吳祎程,冉 濤,周傳社*,譚支良

(1.中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 畜禽養(yǎng)殖污染控制與資源化技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室 湖南省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)生理與代謝過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)部中南動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站,長(zhǎng)沙 410125;2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京 100049;3.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院,蘭州 730020;4.蘭州大學(xué)草種創(chuàng)新與草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730020)

反芻家畜瘤胃是一個(gè)復(fù)雜且多樣的微生態(tài)系統(tǒng),其內(nèi)棲息了細(xì)菌、真菌、原蟲、古生菌和病毒等多種微生物,瘤胃內(nèi)病毒主要由噬菌體(bacteriophage)構(gòu)成[1]。在微生物生態(tài)系統(tǒng)中,病毒尤其是噬菌體的侵染作用會(huì)極大地影響微生物群落的結(jié)構(gòu)及功能[2]。但由于病毒基因組缺乏合適標(biāo)記基因和分析基準(zhǔn),且多數(shù)病毒無法被歸類或找到對(duì)應(yīng)宿主,因此,難以通過PCR等常規(guī)技術(shù)來檢測(cè)未知病毒序列[3],以致病毒組研究相對(duì)滯后。近年來,宏基因組學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展極大地促進(jìn)了宏病毒組的研究,并已應(yīng)用于研究不同環(huán)境樣本中的病毒群落,如海洋[4]、土壤[5]、人類糞便[6]等。研究人員很早便關(guān)注瘤胃液中的病毒群落,陸續(xù)分離鑒定了多種瘤胃噬菌體,包括以壞死梭桿菌(Fusobacteriumnecrophorum)、白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)、溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)和瘤胃擬桿菌(Prevotellaruminicola)等為宿主菌的10種噬菌體[7]。但是,目前仍缺乏對(duì)瘤胃病毒群落的整體認(rèn)知。

宏病毒組測(cè)序的關(guān)鍵在于從待測(cè)樣品中富集病毒組分(virus-like particles,VLPs),獲取高質(zhì)量的病毒核酸用于宏基因組測(cè)序。已有研究發(fā)現(xiàn),DNA病毒占據(jù)了病毒的絕大部分,本研究?jī)H關(guān)注DNA病毒。由于病毒的基因組非常小,如果直接對(duì)樣品中所有的微生物組DNA進(jìn)行宏基因組測(cè)序,雖然能夠獲得部分病毒的基因序列,但是容易丟失那些讀長(zhǎng)短、豐度低的病毒序列,不能真實(shí)反映病毒的群體構(gòu)成[8]。同時(shí),病毒組分中的噬菌體具有溶源性、溶菌性和慢性感染等生命周期,其中溶源性噬菌體在溶源性周期中將遺傳物質(zhì)整合到其細(xì)菌宿主的基因組中[9],通過生物信息學(xué)分析可以從細(xì)菌宏基因組數(shù)據(jù)中挖掘到溶源性噬菌體的基因序列,但是不能有效獲取僅有溶菌性周期的噬菌體。因此,VLPs的富集對(duì)全面解析樣品中游離病毒組分尤為重要。由于瘤胃液樣本具有特殊性,如存在飼料大顆粒、厭氧環(huán)境、中性偏酸環(huán)境,因此有必要建立專門的瘤胃病毒顆粒分離方法[10]。理想情況下,該方法應(yīng)能快速、高效獲得病毒組分,易于在實(shí)驗(yàn)室中操作。

