曾馨瑩，文雪君，郭志德，張現(xiàn)忠

1廈門大學公共衛(wèi)生學院分子影像暨轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究中心 分子疫苗學與分子診斷學國家重點實驗室，福建廈門 361102 2中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院核醫(yī)學科，北京 100730 3中國醫(yī)學科學院臨床醫(yī)學研究所，北京 100730

近10年來，免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint inhibitor，ICI)在腫瘤治療領(lǐng)域取得了重大突破。2011年，第一個靶向細胞毒性T淋巴細胞抗原4(cytotoxic T-lymphocyte antigen 4，CTLA-4)的ICI伊匹單抗(Ipilimumab)獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準用于晚期黑色素瘤的治療，此后多個靶向程序性死亡受體1及其配體(programmed death-1/ligand 1，PD-1/PD-L1)及淋巴細胞激活基因-3(lymphocyte activation gene-3，LAG-3)的ICI陸續(xù)上市[1-2]。雖然ICI在多種轉(zhuǎn)移性、難治性惡性腫瘤中獲得了持久反應(yīng)性，但患者對于ICI單藥的響應(yīng)率僅為20%～40%[3-4]。而ICI治療產(chǎn)生的免疫相關(guān)不良事件及獲得性耐藥均可導致疾病進展[4]，因此，與其他治療方式聯(lián)合成為ICI治療的新方向[2]。

研究表明，外照射放療(external beam radiation therapy，EBRT)可引起腫瘤細胞DNA損傷、信號轉(zhuǎn)導調(diào)節(jié)以及腫瘤免疫微環(huán)境(tumor immune microenvironment，TIME)重塑[5]。EBRT通過均勻的低傳能線密度(linear energy transfer，LET)射線，包括X射線及γ射線(0.2 keV/μm)，以高吸收劑量率(1～2 Gy/min)靶向照射部位[6]，導致腫瘤細胞DNA損傷，激活cGAS-STING-IRF3-Type Ⅰ干擾素(interferon，IFN)信號級聯(lián)反應(yīng)，招募調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells，Tregs)、髓源性抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSC)等免疫抑制細胞，誘導適應(yīng)性免疫反應(yīng)[7-8]，同時引起TIME中PD-L1表達上調(diào)，負性調(diào)節(jié)腫瘤浸潤T細胞引起腫瘤耐藥或復發(fā)[5，9]。因此，多個研究證明了EBRT與ICI的協(xié)同作用[10-11]。Twyman-Saint等[12]發(fā)現(xiàn)，PD-L1抗體的加入可逆轉(zhuǎn)EBRT聯(lián)合CTLA-4抗體引起的T細胞耗竭，增加黑色素瘤對聯(lián)合治療的響應(yīng)率。然而EBRT作為一種局部治療方式，即便通過免疫介導引起“遠隔效應(yīng)”，也僅有少數(shù)患者能因此獲益[13-14]。

靶向放射性核素治療(targeted radionuclide therapy，TRT)是一種內(nèi)放射治療，其中放射性藥物通過全身給藥特異性定位于靶點，向腫瘤傳遞細胞毒性輻射。TRT以低吸收劑量率(<1 Gy/h)長時間照射靶部位，射線的類型與放射性核素有關(guān)，包括α、β粒子及俄歇電子。LET及最大穿透深度也與核素衰變類型相關(guān)，α粒子具有較高的LET(50～230 keV/μm)和較小的穿透深度(50～100 μm)；β粒子則具有更低的LET(0.2 keV/μm)和幾十至數(shù)百個細胞(mm級別)的穿透距離；俄歇電子的LET為4～25 keV/μm，組織穿透最大深度<1 μm[6]。因此，EBRT對于TIME的調(diào)節(jié)作用不能簡單地外推至TRT[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)，高劑量TRT誘導DNA雙鏈斷裂，可上調(diào)膜聯(lián)蛋白A1及鈣網(wǎng)蛋白[17]，激活Ⅰ型IFN，其幅度和時間過程與EBRT相當，而低劑量的TRT則表現(xiàn)出明顯的免疫調(diào)節(jié)作用，包括促炎細胞因子及細胞毒性T細胞(cytotoxic T lymphocytes，CTLs)的浸潤[18-19]。然而，EBRT通過同源重組、非同源末端連接及堿基切除修復誘導DNA雙鏈修復，TRT卻通過跨損傷合成修復受損的DNA[20]。同時，Grzmil等[20]通過蛋白質(zhì)組學研究發(fā)現(xiàn)，EBRT與TRT誘導了不同信號通路的激活，TRT主要影響表皮生長因子受體、絲裂原活化蛋白激酶、整合素和雌激素受體的信號轉(zhuǎn)導。

