胥輝豪,馮雪倩,樸雪玲,慎曉軍,鄭小波,楊 恒,林珈好,金藝鵬,林德貴

(1.西南大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,重慶 402460;2.西南大學(xué)發(fā)光分析與分子傳感教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400700;3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,北京 100193)

角膜具有折射與透射性,同時保護(hù)眼內(nèi)結(jié)構(gòu)免受外界因素傷害等生理作用,對維持正常視力至關(guān)重要。角膜上皮層位于角膜最外層,是眼表的第一道生理組織屏障,也是維持角膜透明度的重要結(jié)構(gòu)[1]。角膜緣干細(xì)胞(limbal stem cells, LSCs)是角膜上皮細(xì)胞的再生來源,各種病因造成的LSCs缺失將降低角膜上皮的自我更新能力,從而破壞角膜完整性或造成角膜潰瘍經(jīng)久不愈,進(jìn)而致使角膜血管化、角膜結(jié)膜化、角膜瘢痕化、角膜組織壞死以及不同程度炎性反應(yīng),最終可能發(fā)展為角膜溶解和角膜穿孔等嚴(yán)重病理變化[2-3]。因此,功能正常的LSCs對于修復(fù)角膜損傷與維持角膜透明度至關(guān)重要[4]。

貓的角膜疾病不完全等同于犬或人類,獸醫(yī)臨床中某些特定的角膜疾病僅限于貓,例如壞死性角膜炎[5-6]、角膜上皮糜爛[7]等。隨著伴侶貓的數(shù)量日益增多且角膜疾病高發(fā),而常規(guī)的手術(shù)治療手段存在潛在麻醉風(fēng)險、技術(shù)材料要求高、術(shù)后并發(fā)癥較多等局限性[5,7-10]。因此,針對貓角膜疾病治療的研究應(yīng)當(dāng)另辟蹊徑。近年來,LSCs移植技術(shù)治療角膜疾病被認(rèn)為具有巨大前景[11-12]。目前,人醫(yī)臨床上已嘗試采用體外培養(yǎng)的自體或異體LSCs配合移植技術(shù)治療角膜上皮經(jīng)久不愈以及LSCs嚴(yán)重缺損所引發(fā)的各種角膜疾病,并已取得一定成效[13-14]。這為LSCs移植治療貓角膜疾病提供了新思路以及理論依據(jù),但目前獸醫(yī)臨床研究中尚未有針對貓角膜緣干細(xì)胞(feline limbal stem cells,FLSCs)體外培養(yǎng)的系統(tǒng)方法。因此,本研究通過比較不同分離與培養(yǎng)方法對FLSCs生長情況的影響,以期篩選出最適的分離、培養(yǎng)體系,為進(jìn)一步研究貓相關(guān)角膜疾病的發(fā)病機(jī)制以及將其臨床用于相關(guān)角膜疾病的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

健康雌性本地實(shí)驗(yàn)貓,4月齡,由西南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物房提供。異氟烷(河北九派制藥有限公司),鼠尾膠原蛋白I型、三抗(青霉素-鏈霉素-兩性霉素-B)、人重組EGF、人重組胰島素(Solarbio公司),中性蛋白酶Ⅱ、0.25%胰蛋白酶/1 mmol·L-1EDTA溶液、胎牛血清、DMEM、F12、血清替代物(KSR)、非必需氨基酸、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、白血病抑制因子(美國Gibco公司),抗小鼠ABCG2蛋白(Invitrogen公司),抗鼠波形蛋白單抗(GeneTex公司),FITC—羊抗小鼠IgG二抗(Proteintech公司)。角膜板層隧道刀、角膜側(cè)切口刀(美國Sharpoint公司);角膜剪、顯微鑷(有齒/無齒):上海金鐘公司;百級凈化手術(shù)室(西南大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院),GS-2020手術(shù)顯微鏡(德國目樂公司),37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱、離心機(jī)(美國Thermo Scientific公司),酶標(biāo)儀(美國佰騰公司),熒光倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司),4、-20、-80 ℃冰箱(中國青島海爾公司)。