氯化銫(CsCl)密度梯度離心是病毒濃縮和純化的常用技術(shù)之一,但是該方法需要用到超速離心機(jī),不僅價(jià)格昂貴,而且操作耗時(shí)較長(zhǎng),更重要的是可能導(dǎo)致大量病毒組分的損失[11]。氯仿處理被認(rèn)為是一種可代替 CsCl密度梯度離心的快速純化病毒的方法,其可通過破壞細(xì)菌的胞膜結(jié)構(gòu),以達(dá)到有效去除細(xì)菌的效果[12]。鑒于此,本研究在提取瘤胃液病毒組分基因組DNA之前,參考Castro-Mejía等[13]對(duì)人糞便樣品采用的聚乙二醇(PEG 8000)沉淀法,設(shè)計(jì)4種流程瘤胃液病毒組分富集流程:(P1)離心+稀釋、(P2)離心+過濾+核酸酶處理、(P3)離心+稀釋+過濾+聚乙二醇沉淀、(P4)離心+稀釋+過濾+聚乙二醇沉淀+氯仿處理。PEG 8000廣泛應(yīng)用于病毒(噬菌體)的純化過程,可使病毒沉淀,而不受其他有機(jī)質(zhì)的干擾。本研究旨在比較過濾、PEG沉淀以及氯仿處理對(duì)瘤胃液樣品中游離病毒組分DNA質(zhì)量(產(chǎn)量、純度和完整性)的影響,并利用Illumina Novaseq 6000平臺(tái)對(duì)獲得的瘤胃病毒基因組DNA進(jìn)行測(cè)序,通過對(duì)瘤胃病毒群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析來評(píng)價(jià)不同流程對(duì)瘤胃病毒組分富集的效果,以期為進(jìn)一步研究瘤胃病毒功能提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

所有動(dòng)物程序均遵循動(dòng)物護(hù)理和使用指南,并經(jīng)中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所動(dòng)物護(hù)理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào) ISA-W-201609)。選用3只體重相近((31.13±3.72)kg)、體況良好的成年雄性湘東黑山羊作為試驗(yàn)動(dòng)物,安裝永久性瘤胃瘺管,按本團(tuán)隊(duì)成員曾波等[14]的報(bào)道進(jìn)行術(shù)后護(hù)理和飼喂。試驗(yàn)羊的基礎(chǔ)日糧由52%玉米秸稈、21.52%玉米、16.96%麥麩、5.98%豆粕、0.86%菜籽餅、1.08%尿素、0.60%食鹽以及1%預(yù)混料組成。日糧營(yíng)養(yǎng)水平為10.72%粗蛋白、58.76%中性洗滌纖維以及27.79%酸性洗滌纖維。

1.1 瘤胃液樣品采集步驟

山羊晨飼后4 h,通過瘤胃瘺管采集瘤胃內(nèi)容物,用無菌攪拌棒攪動(dòng)使瘤胃內(nèi)容物樣品混勻,經(jīng)4層無菌紗布過濾至50 mL無菌離心管,離心管裝至2/3處后立刻蓋嚴(yán),投入液氮罐中速凍,置于干冰上迅速轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室,于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 瘤胃液病毒組分制備

試驗(yàn)流程參考Castro-Mejía的方法[13],并加以修改,以有效分析瘤胃液病毒組。為消除動(dòng)物個(gè)體差異,將3頭黑山羊的瘤胃液等體積混合,分成3份,操作流程如圖1所示。

將瘤胃液混合后,分成三份按照四組流程進(jìn)行處理,命名為P1至P4,下同。步驟1(離心)、2(稀釋)為所有流程的共同步驟,且P1只執(zhí)行步驟1和2,P2執(zhí)行步驟1、2和3(微孔濾膜過濾),P3執(zhí)行步驟1、2、3和4(聚乙二醇沉淀),P4執(zhí)行步驟1、2、3、4和5(氯仿處理)The rumen fluid of three goats were collected and mixed, then divided into three parts and processed according to four routes named P1 to P4, the same as below. Steps 1 (centrifugation) and 2 (dilution) are the common steps of all processes, and P1 only performs steps 1 and 2, P2 performs steps 1, 2 and 3 (microporous membrane filtration), P3 performs steps 1, 2, 3 and 4 (PEG prrecipitation), and P4 performs steps 1, 2, 3, 4 and 5 (chloroform treatment)圖1 從山羊瘤胃液中分離富集病毒組分的流程示意圖Fig.1 Schematic representation of the procedures for the extraction of viruses from goat rumen fluid

離心:將解凍瘤胃液在4℃下以5 000×g離心15 min,將液體部分轉(zhuǎn)移至新的無菌離心管中,以去除瘤胃液樣品中的飼料殘?jiān)?接著在4℃下以15 000×g轉(zhuǎn)速離心30 min,以去除其他小顆粒碎片,收集上清液。

稀釋:將上述含有游離病毒樣顆粒的上清液與預(yù)冷的SM緩沖液(200 mmol·L-1NaCl, 10 mmol·L-1MgSO4, 50 mmol·L-1Tris pH 7.5)進(jìn)行 1∶2稀釋。

