張 虹，徐 進，魏開金，徐 濱，王 丹

(1.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物多樣性保護重點實驗室，武漢 430223)

米爾伊麗莎白菌(Elizabethkingiamiricola)是牛蛙(Lithobatescatebianus)、虎紋蛙(Hoplobatrachuschinensis)、黑斑蛙(Pelophylaxnigromaculatus)、棘胸蛙(Quasipaaspinosa)和棘腹蛙(Quasipaaboulengeri)等[1]蛙類腦膜炎病(俗稱“歪頭病”)的病原，該病發(fā)病廣泛、致死率高，已成為蛙類養(yǎng)殖過程最難防治、危害最大的疾病。由于蛙血腦屏障的存在，常用抗生素無法進入病灶發(fā)揮抗菌作用[1，2]。同時又存在病原菌抗藥性問題，導致該病的藥物治療效果很差[3，4]。

拮抗菌是目前抑制病原體和控制疾病的新手段[5]，具有維持腸道微生態(tài)平衡，增強宿主免疫力、抵御病原體入侵的作用[6-8]。拮抗菌能通過分泌抗菌物質(zhì)、競爭附著部位、競爭營養(yǎng)、改變病原體的酶活性、免疫刺激功能等方式抑制病原體，同時還能增強宿主腸道消化功能，促進營養(yǎng)吸收利用，提高飼料消化率和飼料利用率[9-11]。目前，水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的拮抗菌有芽孢桿菌、海洋放線菌、乳酸菌等[12，13]，其中，芽孢桿菌作為拮抗菌的一種，能產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都具有很強的抑制能力[14]，部分菌株可產(chǎn)生抗菌肽和抗生素，能直接抑制和殺滅病原菌[15]。芽孢桿菌同時也能有效降低水體硝酸鹽氮、亞硝酸鹽、氨氮含量，凈化水質(zhì)，改善水產(chǎn)養(yǎng)殖動物生存環(huán)境[16]。芽孢桿菌在水環(huán)境調(diào)控和疾病控制方面發(fā)揮越來越重要的作用[17-19]。

本實驗從“稻蛙”養(yǎng)殖的稻田土壤中分離、篩選到一株米爾伊麗莎白菌的拮抗菌X2，對其進行了形態(tài)學和分子生物學鑒定，并對該菌的生長特性及其降氨氮和亞硝酸鹽的作用進行了分析，以期為該拮抗菌的應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

病原菌：米爾伊麗莎白菌(E.miricola)為實驗室從患“歪頭病”的黑斑蛙中分離出來，并在-80 ℃冰箱保存。

腦心浸出液肉湯(BHI)為海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

氨氮培養(yǎng)基[20]配方為葡萄糖3.75 g、(NH4)2SO40.5 g、K2HPO41.0 g、KH2PO40.3 g、MgSO4·7H2O 0.05 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、MnSO4·4H2O 0.01 g、NaCl 5.0 g、1 000 mL蒸餾水，pH7.0。

亞硝酸鹽培養(yǎng)基[20]配方為葡萄糖3.75 g、NaNO20.49 g、K2HPO41.0 g、KH2PO40.3 g、MgSO4·7H2O 0.05 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、MnSO4·4H2O 0.01 g、NaCl 5.0 g、1 000 mL蒸餾水，pH7.0。

1.2 實驗方法

1.2.1 拮抗菌的篩選

(1)初篩：采集青蛙養(yǎng)殖稻田土壤樣品，加入10倍體積的BHI液體培養(yǎng)基，300 r/min離心，上層液體28℃下180 r/min搖床上振蕩培養(yǎng)過夜。隨后采用平板對峙法篩選拮抗菌。取濃度為1.0×1010CFU/mL的米爾伊麗莎白菌300 μL涂布于BHI瓊脂培養(yǎng)基上并鋪貼6 mm無菌濾紙片，分別滴加30 μL樣品菌液至濾紙片上，1 h待干后置于28 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24 h，觀察是否有抑菌圈出現(xiàn)，選取出現(xiàn)抑菌圈的樣本進行下一步的分離純化。

(2)復篩：將出現(xiàn)抑菌圈的混合菌在BHI固體平板上進行劃線分離、培養(yǎng)，挑取形態(tài)大小不一的菌落接種至BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將拮抗菌液的濃度調(diào)整為OD600 nm=0.6～0.8用于拮抗菌的復篩。重復上述平板對峙法，觀察抑菌圈大小，找到具有較強拮抗作用的菌株。用游標卡尺測量抑菌圈的直徑，這個實驗獨立地重復三次，選擇拮抗效果明顯的菌株進行后續(xù)研究。