本文將聚焦于該領(lǐng)域最新研究進展，對TRT聯(lián)合PD-L1抗體治療的模式及其機制進行綜述，以期指導臨床實踐。

1 靶向治療放射性藥物聯(lián)合ICI治療

1.1 β核素放射性藥物聯(lián)合ICI治療

1.1.1 碘[131I]

131I衰變發(fā)射β粒子及γ光子，是最早用于TRT的放射性核素。Rouanet等[17]比較了131I-ICF01012與ICI的不同組合方案，發(fā)現(xiàn)無論是否加入PD-1/PD-L1抗體，對于治療效果均無顯著影響，但觀察到了TRT聯(lián)合CTLA-4抗體后T細胞衰竭相關(guān)基因CD274、LAG3和Eomes增加。而131I-MnO2-BSA作為一種放射增敏劑，可改善腫瘤乏氧，誘導腫瘤細胞免疫原性死亡，上調(diào)PD-L1的表達，抑制原發(fā)及轉(zhuǎn)移瘤的生長[21]。

1.1.2 釔[90Y]

90Y具有純β發(fā)射、能量強、半衰期短的特點，在Patel等[19]的研究中，發(fā)現(xiàn)中等劑量的EBRT與低劑量90Y-NM600(1.85 MBq)對于提高ICI療效的作用是互補的。具體來說，聯(lián)合治療增加了總免疫細胞、CTLs、效應(yīng)記憶T細胞(effector memory T cell，TEM)和γδ T細胞的數(shù)量，進而增加IFN-γ分泌，起到緩解腫瘤負擔及減少自發(fā)轉(zhuǎn)移的作用，聯(lián)合中等劑量EBRT誘導遠隔效應(yīng)，可進一步緩解原發(fā)及轉(zhuǎn)移瘤負擔[19]。另有研究將此策略應(yīng)用于Lewis肺癌模型治療，僅用EBRT聯(lián)合CTLA-4抗體治療能夠減少腫瘤轉(zhuǎn)移，但在聯(lián)合了90Y-NM600治療后，能達到腫瘤完全緩解并誘導免疫記憶[22]。但Potluri等[23]研究發(fā)現(xiàn)，90Y-NM600聯(lián)合PD-1抗體治療對前列腺癌無效，其原因是PD-1抗體激活了Tregs，從而可導致免疫抑制。

1.1.3 镥[177Lu]

177Lu是最常用的TRT核素，其標記的探針177Lu-DOTATATE[24]和177Lu-PSMA-617[25]已獲得美國FDA批準分別用于神經(jīng)內(nèi)分泌瘤及轉(zhuǎn)移性去勢抵抗性前列腺癌(metastatic castration-resistant prostate cancer，mCRPC)。其中177Lu-DOTATATE聯(lián)合納武單抗(Nivolumab)的Ⅰ期臨床試驗證明了其安全性，在晚期神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤及廣泛期小細胞肺癌中顯示出抗腫瘤效果，總緩解率為14.3%(NCT03325816)[26]。177Lu-DOTATATE與伊匹單抗、納武單抗聯(lián)合使用在轉(zhuǎn)移性Merkel細胞癌[27]、侵襲性垂體瘤患者[28]中能夠安全且有效地緩解腫瘤進展。目前仍有幾項177Lu-DOTATATE聯(lián)合PD-1/PD-L1抗體治療多種惡性腫瘤的臨床試驗(NCT04261855，NCT03457948，NCT05583708，NCT05142696，NCT04525638)正在進行中。

Prasad 等[29]在帕博利珠單抗(Pembrolizumab)或奧拉帕尼(olaparib)治療無效的前列腺癌患者中，聯(lián)合使用177Lu-PSMA-617治療后前列腺特異性抗原水平趨于穩(wěn)定。目前聯(lián)合177Lu-PSMA-617及ICI用于mCRPC患者治療的多項臨床試驗(NCT03805594，NCT03658447，NCT05150236)正在開展中。