過濾:通過1.0 μm的玻璃纖維濾紙(Whatman,GF/C,UK)過濾,以去除瘤胃液中的粒徑較大的細(xì)菌、原蟲等,隨后經(jīng)過孔徑為0.45 μm的PVDF無菌濾膜(Millipore Billerica,MA,USA)過濾,進(jìn)一步去除細(xì)菌等。

PEG沉淀:將200 g PEG8000與146.1 g NaCl溶于1 L蒸餾水中,經(jīng)高壓蒸汽滅菌后獲得PEG-NaCl溶液。將過濾步驟后得到的上清液轉(zhuǎn)移到新離心管中,向每個(gè)樣品中加入25%(v/v)的PEG-NaCl溶液,于4 ℃下震蕩孵育22 h,孵育結(jié)束后將樣品于4 ℃、13 000×g離心45 min,棄上清,沉淀即為病毒組分,并將其溶解于1 mL預(yù)冷的0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(PBS)中。

氯仿處理:向獲得的病毒組分濃縮液中加入等體積的氯仿,渦旋1 min,使氯仿與樣品均勻混合,形成乳狀物,于4℃、15 000×g離心5 min,小心吸取上清液至新的無菌離心管,即為病毒組分。

1.3 瘤胃液基因組DNA提取

核酸酶處理:在提取DNA之前,用1.25 μL DNase I和1.25 μL RNase A處理樣品30 min,以消除游離DNA和RNA污染,隨后在37 ℃水浴中孵育10 min,接著加入1 μL 100 mmol·L-1EDTA使核酸酶失活,最后在65 ℃下水浴孵育10 min終止EDTA反應(yīng)。使用DNA提取試劑盒(Omega D3892-01Viral DNA Kit, USA)提取制備的瘤胃液病毒組分樣品的核酸,提取步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。完成病毒基因組DNA抽提后,使用Qubit?DNA廣譜分析儀(ThermoFisher Scientific)測(cè)定濃度、OD260 nm/280 nm及OD260 nm/230 nm,并使用1.0%(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA的完整性。提取的DNA樣品儲(chǔ)存在-20 ℃,直至文庫制備及測(cè)序。檢測(cè)合格的DNA樣品采用Covaris M220超聲破碎儀將樣品DNA隨機(jī)打斷成長(zhǎng)度約為450 bp的片段,經(jīng)末端修復(fù)、加入A尾、加測(cè)序接頭、純化、PCR全基因組擴(kuò)增等步驟完成文庫制備,質(zhì)檢合格的文庫將采用Illumina Novaseq 6000平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序(上海凌恩生物技術(shù)有限公司)。

1.4 數(shù)據(jù)質(zhì)控

由于Illumina Novaseq 6000的原始測(cè)序數(shù)據(jù)中包含測(cè)序接頭序列、低質(zhì)量讀段、N率較高序列及長(zhǎng)度過短序列,這將嚴(yán)重影響后續(xù)組裝的質(zhì)量。為保證后續(xù)的生物信息分析的準(zhǔn)確性,首先對(duì)下機(jī)的原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控,過濾掉低質(zhì)量片段和宿主片段從而得到高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)(clean data),以保證后續(xù)分析的順利。原始數(shù)據(jù)已遞交GenBank,登錄號(hào)為PRJNA788346。