1.2 體外構(gòu)建FLSCs生長三維環(huán)境

在冰浴條件下,將200 μL鼠尾膠原蛋白I型(5 mg·mL-1)加至1.5 mL滅菌離心管中,再往離心管中加入690 μL滅菌超純水,混勻。然后加入12 μL 0.1 mol·L-1NaOH,立刻混勻。再加入100 μL DMEM培養(yǎng)基和F12培養(yǎng)基(3∶1)混合組成的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(BM培養(yǎng)液),混勻后,立即加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔10 μL。然后將包被好的培養(yǎng)板在室溫靜置20 min,待膠凝固后,移至培養(yǎng)箱內(nèi)。

1.3 貓角膜緣組織取材

所有手術(shù)操作均在百級凈化手術(shù)室內(nèi)進(jìn)行。對試驗(yàn)貓進(jìn)行吸入麻醉后,仰臥保定,剃除術(shù)眼周圍毛發(fā),使用碘伏充分消毒眼周皮膚。鋪無菌手術(shù)洞巾,放置開瞼器,使用聚維酮碘(900 mg·L-1)術(shù)野消毒液充分消毒眼表,無菌PBS液沖洗結(jié)膜囊3 次,在手術(shù)顯微鏡下(10×)取樣。以頭側(cè)12:00方向角膜緣為取材點(diǎn),在角膜緣處剪開球結(jié)膜,使用隧道刀分離角膜緣處上皮與前基質(zhì)層,隨后使用角膜剪獲取角膜緣約1 mm×6 mm×0.2 mm的灰白色組織(利用顯微鏡自帶刻度尺測量)(圖1),裝入含 D-Hanks液(含1%三抗)的EP管中,浸泡持續(xù)30 min。

A.分離結(jié)膜并制作角膜緣切口;B.分離角膜緣處上皮與基質(zhì)層;C.獲取角膜緣組織A. Separate conjunctiva and make limbal incision; B. Separation of epithelial and stromal layers at the limbus; C. Obtain limbal tissue圖1 手術(shù)顯微鏡下采集貓角膜緣組織Fig.1 Collecting cat limbal tissue under operating microscope

1.4 原代FLSCs分離

原代FLSCs分離培養(yǎng)方法分為3組:A組采用組織貼壁法(T法),B組采用混合酶消化法(N法),C組采用混合酶消化法聯(lián)合組織貼壁法(NT法)。A組在無菌條件下將角膜緣組織剪成0.2 mm3大小,直接貼附于預(yù)先用添加10%胎牛血清(FBS)、1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素-B的BM培養(yǎng)基濕潤過的的25 mm2有孔細(xì)胞瓶中,于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)6 h后加入4 mL添加10% FBS、1%三抗的BM培養(yǎng)基,每2 d換液1次。待組織塊周邊爬出游離細(xì)胞后取出組織塊。B組將角膜緣組織與2.0 units·mL-1的中性蛋白酶Ⅱ在37 ℃溫育2 h,棄液,用PBS洗2～3次;用0.25%胰蛋白酶/1 mmol·L-1EDTA溶液37 ℃處理消化后細(xì)胞20 min,產(chǎn)生單細(xì)胞懸浮液,移除角膜緣組織,添加培養(yǎng)液終止酶活性,1 500 rpm離心10 min,棄上清;加入1 mL培養(yǎng)液輕吹混勻,轉(zhuǎn)移至25 mm2細(xì)胞瓶中補(bǔ)培養(yǎng)液至5 mL進(jìn)行培養(yǎng),每2 d換液1次。C組使用B組酶消化角膜緣組織后,不移除角膜緣組織,加入添加10% FBS、1%三抗的BM培養(yǎng)基后培養(yǎng),每2 d換液1次。每日使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和生長狀態(tài),并拍照記錄。