Chen等[30]用177Lu-EB-RGD聯(lián)合多劑量PD-L1抗體在鼠結(jié)直腸癌模型中誘導CD8+T細胞浸潤，顯著抑制了腫瘤生長，且提出TRT與ICI的給藥時間窗對于治療效果至關(guān)重要的觀點。在此基礎(chǔ)上，本研究團隊進一步探索了177Lu-DOTA-EB-cRGDfK(177Lu-DER)聯(lián)合治療的給藥策略，在體內(nèi)外證明了放射性核素刺激后PD-L1表達呈時間及劑量依賴性上調(diào)，在TRT后4 h通過尾靜脈注射PD-L1抗體能夠大大提高聯(lián)合治療的療效，聯(lián)合治療組小鼠血清促炎細胞因子、CTLs及CD4+輔助T細胞(helper T cells，Th1)浸潤增加，腫瘤完全緩解并獲得特異性免疫記憶效應(yīng)[31]。隨后用64Cu-DOTA-EB-cRGDfK(64Cu-DER)驗證了該給藥策略的有效性，提示該策略可推廣至不同的放射性核素標記的探針中[32]。

此外，177Lu-DOTA-Folate[33]、177Lu-DOTA-Y003[34]、177Lu-h8C3[35]、177Lu-LLP2A[36]及177Lu-DNP-DOTA-BSA[37]聯(lián)合ICI治療均可抑制腫瘤生長并延長荷瘤小鼠生存期。

1.2 α核素放射性藥物聯(lián)合ICI治療

1.2.1 錒[225Ac]

由于α射線獨特的優(yōu)勢，包括能量高、射程短、能夠誘導DNA雙鏈不可修復的斷裂等[38]，α-TRT成為新的研究熱點。與β-TRT相比，α-TRT劑量極低，225Ac-PSMA-617(30 kBq)聯(lián)合PD-1抗體在RM1-PGLS模型中能夠抑制腫瘤生長，達到部分完全緩解[39]。然而225Ac-DOTA-anti-PD-L1 Ab (14.8 kBq)聯(lián)合PD-L1抗體(322 μg)同時給藥卻降低了小鼠的生存率[40]。

1999年，第一代BMW X5正式與公眾見面。出色的外形與先進的車輛配置讓第一代X5成為了豪華運動型多功能車（SAV）細分市場的開辟者和領(lǐng)導者，人們第一次意識到，原來運動也可以與體型龐大的全輪驅(qū)動車型緊密聯(lián)系在一起。強大的產(chǎn)品性能和品牌魅力是BMW X5贏得消費者青睞的根本，三代車型用超過210萬輛的總銷量證明了自己雄厚的實力。在剛剛結(jié)束的第18屆廣州車展上，全面升級的第四代車型正式來到了中國消費者身邊。這一次，BMW希望用全新X5彰顯SAV車型的設(shè)計初衷：引人注目的越野性能，在崎嶇地形中的可靠表現(xiàn)，BMW的豪華特色以及標志性動態(tài)性能。

1.2.2 砹[211At]

多聚ADP核糖聚合酶靶向的探針211At-MM4導致的DNA損傷，激活了先天免疫反應(yīng)，CD4+、CD8+T細胞及巨噬細胞浸潤增加，聯(lián)合PD-1抗體治療U87MG腦膠質(zhì)瘤模型達到了完全緩解，65 d無進展[41]。Zhang等[42]開發(fā)的基于錳基納米的放射免疫治療促進劑211At-ATE-MnO2-BSA，聯(lián)合了α-TRT、化學動力治療及PD-L1抗體治療。研究發(fā)現(xiàn)，211At-ATE-MnO2-BSA激活了樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)，與PD-L1抗體聯(lián)合使用可進一步增加CTLs、促炎細胞因子及 TEM浸潤，有效抑制了腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移及復發(fā)[42]。

1.2.3 鐳[223Ra]