1.5 生物信息學(xué)分析

按照Roux等[15]描述的方法,使用Megahit(https://github.com/voutcn/megahit)對(duì)高質(zhì)量序列進(jìn)行拼接、組裝,挑選≥ 2 000 bp的組裝序列,使用如下軟件進(jìn)行病毒序列鑒定:VirFinder(https://github.com/jessieren/VirFinder)、VirSorter2 (https://github.com/simroux/VirSorter)、CAT(https://github.com/dutilh/CAT),并對(duì)初步鑒定為病毒的序列進(jìn)行vOTUs(viral operational taxonomic units)分析。鑒定得到病毒序列后,獲得其物種分類學(xué)信息,并使用VPF-Class工具對(duì)病毒進(jìn)行物種注釋和宿主預(yù)測(cè)。挑選置信度(Confidence_Score)> 0.36的結(jié)果,進(jìn)行病毒科水平物種注釋;挑選置信度(Confidence_Score)> 0.5且成員比對(duì)率(Membership_Ratio)超過0.3的結(jié)果,進(jìn)行病毒(噬菌體)潛在宿主預(yù)測(cè)[16]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel(Microsoft Inc., Washington, USA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步統(tǒng)計(jì),隨后用SPSS 19.0(SPSS Inc., Chicago,USA)對(duì)不同流程提取的基因組DNA質(zhì)量相關(guān)指標(biāo) 進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)[17]。對(duì)宏基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn),符合方差分析的數(shù)據(jù)用SPSS進(jìn)行ANOVA分析,不符合方差分析的數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行非參數(shù)分析,P<0.01表示差異極顯著, 0.01≤P<0.05表示差異顯著,0.05 ≤P<0.10表示存在趨勢(shì)。瘤胃液病毒相對(duì)豐度圖、箱線圖分別利用凌恩生物在線云平臺(tái)(http://cloud.biomicroclass.com/CloudPlatform)和聯(lián)川生物在線云平臺(tái)(https://www.omicstudio.cn/tool)的工具在線繪制。

2 結(jié) 果

2.1 不同提取流程對(duì)瘤胃病毒核酸提取質(zhì)量的影響

各流程提取的基因組DNA質(zhì)檢結(jié)果見圖2。由圖2a可知,P2流程中DNA產(chǎn)量顯著高于P1、P3和P4處理流程(P<0.001)。P1、P2與P3流程獲得的DNA的OD260 nm/280 nm均> 1.90,說明提取的核酸相對(duì)純凈(圖2b)。經(jīng)氯仿處理(P4)的基因組核酸DNA,因產(chǎn)量過低(圖2a)而不滿足高通量測(cè)序需求,故沒有進(jìn)行后續(xù)上機(jī)建庫及組學(xué)分析。

a. 核酸濃度;b. 核酸純度。*表示P<0.05,**表示P<0.01a. Concentration of nucleic acids; b. Quality of nucleic acids. * P<0.05 and ** P<0.01圖2 四種流程處理后所提取的山羊瘤胃液病毒組分的核酸質(zhì)量(n=3)Fig.2 Quality of nucleic acids of ruminal viral-like particles extracted from the goat rumen fluid in four groups (n=3)

2.2 不同提取流程對(duì)瘤胃病毒群落α多樣性的影響

使用Illumina Novaseq 6000平臺(tái)對(duì)符合測(cè)序要求的9個(gè)樣本進(jìn)行了病毒宏基因組學(xué)測(cè)序,共獲得1 058 773 724個(gè)reads,每個(gè)樣品的平均reads數(shù)為117 641 525,范圍為105 495 627至125 358 829。不同提取流程的瘤胃病毒α多樣性指數(shù)見圖3,不同提取流程對(duì)測(cè)序時(shí)獲得的goods_coverage比例沒有顯著影響(圖3a),同時(shí)不同流程間Chao 1指數(shù)(P=0.834)和Shannon指數(shù)(P=0.255)均無顯著差異。

a. goods_ coverage; b. Chao 1指數(shù),用于估計(jì)群落中vOTU豐度;c. Shannon指數(shù),用來描述群落中病毒多樣性a. goods_ coverage; b. Chao 1 index, represents the richness of vOTU; c. Shannon index, represents the diversity of virus圖3 不同處理流程獲得的瘤胃液病毒的α多樣性指數(shù)Fig.3 Alpha diversity indexes of ruminal virome obtained from different processing procedure

2.3 不同提取流程對(duì)瘤胃病毒群落β多樣性的影響

為評(píng)估不同樣品處理流程對(duì)瘤胃病毒群落組成的影響,進(jìn)行了基于Bray-Curtis距離的PCoA分析及ANOSIM分析。在PCoA圖中,P2流程與P1和P3在PCoA2上分開(26.01),但差異不顯著(ANOSIM R=0.695,P>0.05;圖4)。結(jié)果表明,雖然不同DNA提取流程會(huì)導(dǎo)致病毒群落組成的差異,但對(duì)群落組成的影響較小。

圖4 不同處理流程對(duì)瘤胃病毒組分的主坐標(biāo)分析(基于Bray-Curtis距離,n=3)Fig.4 Principal co-ordinates analysis based on Bray-Curtis distances of ruminal virome obtained from different processing procedure (n=3)