1.2.2 拮抗菌的鑒定

選取出現(xiàn)抑菌圈最大的菌株活化培養(yǎng)24 h，分別對其進行革蘭氏染色和磷鎢酸負染，分別在油鏡和電子顯微鏡下觀察其形態(tài)特征，再通過16S rDNA序列進行擴增、測序、比對，結(jié)合其形態(tài)學特征及16S rDNA 序列系統(tǒng)發(fā)育分析，最終確定拮抗菌種類。系統(tǒng)發(fā)育分析采用MEGA 7軟件，以鄰位法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 X2菌株在不同培養(yǎng)條件下的生長特性

(1)pH：用0.1 mol/L NaOH溶液或0.1 mol/L HCl溶液將BHI液體培養(yǎng)基pH分別調(diào)至3、5、7、9、11，取1 mL濃度為1.0×1010CFU / mL的X2菌液接種到100 mL BHI液體培養(yǎng)基中用180 r/min搖床(28 ℃)培養(yǎng)20 h，每2 h用紫外分光光度計于600 nm波長下測量菌液的吸光值(OD600 nm)，每次重復測定3 次[21]。

(2)鹽度：用NaCl 配制5‰、10‰、20‰、30‰、40‰和50‰不同鹽度梯度的100 mL BHI液體培養(yǎng)基[21]，分別接種1 mL濃度為1.0×1010CFU/mL的X2培養(yǎng)液，每個鹽度梯度設(shè)3個平行，180 r/min(28 ℃)培養(yǎng)20 h，每2 h測一次OD600 nm值。

(3)溫度：將1 mL濃度為1.0×1010CFU/mL的X2接種于100 mL BHI液體培養(yǎng)基中，分別于20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃[11]恒溫搖床中180 r/min培養(yǎng)20 h，每個溫度設(shè)置3個平行，每2 h測量OD600 nm值。

1.2.4 X2對氨氮和亞硝酸鹽的降解作用

將1 mL濃度梯度為5.0×109、5.0×107、5.0×105、5.0×103和5.0×101CFU/mL的X2菌液，分別加入到20 mL氨氮濃度稀釋至1 mg/L的氨氮培養(yǎng)基和亞硝酸鹽濃度稀釋至0.4 mg/L的亞硝酸鹽培養(yǎng)基中，180 r/min搖床培養(yǎng)，每24 h分別測定培養(yǎng)基中氨氮或亞硝酸鹽濃度。氨氮濃度測定采用納氏試劑比色法[22]，亞硝酸鹽濃度測定采用分光光度法[23]。計算氨氮和亞硝酸鹽的去除率，實驗重復三次，計算公式如下：

氨氮去除率=[(初始氨氮濃度-接種后氨氮濃度)/初始氨氮濃度]×100%

亞硝酸鹽去除率=[(初始亞硝酸鹽濃度-接種后亞硝酸鹽濃度)/初始亞硝酸鹽濃度]×100%

2 結(jié)果

2.1 拮抗菌的篩選

經(jīng)過多輪的初篩和復篩，獲得1株抑菌效果較好的菌株X2。X2的3個平行都出現(xiàn)抑菌圈，其抑菌圈直徑為(16.6±0.2)mm。表明菌株X2對病原菌米爾伊麗莎白菌具有穩(wěn)定的拮抗能力。

2.2 菌株形態(tài)特征

對 X2的革蘭氏染色結(jié)果顯示，菌體絕大多數(shù)是革蘭氏陰性呈紅色，少數(shù)菌體是革蘭氏陽性呈現(xiàn)紫色。透射電子顯微鏡下觀察顯示，X2為棒狀桿菌，周生多根鞭毛，長約2 μm，寬(直徑)約0.8 μm(圖1)。這符合芽孢桿菌的形態(tài)學特征。

圖1 拮抗菌X2的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of antagonistic bacteria X2A：革蘭氏染色后顯微鏡觀察；B：負染后電鏡觀察

2.3 16S rRNA 基因序列分析

將菌株X2的16S rDNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫進行核苷酸序列BLAST比對分析，結(jié)果顯示，X2的 16S rDNA 序列與數(shù)據(jù)庫中的4株側(cè)孢短芽孢桿菌(Brevibacilluslaterosporus)的同源性相似性達到99%。在基于 16S rDNA 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，菌株X2與側(cè)孢短芽孢桿菌(GenBank登錄號NR112212.1、NR037005.1、NR118957.1、NR112727.1)位于同一分支(圖2)，關(guān)系最近。根據(jù)菌株X2的形態(tài)特征以及16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定菌株X2為芽孢桿菌屬的側(cè)孢短芽孢桿菌(B.laterosporus)。

圖2 基于 X2 菌株16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of strain X2 and other bacteria括號內(nèi)為菌株的16S rDNA 基因序列在GenBank 中的登錄號；分支結(jié)點處數(shù)字為Bootstrap 值；標尺的數(shù)據(jù)為進化距離。

2.4 X2在不同培養(yǎng)條件下的生長特性

菌株X2在pH 5～9均能生長，在pH為7時，X2生長狀態(tài)達到最佳(圖3-A)，這表明X2能耐受較大范圍的酸堿環(huán)境。在pH為3或pH為11時，X2幾乎不能生長，說明X2在過酸過堿的環(huán)境中無法生存。