1.5 角膜緣干細(xì)胞鑒定

對3種方法分離的角膜緣細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光鑒定。取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液,以3×105·mL-1的密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,待細(xì)胞在孔中長滿單層后,使用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測細(xì)胞中ABCG2標(biāo)志蛋白的表達(dá)情況。

1.6 FLSCs培養(yǎng)分析

將分離的FLSCs以1×104個接種到鼠尾膠原蛋白I型凝膠包被的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。細(xì)胞在3種不同條件下培養(yǎng): 對照組(BC組:BM+10%FBS+1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素-B);含血清培養(yǎng)組(DLM組:BM+10%FBS+1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素-B +20 ng·mL-1人重組EGF+10 μg·mL-1人重組胰島素);無血清培養(yǎng)組(SCM組:BM+10%血清替代物(KSR)+1% 非必需氨基酸+10 ng·mL-1堿性成纖維細(xì)胞生長因子+10 ng·mL-1白血病抑制因子+1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素-B )。連續(xù)7 d內(nèi)每24 h使用CCK-8法進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),繪制生長曲線,分析FLSCs最適培養(yǎng)基。

1.7 細(xì)胞屬性鑒定

使用篩選出的最佳分離FLSCs的方法和最適培養(yǎng)基進(jìn)一步培養(yǎng)FLSCs,對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞增殖能力測定、以及細(xì)胞屬性的鑒定。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié) 果

2.1 原代FLSCs分離方法對比結(jié)果

細(xì)胞形態(tài)學(xué)顯示,3種分離方法均可分離出呈梭形的干細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞,但分離的效率存在差異(圖2)。由圖2可見,T法干細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞生長時間較長,第1天貼壁細(xì)胞極少,第10天細(xì)胞生長率明顯低于N法和NT法,第10天后細(xì)胞生長速度加快,第17天細(xì)胞尚未長滿單層。N法第1天貼壁的梭形細(xì)胞比T法多,但有其他形態(tài)的雜細(xì)胞混合生長,不易純化分離,第7天后細(xì)胞生長速度加快,第17天后混合細(xì)胞長滿單層。而NT法第1天貼壁的干細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞較其他兩組多,細(xì)胞從角膜緣組織游出后,成島嶼狀生長,其他形態(tài)的雜細(xì)胞較少,第5天后明顯可見干細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞生長速度加快,第11天長滿單層。對比3種分離方法,明顯觀察到NT法中具有干細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞數(shù)量多于其他兩組,且其他形態(tài)的雜細(xì)胞較少;此外,NT法中干細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞分離速度最快,分離效果最好。

2.2 干細(xì)胞標(biāo)記蛋白免疫熒光鑒定

三種消化法所分離的細(xì)胞中ABCG2標(biāo)記蛋白均有表達(dá),結(jié)果如圖3所示,NT法細(xì)胞中ABCG2蛋白表達(dá)最強(qiáng),而T法中表達(dá)最弱。表明3種分離方法均可成功分離出FLSCs,但NT法分離的FLSCs最多。結(jié)果表明,在手術(shù)顯微鏡下微創(chuàng)分離與采集的活體貓角膜緣組織非常適用于體外培養(yǎng)FLSCs。通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)和干細(xì)胞標(biāo)記蛋白鑒定顯示,混合酶消化法聯(lián)合組織貼壁法(NT法)最適于分離FLSCs。

2.3 不同培養(yǎng)基中FLSCs生長分析結(jié)果

根據(jù)方差分析結(jié)果所示(表1),與其他兩組相比,DLM組在培養(yǎng)第3天時細(xì)胞增殖速度顯著加快(P<0.05),從培養(yǎng)第4天起,DLM組細(xì)胞增殖速度與其他兩組差異極顯著(P<0.01)。與BC組相比,SCM組培養(yǎng)第4天時細(xì)胞增殖速度相對更快,差異顯著(P<0.05),培養(yǎng)第5天時,差異極顯著(P<0.01)。細(xì)胞生長曲線顯示(圖4),FLSCs在3種培養(yǎng)基中均可生長增殖,但增殖速度存在差異,DLM組增殖速度明顯快于其他兩組。由此可知,在本研究篩選的3種培養(yǎng)基中,DLM培養(yǎng)基是最適培養(yǎng)FLSCs的培養(yǎng)基,SCM培養(yǎng)基次之。