2.4 不同提取流程對(duì)瘤胃病毒群落分類學(xué)特征的影響

宏基因組測(cè)序結(jié)果表明,不論采用何種瘤胃液樣品病毒組分富集流程,均顯示山羊瘤胃中的DNA病毒主要為噬菌體(圖5)。其中,絕大多數(shù)噬菌體序列來自長(zhǎng)尾病毒科(Siphoviridae,63.29%)、肌尾病毒科(Myoviridae,11.87%)和短尾病毒科(Podoviridae,5.64%),這3個(gè)病毒科同屬于有尾病毒目(Caudovirales)。進(jìn)一步分析了不同富集流程對(duì)瘤胃病毒相對(duì)豐度的影響,結(jié)果表明PEG處理對(duì)Siphoviridae(P<0.05)及Ackermannviridae科(P<0.01)的病毒有顯著富集效果(圖6)。

a. 總體瘤胃微生物組成;b. 總體病毒組分組成;c. 不同處理流程瘤胃液中病毒相對(duì)豐度(科水平)a. Overall composition of rumen microbial; b. Overall composition virus-particles; c. Relative abundance of viruses in different processing procedures (family level)圖5 黑山羊瘤胃液中微生物組成Fig.5 Composition of rumen microbial of black goat

*表示P<0.05,**表示P<0.01* means P<0.05 and ** means P<0.01圖6 在不同流程中病毒相對(duì)豐度(n=3)Fig.6 Relative abundance of viral family in different processing procedures (n=3)

圖7 山羊瘤胃病毒群落的潛在宿主種類預(yù)測(cè)Fig.7 Prediction of potential hosts of ruminal viruses in rumen fluid of goats

2.5 瘤胃病毒群落宿主預(yù)測(cè)

利用VPF-Class工具對(duì)山羊瘤胃中最豐富的4個(gè)DNA病毒科噬菌體成員進(jìn)行了宿主預(yù)測(cè),并列出了噬菌體與宿主間的對(duì)應(yīng)關(guān)系(圖6)。結(jié)果顯示瘤胃病毒的宿主多為細(xì)菌,優(yōu)勢(shì)宿主預(yù)測(cè)排序結(jié)果為:節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、噬纖維素屬(Cellulophaga)、梭菌屬(Clostridium)、乳酸球菌屬(Lactococcus)、分岐桿菌屬(Mycobacterium)、綠膿桿菌屬(Pseudomonas)、里氏桿菌屬(Riemerella)、鏈球菌屬(Streptococcus)。其中,Myoviridae科的噬菌體主要侵染芽孢桿菌屬(Bacillus)細(xì)菌,Podoviridae科的噬菌體主要侵染噬纖維素屬(Cellulophaga)的細(xì)菌,而Siphoviridae科的噬菌體主要侵染芽孢桿菌屬(Bacillus)、梭菌屬(Clostridium)、里氏桿菌屬(Riemerella)和噬纖維素屬(Cellulophaga)等屬的細(xì)菌。

2.6 不同生境病毒群落比較

本研究將山羊瘤胃病毒群落與其他環(huán)境,如人類糞便[4]、海洋[5]或土壤[6]病毒群落進(jìn)行比較(圖8)。結(jié)果表明,不同生境中病毒群落構(gòu)成存在很大差異:在生境病毒群落多樣性方面,以土壤生境最高;在病毒群落相對(duì)豐度方面,人類糞便和山羊瘤胃病毒群落的相似性更高,均為以Siphoviridae科的病毒為主,但二者又有區(qū)別,體現(xiàn)在山羊瘤胃病毒群落具有更高豐度的Myoviridae科病毒;在病毒核酸類型方面,人類糞便和山羊瘤胃中的DNA病毒以雙鏈DNA(double-strain DNA,dsDNA)病毒為主,而土壤生境中還含有微病毒科(Microviridae)、球狀病毒科(Globuloviridae)、矮化病毒科(Nanoviridae)等單鏈DNA(single-strain DNA,ss-DNA)病毒。

圖8 山羊瘤胃液、人類糞便[4]、海水[5]及土壤[6]中的病毒相對(duì)豐度Fig.8 Relative abundance of viral communities in goat rumen fluid, human faeces[4], seawater[5] and soil[6]