圖3 菌株X2在不同pH(A)、不同鹽度(B)和不同溫度(C)下的生長曲線Fig.3 The growth curves of strain X2 under different pH(A)，salinity(B)and temperatures(C)conditions

如圖3-B所示，X2在鹽度5‰ ～ 50‰內(nèi)均能生長，最適生長鹽度為5‰。在鹽度為50‰時，X2生長緩慢，明顯受到了抑制，但在低于(含)40‰的鹽度范圍內(nèi)，X2都能獲得較好的生長。結(jié)果表明X2對鹽度的耐受性比較強，能適應包括海水在內(nèi)的絕大多數(shù)水體。

不同溫度下的生長結(jié)果顯示(圖3-C)，X2在20～40 ℃溫度內(nèi)均能生長，20～35 ℃范圍內(nèi)X2的生長活力隨著溫度的上升而增長。在溫度為35 ℃時，菌株X2表現(xiàn)出了明顯的生長優(yōu)勢，溫度達40 ℃時，X2生長活力降低；20 ℃時菌株的生長活力相對最差。說明X2對高溫的適應性較強，對低溫的適應性較弱。

2.5 X2降氨氮和亞硝酸鹽的能力

不同濃度的X2對培養(yǎng)基中氨氮和亞硝酸鹽的去除效果如圖4所示，除了最高濃度組外，X2對氨氮的去除率與X2的接種濃度呈正相關(guān)，并隨時間先上升后保持穩(wěn)定趨勢，在第3天時氨氮去除率達到最高值。在X2接種濃度為5.0×107CFU/mL時對氨氮的降解效果最好，去除率最高達到74.95%。最高濃度組的不佳表現(xiàn)，可能跟菌株自身的代謝排氨有關(guān)。

圖4 不同濃度(CFU/mL)的X2對氨氮(a)和亞硝酸鹽(b)的降解作用Fig.4 Degradation of ammonia nitrogen and nitrite by different concentrations of X2

去除亞硝酸鹽方面，X2接種在濃度為5.0×105～5.0×109CFU/mL時均能獲得很好的去除效果，其中X2接種濃度為5.0×105CFU/mL在第3天時對亞硝酸鹽的去除率最高，達到99.89%。接種濃度為5.0×103CFU/mL和5.0×101CFU/mL的X2對亞硝酸鹽的去除效果相對較差。

3 討論

目前，我國已報道的有良好拮抗效果的芽孢桿菌有短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、巨大芽孢桿菌(B.megaterium)等[24]。本實驗獲得的菌株X2對米爾伊麗莎白菌具有良好的體外拮抗作用，并通過對菌體形態(tài)學特征以及 16S rDNA 序列分析鑒定其為側(cè)孢短芽孢桿菌。側(cè)孢短芽孢桿菌因其能產(chǎn)生抗蟲、抗細菌和抗真菌物質(zhì)，已被作為拮抗菌應用[25，26]，SAIKIA 等[27]在2011年報道了側(cè)孢短芽孢桿菌對重要植物病原菌和革蘭氏陽性菌具有抑菌作用。本實驗結(jié)果顯示側(cè)孢短芽孢桿菌X2株對米爾伊麗莎白菌具有較強的拮抗能力，能在蛙類疾病防控中發(fā)揮作用，將具有較大的應用價值。

對拮抗菌生長特性的研究是其規(guī)模化生產(chǎn)應用的基礎(chǔ)，研究菌株的最適培養(yǎng)溫度、鹽度和pH，有利于指導其規(guī)?；a(chǎn)和應用。從拮抗菌X2的生長特性來看，菌株X2在pH 5、pH 9的條件下都能生長，pH 5的生長優(yōu)于pH 9，這表明該菌株耐酸堿能力強，且對偏酸性環(huán)境的適應性要強于偏堿性環(huán)境。鹽度方面，X2在5‰ ～ 40‰的范圍內(nèi)都能較好生長，這表明X2強大的鹽度耐受性能使其廣泛應用于淡水和海水的水產(chǎn)養(yǎng)殖中。X2對溫度的適應性表明，其對高溫的適應性較強，對低溫的適應性較弱，其繁殖活力隨溫度的升高而增強。在病害頻發(fā)的高溫季節(jié)，X2能更有效發(fā)揮作用。

綜上所述，拮抗菌側(cè)孢短芽孢桿菌X2具有較強的耐酸堿性、耐鹽性，適溫性廣等特性，同時具有較強的去除氨氮和亞硝酸鹽的能力，可作為益生菌應用于蛙類養(yǎng)殖中防控米爾伊麗莎白菌感染和水質(zhì)調(diào)控，為蛙類綠色健康養(yǎng)殖提供新的技術(shù)手段。