二氯化鐳(Xofigo，223RaCl2)經(jīng)美國FDA批準已用于治療mCRPC的骨轉(zhuǎn)移，223Ra處理后促進了CTLs的殺傷作用，增加了主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)-Ⅰ和鈣網(wǎng)蛋白的表達[43]。在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)223Ra治療的患者免疫抑制性T細胞(表達TIM-3、PD-L1和PD-1)比例增加，同時Tregs及MDSC浸潤增加，聯(lián)合PD-L1抗體能夠改善治療效果[44-45]。在一項Ⅰb期臨床研究(NCT02814669)中，評估了223Ra聯(lián)合阿替利珠單抗(Atezolizumab)在mCRPC患者中的安全性和有效性，但聯(lián)合治療并未表現(xiàn)出更好的療效，所有治療組的中位總生存期為16.3個月，中位無進展生存期為3個月，但卻增加了治療相關(guān)毒性[46]。同時研究也發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生治療相關(guān)不良反應(yīng)主要與阿替利珠單抗有關(guān)，因此目前正在進行的其他臨床研究將Xofigo與帕博利珠單抗(NCT03996473)、納武單抗(NCT04109729)或阿維單抗(NCT04071236)聯(lián)合使用，用于晚期前列腺癌及非小細胞肺癌的骨轉(zhuǎn)移治療。

1.2.4 其他α核素

聯(lián)合治療的給藥策略也是影響療效的重要因素，劑量分割是提高EBRT聯(lián)合ICI的常見方案，而對于α-TRT，一次給藥效果優(yōu)于多次給藥。212Pb-VMT01聯(lián)合CTLA-4及PD-1抗體治療后，43%的腫瘤完全緩解，而接受多次給藥方案的腫瘤最終發(fā)生進展[47]。

Nosanchuk等[48]則發(fā)現(xiàn)，基于213Bi的α-TRT與聯(lián)合CTLA-4抗體的治療效果無差異。213Bi的免疫調(diào)節(jié)作用依賴于損傷相關(guān)的分子模式(damage associa-ted molecular patterns，DAMPs)的釋放并激活DCs，治療后腫瘤組織Tregs下調(diào)，白細胞介素(interleukin，IL)-2、趨化因子C-C-基元配體 (chemokine C-C-motif ligand，CCL)-5及IFN-γ短暫上調(diào)，產(chǎn)生腫瘤殺傷作用[49-50]。

2 靶向診斷放射性藥物聯(lián)合ICI治療

據(jù)文獻報道，高劑量的經(jīng)典診斷探針2-[18F]FDG (74-148 MBq)治療可抑制腫瘤生長并適度延長生存期，提示診斷核素在腫瘤治療中具有較大潛力[53-55]。如圖1所示，本研究團隊創(chuàng)新性地采用2-[18F]FDG聯(lián)合PD-L1抗體治療荷瘤小鼠，以靜脈注射37 MBq或18.5 MBq 2-[18F]FDG后4 h聯(lián)合400 μg PD-L1抗體治療為一個療程，兩個療程后(d0及d4)部分腫瘤完全緩解(5/8或4/8)，且治愈后再次接種腫瘤細胞未發(fā)現(xiàn)腫瘤生長[56]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合治療組小鼠脾臟內(nèi)的TEM(CD8+/CD4+CD44highCD62Llow)維持在較高水平，提示小鼠有免疫記憶產(chǎn)生；在治療過程中，血清中促炎細胞因子IFN-γ、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α及IL-6，TIME中Th1及CTLs于7 d內(nèi)維持在較高水平，而單獨2-[18F]FDG或PD-L1治療組的細胞因子水平和CTLs水平輕度增高并于7 d內(nèi)耗竭。Tregs(CD45+CD4+FOXP3+)、M2型巨噬細胞(CD206+F4/80+)及MDSC(CD45+CD11b+Gr-1+)僅在聯(lián)合治療組中下降，M1型巨噬細胞(iNOS+F4/80+)和DCs(CD80+CD86+)則顯著上調(diào)。以上發(fā)現(xiàn)提示聯(lián)合治療對TIME的調(diào)控作用，相比于單獨治療組，聯(lián)合治療不僅更大程度地激活了小鼠的適應(yīng)性免疫，還降低了免疫抑制性細胞水平，改善了免疫治療的耐藥性。

圖1 2-[18F]FDG聯(lián)合PD-L1 ICI治療可顯著延緩腫瘤生長，提高荷瘤小鼠總生存期

本課題組進一步探究了2-[18F]FDG的免疫調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)2-[18F]FDG在體外可導致DNA損傷，但仍保持復制及自我修復能力(圖2A，2B)。同時，2-[18F]FDG通過激活NF-κB P65通路，與IRF3相互作用，促進PD-L1的轉(zhuǎn)錄，在體外呈時間及劑量依賴性上調(diào)；進一步研究發(fā)現(xiàn)，STAT1、STAT3和IRF1的敲低影響NF-κB P65的磷酸化(圖2C，2D及圖3)，因此PD-L1的上調(diào)也受STAT1/3-IRF1通路調(diào)控[56]。