3 討 論

瘤胃微生物組成十分復(fù)雜,絕大多數(shù)瘤胃細(xì)菌是嚴(yán)格厭氧或兼性厭氧,且目前僅有很少的瘤胃細(xì)菌被分離培養(yǎng),這導(dǎo)致基于傳統(tǒng)培養(yǎng)手段的瘤胃病毒(主要是噬菌體)研究開展起來困難重重。近年來宏基因組學(xué)廣泛運(yùn)用于動(dòng)物胃腸道微生態(tài)的研究,可規(guī)避體外培養(yǎng)微生物的限制。該技術(shù)也逐步應(yīng)用于病毒組的研究,借助各種生物信息學(xué)分析工具,極大地推進(jìn)了病毒特異性序列數(shù)據(jù)集(病毒組)的獲取和分析[18]。高通量測(cè)序過程中,樣品DNA的質(zhì)量尤為關(guān)鍵,提高瘤胃病毒組分基因組DNA的產(chǎn)量及質(zhì)量,可以有效地提高后續(xù)生物信息學(xué)分析的準(zhǔn)確性。在核酸提取和上機(jī)測(cè)序之前,病毒組分預(yù)處理的主要作用為病毒富集和病毒純化[11]。具體步驟需要根據(jù)所研究的樣本類型進(jìn)行調(diào)整。本研究參考Castro-Mejía等[13]提出的方法,設(shè)置了4種流程來評(píng)估過濾步驟、PEG沉淀以及氯仿處理對(duì)DNA提取質(zhì)量以及宏基因組測(cè)序結(jié)果的影響。

OD260 nm/280 nm是衡量DNA提取質(zhì)量的重要指標(biāo),會(huì)受RNA污染以及DNA降解的影響[19]。P3流程所獲得的核酸產(chǎn)量并不是最高的,但P3流程OD260 nm/280 nm在數(shù)值上最高,P4流程所獲得的核酸產(chǎn)量最低。病毒學(xué)研究過程中常使用傳統(tǒng)的苯酚-氯仿提取法對(duì)病毒基因組進(jìn)行提取[20],而如今市場(chǎng)上已經(jīng)出現(xiàn)了多款用于從環(huán)境樣品中提取病毒基因組DNA的試劑盒[9,21]。本研究選用了價(jià)格為Qiagen試劑盒1/5的Omega病毒DNA提取試劑盒,該試劑盒原用于提取血清病毒基因組,本研究表明,該試劑盒也能用于提取瘤胃液樣品中的病毒基因組,且滿足測(cè)序需求。

不同流程間瘤胃病毒多樣性并沒有顯著差異,這可能是由于病毒組在整體微生物組中所占比例過小,正如Hess等[22]報(bào)道的,即使在大多數(shù)環(huán)境中噬菌體的數(shù)量級(jí)為細(xì)菌的10倍,但由于宿主DNA(細(xì)菌和真核生物)的污染,病毒reads只占可注釋DNA的2%～5%。

病毒群落結(jié)構(gòu)分析表明,本試驗(yàn)選用的山羊瘤胃中的優(yōu)勢(shì)病毒群落依次為長(zhǎng)尾病毒科(Siphoviridae)、肌尾病毒科(Myoviridae)和短尾病毒科(Podoviridae),這與前人發(fā)表的瘤胃病毒群落以長(zhǎng)尾病毒科、肌尾病毒科和短尾病毒科占主導(dǎo)地位一致[9]。過濾步驟需考慮濾膜孔徑大小,常用微孔濾膜孔徑為0.22或0.45 μm。先前研究表明胃腸道中最豐富的長(zhǎng)尾病毒科(Siphoviridae)及肌尾病毒科(Myoviridae)都大于0.22 μm[9],故本研究選用了孔徑為0.45 μm的微孔濾膜。本研究中豐度最高的為長(zhǎng)尾病毒科(Siphoviridae),也證明了0.45 μm濾膜的有效性。由于病毒顆粒小,在核酸提取之前,通常使用PEG配合NaCl來沉淀樣品中的VLPs以實(shí)現(xiàn)病毒的濃縮。本研究表明,PEG可顯著富集有尾病毒目中的長(zhǎng)尾病毒科(Siphoviridae)及Ackermannviridae科噬菌體。本研究還發(fā)現(xiàn)皰疹病毒科(Herpesviridae)的病毒在該瘤胃液樣本中的存在,但豐度十分低。