表1 FLSCs在不同培養(yǎng)基中生長的每日OD450 nm值Table 1 Daily OD450 nm values of FLSCs grown in different media

*. P<0.05; **. P<0.01圖4 FLSCs在不同培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.4 Growth curve of FLSCs in different culture media

2.4 細(xì)胞屬性鑒定

2.4.1 FLSCs生長過程中形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 如圖5所示,倒置顯微鏡下可見細(xì)胞從組織塊中游離出來,形成散在的單個細(xì)胞;72 h后,可見細(xì)胞開始聚集生長;120 h后,細(xì)胞數(shù)量明顯增多,開始進(jìn)入對數(shù)生長期,細(xì)胞間間隙變窄;216 h后,貼壁細(xì)胞達(dá)到80%左右匯合;288 h后,貼壁細(xì)胞基本匯合形成細(xì)胞單層,細(xì)胞間排列緊密。鏡下可見凋亡細(xì)胞少,細(xì)胞形態(tài)清晰、呈梭形、胞質(zhì)豐富、核呈圓形、細(xì)胞核位于細(xì)胞中央,傳至7代細(xì)胞生長狀態(tài)仍然穩(wěn)定,細(xì)胞形態(tài)保持一致的長梭形,細(xì)胞核核質(zhì)明顯,邊緣清晰。

A.接種培養(yǎng)板24 h后的FLSCs;B.接種培養(yǎng)板72 h后的FLSCs;C.接種培養(yǎng)板120 h后的FLSCs;D.接種培養(yǎng)板216 h后的FLSCs;E接種培養(yǎng)板288 h后的FLSCsA. FLSCs after inoculated on culture plate for 24 h; B. FLSCs after inoculated on culture plate for 72 h; C. FLSCs after inoculated on culture plate for 120 h; D. FLSCs after inoculated on culture plate for 216 h; E. FLSCs after inoculated on culture plate for 288 h圖5 FLSCs生長狀態(tài)觀察(40×,標(biāo)尺=50 μm)Fig.5 Observation of the growth status of FLSCs (40×, bar=50 μm)

2.4.2 FLSCs增殖生長曲線 FLSCs增殖情況見表2、表3、圖6和表4。細(xì)胞生長曲線呈“S”型,經(jīng)歷了經(jīng)典細(xì)胞生長曲線的遲緩期、對數(shù)生長期、平穩(wěn)期和衰亡期4個生長時期,細(xì)胞在貼壁生長的前72小時處于遲緩期,第72～216小時處于對數(shù)生長期,第216～264小時則基本處于平穩(wěn)期,第264小時開始細(xì)胞進(jìn)入衰亡期。細(xì)胞群體倍增時間to=tlg2/1 g(Nt/No),其中,No為接種細(xì)胞數(shù),Nt為時間t后的細(xì)胞數(shù),由此計算FLSCs群體倍增時間為38.9 h,平均最大增殖濃度為5.66×105cells·mL-1。

表2 FLSCs生長曲線測定結(jié)果Table 2 Results of growth curve measurement of FLSCs

表3 FLSCs倍增時間測定結(jié)果Table 3 Measurement results of doubling time of FLSCs

表4 FLSCs生長曲線各時期的時間分布Table 4 Time distribution of feline corneal limbal stem cell growth curve in each period d

圖6 第3代FLSCs生長曲線Fig.6 Growth curve of the third-generation FLSCs

2.4.3 波形蛋白、p63、CK3和CK12表達(dá)檢測 本試驗(yàn)選取LSCs的陽性標(biāo)志物p63、波形蛋白和上皮分化標(biāo)記物CK3、CK12對培養(yǎng)第3、4、5代FLSCs進(jìn)行定性分析。結(jié)果可見,細(xì)胞中波形蛋白和p63均呈強(qiáng)陽性表達(dá),而上皮分化標(biāo)記物CK3和CK12則不表達(dá)(圖7)。