圖2 2-[18F]FDG誘導的PD-L1上調(diào)通過NF-κB/IRF3途徑介導

圖3 2-[18F]FDG誘導的PD-L1上調(diào)與經(jīng)典STAT1/3-IRF1通路相關(guān)

本課題組亦探索了純發(fā)射γ射線的核素99mTc標記的RGD對TIME的調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)同2-[18F]FDG一樣，99mTc刺激PD-L1在多種腫瘤細胞系中上調(diào)。隨后比較了不同聯(lián)合治療方案的療效，發(fā)現(xiàn)18.5 MBq或37 MBq99mTc-RGD聯(lián)合400 μg PD-L1抗體在4 h時間窗給藥效果最佳，部分小鼠的腫瘤完全治愈(6/8)且90 d內(nèi)無復發(fā)[57]。

3 小結(jié)與展望

總結(jié)近5年發(fā)表的放射性藥物聯(lián)合ICI協(xié)同抗腫瘤治療的臨床前研究發(fā)現(xiàn)，該類研究主要圍繞治療核素展開，包括經(jīng)典的β核素(177Lu、90Y)以及α核素(211At、225Ac)等(表1)。TRT上調(diào)了PD-L1表達，增加CTLs及Th1細胞浸潤，為后續(xù)ICI治療提供了免疫原性微環(huán)境。聯(lián)合治療可進一步調(diào)控TIME，增加促炎細胞因子、TEM、M1巨噬細胞等浸潤，下調(diào)Tregs及MDSC，有效抑制腫瘤生長，延長生存期，產(chǎn)生免疫記憶效應(yīng)，部分研究甚至達到完全緩解。然而，也有研究指出，聯(lián)合治療未能正向調(diào)控TIME，未能提高TRT的療效[23，35，48]。

表1 近5年發(fā)表的放射性藥物聯(lián)合ICI治療的臨床前研究

本團隊既往研究發(fā)現(xiàn)，131I刺激了腫瘤細胞PD-L1表達呈時間及劑量依賴性上調(diào)[58]。故在此基礎(chǔ)上，進一步選用β核素177Lu及64Cu進行探索，發(fā)現(xiàn)64Cu不僅可用于診斷，還具有治療潛力[59]，用64Cu-DER聯(lián)合PD-L1抗體的協(xié)同抗腫瘤治療大大提升了64Cu-TRT的療效[32]。此外，基于2-[18F]FDG的相關(guān)研究結(jié)果[53-55]，本研究團隊發(fā)現(xiàn)，2-[18F]FDG誘導PD-L1的表達上調(diào)由NF-κB/IRF3和STAT1/3-IRF1信號通路介導，與DNA損傷通路激活有關(guān)，且放射性刺激與PD-L1抗體的給藥時間窗對于治療效果至關(guān)重要。在2-[18F]FDG刺激下，PD-L1上調(diào)需要一定時間，而18F半衰期短，難以長時間誘導PD-L1上調(diào)，因此4 h的時間窗最為合適[56]。

綜上所述，診斷放射性藥物聯(lián)合PD-L1抗體的免疫治療新范式可以調(diào)控TIME，顯著提高療效。與TRT相比，診斷放射性藥物具有多種優(yōu)勢，包括可及性高，制備簡單及血液毒性小等，如能將診斷性核素標記的PET/SPECT示蹤劑應(yīng)用于腫瘤聯(lián)合治療，將極大拓寬其應(yīng)用范圍，改善現(xiàn)有治療性核素產(chǎn)量有限，特別是我國目前嚴重依賴進口的現(xiàn)狀，拓展傳統(tǒng)的腫瘤治療模式。因此，未來研究中應(yīng)進一步拓展診斷放射性藥物聯(lián)合免疫治療的組合，探索不同核素對腫瘤細胞及微環(huán)境中其他細胞的影響，促進此種治療新范式的臨床轉(zhuǎn)化。

作者貢獻：曾馨瑩、文雪君負責文獻檢索、 論文撰寫及修訂；郭志德、 張現(xiàn)忠負責論文選題和審校。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突