CsCl密度梯度離心步驟被認(rèn)為是純化病毒的最佳方法[12],此法可對(duì)特定密度范圍內(nèi)的噬菌體進(jìn)行純化,并根據(jù)密度將VLPs與其他組分分離。但這一技術(shù)耗時(shí)、昂貴且需要特定的技術(shù)技能和實(shí)驗(yàn)室設(shè)備。有研究發(fā)現(xiàn),氯仿處理能代替氯化銫密度梯度離心步驟用于純化病毒[23],此方法已成功用于血清病毒純化和發(fā)酵食品病毒純化[24-25]。但本研究發(fā)現(xiàn),氯仿處理在瘤胃液病毒純化中會(huì)造成大量顆粒損失,以至于不能滿足高通量測(cè)序的需求。這是因?yàn)榱鑫讣?xì)菌仍為瘤胃液的主要部分,氯仿會(huì)嚴(yán)重干擾包膜類物質(zhì),比如細(xì)菌,而且有些病毒也存在膜結(jié)構(gòu),膜結(jié)構(gòu)被破壞后,病毒的蛋白質(zhì)外殼會(huì)變得不穩(wěn)定[26]。而部分病毒蛋白質(zhì)外殼也對(duì)氯仿十分敏感,氯仿處理則造成這類病毒的大量丟失[27]。DNA產(chǎn)量也因此出現(xiàn)顯著差異,P4提取流程的核酸因產(chǎn)量過低,不適用于高通量測(cè)序建庫。因此,氯仿處理代替CsCl密度梯度離心步驟用于純化瘤胃病毒還有待后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步研究。

環(huán)境中病毒的多樣性和豐度與微生物群落息息相關(guān)。有研究表明同一環(huán)境中病毒群落具有很高的相似性,而來自不同環(huán)境的病毒及其宿主分布的相似性較低[28-30]。反芻動(dòng)物會(huì)從外界攝入大量食物,瘤胃作為一個(gè)天然發(fā)酵罐,微生物群落共生于一個(gè)相對(duì)封閉的容器中,這導(dǎo)致瘤胃微生物具有非常獨(dú)特的群落特征[1],瘤胃液中病毒的豐富度反映了瘤胃微生物宿主的多樣性。由于病毒宏基因組學(xué)建庫限制以及測(cè)序平臺(tái)對(duì)核酸樣品擴(kuò)增的需求,本研究主只檢測(cè)了山羊瘤胃液中的DNA病毒,發(fā)現(xiàn)樣品中主要為dsDNA病毒,它們都屬于有尾病毒目。之前的大量研究也表明瘤胃病毒以dsDNA為主,其中大部分為有尾病毒目的噬菌體[9,21,31-32]。另外,由于技術(shù)的局限性,本方法提取的DNA不一定滿足長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序平臺(tái),例如PacBio(www.pacb.com)or Oxford Nanopore(https://nanoporetech.com)。此外,本試驗(yàn)只關(guān)注了病毒組分中dsDNA的核酸,此病毒組分富集方法是否適用于ssDNA或RNA病毒尚不清楚[33]。

4 結(jié) 論

本研究比較了不同DNA提取流程對(duì)核酸產(chǎn)量、質(zhì)量、病毒多樣性以及病毒概況的影響,表明了PEG沉淀步驟對(duì)長(zhǎng)尾病毒科及Ackermannviridae科噬菌體具有富集作用。研究人員可根據(jù)試驗(yàn)需求進(jìn)行選擇,當(dāng)需要重點(diǎn)關(guān)注這類噬菌體的情況下,可采用P3流程,即對(duì)瘤胃液進(jìn)行離心、稀釋以及微孔濾膜過濾操作,若對(duì)特定病毒沒有富集需求,則采用P2流程即可,即無需進(jìn)行微孔濾膜過濾步驟,此兩種流程均能達(dá)到病毒宏基因組測(cè)序要求?；谝陨辖Y(jié)果,本試驗(yàn)構(gòu)建了提取瘤胃液中病毒組分DNA的流程,此方案可大大促進(jìn)反芻動(dòng)物瘤胃液中噬菌體群落的研究進(jìn)程。