圖7 免疫熒光技術(shù)檢測波形蛋白 (A)、p63 (B)、CK3 (C)和CK12 (D)表達(dá)情況 (標(biāo)尺=50 μm)Fig.7 Expression of vimentin (A), p63 (B), CK3 (C) and CK12 (D) detected by immunofluorescence technique (bar=50 μm)

3 討 論

近年來,對干細(xì)胞的研究是再生醫(yī)學(xué)最重要的進(jìn)展之一。干細(xì)胞因具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、多向分化潛能、促進(jìn)損傷修復(fù)等優(yōu)點(diǎn),被廣泛用于各類疾病治療研究中[15]。角膜盲作為高發(fā)的眼表疾病備受人們關(guān)注,而LSCs移植的臨床應(yīng)用為該類疾病的治療提供了全新的思路。LSCs不僅能為角膜上皮的體外重建提供足夠數(shù)量的種子細(xì)胞,且體外培養(yǎng)的LSCs還可失去部分抗原性,更利于臨床移植。近年來,利用LSCs做為種子細(xì)胞體外構(gòu)建角膜上皮的治療方法已在人類眼科學(xué)中初見成效[16]。鑒于角膜疾病同樣作為貓的高發(fā)眼科疾病,而傳統(tǒng)的治療方法存在效果不佳、費(fèi)用昂貴等局限性,因此嘗試研究LSCs移植治療方法極具臨床意義。

角膜緣上皮由三層細(xì)胞組成:淺表非角化分層鱗狀細(xì)胞、與表層平行的中間翼狀細(xì)胞和垂直于表層的基底細(xì)胞[17]。LSCs位于角膜緣POV區(qū)(palisades of vogt)。LSCs體外分離培養(yǎng)關(guān)鍵的第一步在于成功分離角膜緣基底層和角膜緣內(nèi)皮層,并盡可能多地獲取LSCs。角膜緣區(qū)域結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜,其中包括角膜、結(jié)膜、鞏膜等組織,因此造成取樣存在一定難度。為保證LSCs的高效分離及避免污染問題,本研究采取工作在百級凈化手術(shù)室內(nèi)完成,使用呼吸麻醉方式,利用眼科顯微鏡及眼科手術(shù)器械對活體試驗(yàn)貓進(jìn)行角膜緣取材,這在最大程度上減少了細(xì)胞污染的可能性并可精準(zhǔn)定位與分離組織。在分離角膜緣組織時,本研究保留了部分黑色素細(xì)胞層組織。有研究表明,角膜緣的黑色素細(xì)胞有助于細(xì)胞的增殖和保持未分化的狀態(tài)[18]。本研究同時觀察到,取樣位點(diǎn)的缺損可在術(shù)后3～5 d內(nèi)完全修復(fù),這表明活體角膜緣取樣對貓眼損傷極小,同時也提示貓自體角膜緣干細(xì)胞移植治療具有潛在的可能性。

