成后期表達的基因數(shù)量少于前期[7]。Whiteley等[20]研究表明，形成生物被膜6 d后的銅綠假單胞菌與浮游細菌態(tài)間的差異表達基因約1%。

細菌從浮游狀態(tài)到固體表面黏附轉(zhuǎn)變通常與細胞表面結(jié)構(gòu)如鞭毛、菌毛、卷曲纖維、胞外多糖和表面蛋白相關(guān)[21]。不同株系的大腸桿菌參與生物被膜形成的表面結(jié)構(gòu)不同，調(diào)控生物被膜形成的信號分子及信號傳導(dǎo)途徑可能也存在差別。大腸桿菌K-12表面結(jié)構(gòu)Ag43的編碼基因flu在生物被膜階段表達上調(diào)[8]。而本試驗未發(fā)現(xiàn)flu基因表達水平在大腸桿菌O157∶H7生物被膜中發(fā)生變化。Hancock等[22]發(fā)現(xiàn)，引起尿路感染的大腸桿菌83972和大腸桿菌VR50在生物被膜形成過程中未檢測到flu基因表達變化，但VR50的Ⅰ型菌毛編碼基因fimBDFGH下調(diào)2.2～9.3倍。細菌趨化性是指有運動能力的細菌對胞外物質(zhì)含量改變作出的反應(yīng)，使細菌趨向有益刺激、逃避有害刺激的定向運動[23]，主要由鞭毛驅(qū)動[24]。趨化性在生物膜的形成過程中發(fā)揮重要作用[25-26]。細菌通過趨化作用感知環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)，通過鞭毛、菌毛黏附在基質(zhì)表面，使細菌沿著基質(zhì)表面生長和定植，最終形成生物被膜。本研究發(fā)現(xiàn)，生物被膜狀態(tài)下細菌趨化性基因和鞭毛組裝相關(guān)基因的表達水平均上調(diào)。

細菌生物被膜形成是個復(fù)雜的過程，涉及多種營養(yǎng)物質(zhì)及環(huán)境因子的調(diào)控。雙組分系統(tǒng)（two-component system, TCS）是細菌感應(yīng)外界復(fù)雜環(huán)境，并將其轉(zhuǎn)換為信號分子傳遞給細胞的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)[27]，是細菌中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的最普遍形式。典型的TCS由位于跨膜區(qū)作為傳感器的組氨酸蛋白激酶（histidine kinase, HK）和相應(yīng)的位于細胞質(zhì)的反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白（response regulator, RR）組成，其可以感應(yīng)外界環(huán)境變化，如養(yǎng)分、滲透壓等，通過雙組分蛋白的磷酸化和去磷酸化調(diào)節(jié)細胞信號傳導(dǎo)途徑，從而調(diào)控細菌的生理代謝、壓力應(yīng)激等過程[28-29]。研究表明，雙組分系統(tǒng)參與生物被膜形成的調(diào)控，envZ/ompR識別滲透壓變化信號，rscC/rcsD/rcsB激活莢膜異多糖酸的生物合成，cheA/cheY/cheB控制鞭毛運動旋轉(zhuǎn)的方向，qseC/qseB將群體感應(yīng)與運動、生物被膜發(fā)育和毒性聯(lián)系起來[30]。Schembri等[8]發(fā)現(xiàn)大腸桿菌K-12生物被膜狀態(tài)下群體感應(yīng)密度信號luxS和全局調(diào)控因子rpoS上調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌O157∶H7在生物被膜形成狀態(tài)下，envZ/ompF和cheA/cheY/cheB基因顯著上調(diào)，感應(yīng)營養(yǎng)物質(zhì)和環(huán)境因子變化的多個雙組分調(diào)控基因表達上調(diào)，但與群體感應(yīng)相關(guān)調(diào)控因子luxS及全局性調(diào)控因子rpoS未發(fā)現(xiàn)顯著的上調(diào)。

細菌的趨化、轉(zhuǎn)運和代謝之間有內(nèi)在聯(lián)系[31]。細菌生物被膜的形成伴隨著一系列的物質(zhì)和能量代謝改變。分析大腸桿菌K-12生物被膜和浮游態(tài)靜止期的基因表達差異，發(fā)現(xiàn)氨基酸生物合成、輔因子生物合成、糖代謝、能量代謝、核酸生物合成和代謝、轉(zhuǎn)錄修飾和轉(zhuǎn)運蛋白等代謝途徑在生物被膜階段發(fā)生變化[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，生物被膜和浮游態(tài)間發(fā)生改變的代謝途徑主要有碳代謝、氮代謝、核酸代謝、氨基酸代謝、脂肪酸代謝和能量產(chǎn)生等，與前人結(jié)果存在差異，這可能是由于所用的材料、培養(yǎng)基及形成生物被膜時黏附的基質(zhì)不同。黏附基質(zhì)、生長條件等的差異導(dǎo)致大腸桿菌可能具有不同的生物被膜形成機制。

本研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌O157∶H7在生物被膜形成狀態(tài)下，其趨化性、雙組分系統(tǒng)及物質(zhì)運輸?shù)却x通路的基因表達發(fā)生了顯著變化，推測大腸桿菌O157∶H7生物被膜的形成可能與這些途徑密切相關(guān)。因此，干擾大腸桿菌O157∶H7運動、失活細菌雙組分調(diào)控蛋白或抑制相關(guān)的物質(zhì)能量代謝，有望成為抑制大腸桿菌O157∶H7生物被膜形成的重要途徑。