LSCs的體外培養(yǎng)主要分為組織塊貼壁法和酶消化法。前者步驟簡單、成功率高、污染小、可保持細(xì)胞原有形態(tài)與維持角膜緣干細(xì)胞的功能[19],但操作要求較高,細(xì)胞生長期較長;酶消化法雖可獲得大量細(xì)胞,但操作繁瑣、需要試劑多且昂貴,對細(xì)胞損傷較大。隨著技術(shù)的進(jìn)步,許多學(xué)者不斷改進(jìn)分離角膜緣干細(xì)胞的方法[20-21]。鑒于尚未有FLSCs的分離方法報道,因此本研究對比了組織塊貼壁法、混合酶消化法以及混合酶消化法聯(lián)合組織貼壁法分離FLSCs的效果,以篩選最適用于FLSCs的原代分離方法。結(jié)果表明,酶消化法聯(lián)合組織貼壁法中干細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞分離速度最快,其他形態(tài)的細(xì)胞少,細(xì)胞增殖活性較高。采用顯微手術(shù)分離角膜緣組織能更準(zhǔn)確剝離角膜基質(zhì)層和內(nèi)皮層,從而使組織塊貼壁法游離出雜細(xì)胞較少的FLSCs,但組織塊間細(xì)胞連接緊密,FLSCs游離出組織所需時間較長,且若FLSCs起始分離基數(shù)較少則易出現(xiàn)生長抑制的情況,這將不利于細(xì)胞體外快速擴(kuò)增。而混合酶消化法,首先通過中性蛋白酶DispaseⅡ?qū)悄ぞ壣掀优c角膜緣基質(zhì)層結(jié)構(gòu)進(jìn)行酶解,隨后胰酶-EDTA消化FLSCs,兩者配合,既減輕了對細(xì)胞膜的損傷,又分離了大量細(xì)胞,且盡可能地降低了雜細(xì)胞的含量,最終提高了FLSCs的分離效率,而角膜緣組織貼壁培養(yǎng)又增加短時間內(nèi)FLSCs的增殖數(shù)量,使FLSCs更早進(jìn)入對數(shù)生長期。

離體的LSCs在培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板等二維環(huán)境中生長,常發(fā)生與細(xì)胞在體內(nèi)時不同的組織結(jié)構(gòu)改變、生物化學(xué)信息以及細(xì)胞之間相互作用的信號改變或丟失,從而無法反映出細(xì)胞在體時的正常功能[22]。相比之下,細(xì)胞在三維載體支架中的生長持續(xù)時間更長,也更能保持干細(xì)胞特性;同時三維載體培養(yǎng)可模擬體內(nèi)的生長因子作用、電信號傳輸及細(xì)胞外基質(zhì)介導(dǎo)的機(jī)械傳導(dǎo)等,上述微環(huán)境在細(xì)胞分化及維持正常生理生化過程中均發(fā)揮極其重要的作用[23]。膠原凝膠是一種可使LSCs體外生長狀態(tài)接近體內(nèi)生長狀態(tài)的安全、無病毒污染且可降解的三維細(xì)胞培養(yǎng)載體。鑒于此,本研究在細(xì)胞培養(yǎng)之前,選用對96孔細(xì)胞板包被鼠尾膠原蛋白I型凝膠以構(gòu)建FLSCs生長的三維載體,在DMEM/F12(3∶1)培養(yǎng)基(BM培養(yǎng)基)基礎(chǔ)上,對比了添加10%FBS、1%三抗的BM培養(yǎng)基(BC);添加10%FBS、1%三抗、20 ng·mL-1人重組EGF以及10 μg·mL-1人重組胰島素的BM培養(yǎng)基(DLM);添加1%三抗、10%血清替代物(KSR)、1% 非必需氨基酸、10 ng·mL-1堿性成纖維細(xì)胞生長因子和10 ng·mL-1白血病抑制因子的無血清培養(yǎng)基(SCM)3種不同的完全培養(yǎng)基,結(jié)果顯示,3種培養(yǎng)基均可培養(yǎng)FLSCs,但細(xì)胞在DLM中增殖速度最快,細(xì)胞峰值到達(dá)時間更短,10～11 d后長成細(xì)胞單層,而細(xì)胞在基礎(chǔ)培養(yǎng)基BC中增殖速度最慢。本研究初步認(rèn)為血清和細(xì)胞生長因子的疊加使用以及血清替代物和細(xì)胞生長因子比單純使用血清對角膜緣干細(xì)胞促生長增殖的效果好,且血清和細(xì)胞生長因子的疊加使用對FLSCs的促生長效果更好。人重組EGF、人重組胰島素、bFGF、LIF 4種細(xì)胞生長因子均可促進(jìn)FLSCs增殖和保持干細(xì)胞特性。其機(jī)制可能是bFGF可調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分裂、增殖、分化、形態(tài)結(jié)構(gòu)及再生等特性;LIF可通過高效抑制干細(xì)胞的自發(fā)分化維持干細(xì)胞多潛能的表型;而bFGF與LIF配合可促進(jìn)FLSCs增殖分裂且不分化。EGF通過廣泛的生物學(xué)效應(yīng),促進(jìn)細(xì)胞生長繁殖、加速細(xì)胞新陳代謝;人重組胰島素是無血清哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)基中的普遍添加物質(zhì),其通過促進(jìn)糖和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn),提高合成代謝降低分解代謝,從而刺激細(xì)胞生長。血清和血清替代物與細(xì)胞生長因子之間如何相互作用促進(jìn)FLSCs增殖的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

ABCG2作為ATP結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的成員,在干細(xì)胞中廣泛表達(dá),研究發(fā)現(xiàn)其具有側(cè)群表型[24],被認(rèn)為是干細(xì)胞的通用標(biāo)記[25]。ABCG2在角膜緣干細(xì)胞[26-27]、造血干細(xì)胞[28]、胚胎干細(xì)胞[29]、神經(jīng)干細(xì)胞[30]等多種干細(xì)胞中廣泛表達(dá)。因此,本研究首先使用ABCG2對分離的細(xì)胞進(jìn)行了干細(xì)胞鑒定,結(jié)果顯示,3種方法分離的干細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞ABCG2蛋白均為陽性表達(dá),為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

p63是一種核轉(zhuǎn)錄因子,近幾年,作為LSCs的陽性標(biāo)志物對角膜緣上皮細(xì)胞及培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定[31-32]。研究發(fā)現(xiàn),p63廣泛表達(dá)于角膜緣的基底部,而在角膜緣表層上皮和角膜中央上皮層卻未見表達(dá),可作為LSCs的陽性標(biāo)志物[33]。波形蛋白(vimentin)是間質(zhì)細(xì)胞中最豐富的蛋白質(zhì)[34]。波形蛋白表達(dá)于角膜緣上皮基底細(xì)胞中,其常與其他生物標(biāo)志物用于識別LSCs[35]。本研究使用細(xì)胞免疫熒光檢測FLSCs的波形蛋白和p63表達(dá)情況,結(jié)果表明,培養(yǎng)的細(xì)胞均呈陽性表達(dá),表明本研究篩選與分離培養(yǎng)的細(xì)胞為FLSCs。

CK3和CK12是表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)的角蛋白,被認(rèn)為是角膜上皮分化的標(biāo)記物。Schermer等[36]早在1986年利用CK3對兔角膜緣部位細(xì)胞染色,發(fā)現(xiàn)CK3在角膜緣的基底細(xì)胞層中未見表達(dá),而角膜中央部位則全層表達(dá)。CK12作為角膜上皮特異性標(biāo)記物,除角膜緣基底細(xì)胞外,其存在于整個角膜上皮。因此CK和CK12被廣泛認(rèn)為是在角膜上皮細(xì)胞、角膜緣上基底層細(xì)胞中特異性表達(dá),而不在角膜緣基底細(xì)胞中表達(dá)[27]。這些研究證明,CK3和CK12可作為LSCs的陰性標(biāo)志物。本研究分離培養(yǎng)的的細(xì)胞中,CK3與CK12均為陰性表達(dá),表明本研究所分離培養(yǎng)的細(xì)胞并非分化的角膜上皮細(xì)胞。4種標(biāo)志物雙向驗(yàn)證本研究分離培養(yǎng)的細(xì)胞為FLSCs。

4 結(jié) 論

本研究首次成功對FLSCs進(jìn)行了采集、分離、體外培養(yǎng)與鑒定,并篩選出了最優(yōu)的分離與培養(yǎng)體系,為進(jìn)一步使用FLSCs治療貓相關(guān)角膜疾病提供了堅實(shí)的理論基礎(chǔ),也為其他動物L(fēng)SCs的分離、培養(yǎng)與鑒定提供了參考依據(jù)。