禹世雄,魏凌云,徐甜甜,焦金真,蔣林樹,賀志雄*

(1.武漢工程大學(xué)環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院,武漢 430205;2.中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 畜禽養(yǎng)殖污染控制與資源化技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室 湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)生理與代謝過(guò)程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長(zhǎng)沙 410125;3.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院奶牛營(yíng)養(yǎng)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 102206)

反芻動(dòng)物腸道中存在著豐富的微生物群落,其數(shù)量大且種類多樣。腸道微生物與宿主相互依存影響,構(gòu)成了以細(xì)菌占據(jù)主導(dǎo)地位的腸道微生物系統(tǒng)[1]。反芻動(dòng)物的腸道可分為小腸和大腸,不同腸段的化學(xué)性質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)情況以及免疫活性存在差異,這些差異影響了不同腸段腸道微生物群落的組成。

1 腸道微生物的功能

雖然腸道微生物在不同腸段的組成存在差異,但總體功能可大致分為營(yíng)養(yǎng)代謝、免疫和維持腸道穩(wěn)態(tài)[2]。

1.1 營(yíng)養(yǎng)與代謝功能

腸道微生物除了能夠合成多種氨基酸和蛋白質(zhì)外,其具備的一些代謝特性是宿主本身不具備的。例如,反芻動(dòng)物自身不能合成降解纖維素的酶系,主要依賴腸道中具有纖維素分解活性的微生物來(lái)分解食物中纖維素,其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如淀粉、脂肪和蛋白質(zhì)等的分解利用需要腸道微生物的參與。分解后得到的小分子產(chǎn)物需要通過(guò)腸道及其他組織的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)部發(fā)揮作用[3],而腸道中部分微生物能夠增加轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的含量[4]。這種腸道微生物與宿主共生的關(guān)系極大提高了能量的利用率,對(duì)宿主的營(yíng)養(yǎng)與代謝具有深遠(yuǎn)的影響。

1.2 免疫功能

腸道微生物與宿主免疫系統(tǒng)間存在著密切的交流和協(xié)作機(jī)制。腸道微生物產(chǎn)生的短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFA)可作為能源物質(zhì)被腸道上皮細(xì)胞和外周組織吸收,從而使腸屏障發(fā)揮正常的免疫功能[5]。Petersson等[6]發(fā)現(xiàn),在沒(méi)有腸道微生物群的情況下,腸道上皮和黏膜免疫系統(tǒng)的發(fā)育減緩,黏液屏障的厚度變薄,但是將微生物產(chǎn)生的脂多糖和肽聚糖注射到結(jié)腸黏膜表面后,能刺激腸道黏液的產(chǎn)生,使腸道黏液層的厚度在40 min內(nèi)恢復(fù)到正常厚度。腸道黏液層是貫穿胃腸道的重要生物學(xué)屏障,能夠阻止致病菌的定植[7],該研究表明腸道微生物在腸黏膜發(fā)揮免疫過(guò)程中至關(guān)重要。

新生反芻動(dòng)物腸道中含有較高豐度的致病菌,如大腸桿菌(Escherichiacoli)、志賀菌屬(Shigellagenera)和沙門菌(Salmonella)等,容易引起動(dòng)物腹瀉,是斷奶前犢牛死亡率高的主要原因[8]。腸道微生物通過(guò)兩種方式調(diào)節(jié)宿主腸道黏膜免疫,一種是增強(qiáng)宿主腸道生物學(xué)屏障,阻止病原菌的定植,另一種通過(guò)其特定組分刺激免疫細(xì)胞如Tregs細(xì)胞、Th17細(xì)胞的分化,從而增強(qiáng)宿主免疫功能[9]。

1.3 維持腸道穩(wěn)態(tài)

健康的腸道環(huán)境是平衡而穩(wěn)定的,腸道穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)主要由腸道微生物進(jìn)行。幼齡動(dòng)物腸道微生物的定植受物種間競(jìng)爭(zhēng)及環(huán)境因素的制約,這兩者共同決定了腸道微生物群的組成。環(huán)境因素包括飲食、宿主來(lái)源的產(chǎn)物及微生物來(lái)源的產(chǎn)物。如腸道中的雙歧桿菌(Bifidobacterium)和乳酸桿菌(Lactobacillus)會(huì)分解低聚糖產(chǎn)生酸類物質(zhì),使腸道內(nèi)pH降低,抑制病原菌的生長(zhǎng)與繁殖[10]。另外,飲食攝入的益生元可以在結(jié)腸中被益生菌發(fā)酵并產(chǎn)生SCFA[11],當(dāng)SCFA濃度升高時(shí)可抑制沙門菌等有害菌的生長(zhǎng)[12]。致病性大腸桿菌是引起新生犢牛腹瀉的主要原因,在犢牛出生后的第1周飼喂雙歧桿菌和乳酸桿菌可以有效降低新生犢牛的腹瀉發(fā)生率[13],一旦腸道微生物群發(fā)展成熟,微生物間競(jìng)爭(zhēng)及環(huán)境因素就能阻止新的微生物定植,防止感染。但過(guò)多的致病菌能夠通過(guò)其毒力因子引發(fā)腸道炎癥反應(yīng)來(lái)克服這種定植抵抗。因此腸道微生物在維持腸道穩(wěn)態(tài)上有著重要意義,腸道微生物群失調(diào)意味著腸道穩(wěn)態(tài)的破壞。

2 腸道微生物的定植規(guī)律

人們普遍認(rèn)為新生兒腸道是無(wú)菌的[14],微生物群落在出生后開始迅速定植[15]。但最新的研究表明,在生產(chǎn)前新生兒腸道便存在著低多樣性、低生物量的具有代謝活性的微生物群落[16]。Smith[17]的研究表明,大腸桿菌和鏈球菌(Streptococcus)在出生后8 h內(nèi)定植于犢牛腸道的所有區(qū)域,在出生8 h后,產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)開始在犢牛的盲腸中定植,并在產(chǎn)后18 h能在其他腸道區(qū)域檢測(cè)到[18]。產(chǎn)氣莢膜梭菌可以發(fā)酵葡萄糖、乳糖和蔗糖等物質(zhì)產(chǎn)生SCFA,作為能源物質(zhì)供宿主使用。產(chǎn)氣莢膜梭菌在生命初期就開始在腸道中定植,與反芻動(dòng)物生命初期的飲食習(xí)慣相適應(yīng)。在出生后第1天,能檢測(cè)到乳酸桿菌,并且在出生后1周齡內(nèi)在腸道的所有區(qū)域占優(yōu)勢(shì)。出生后第2天,盲腸和糞便中檢測(cè)到類桿菌(Bacteroides)[17],3～7日齡犢牛的腸道中雙歧桿菌和乳酸桿菌的比例較高,但大腸桿菌的含量較低。這些研究表明,腸道的初始定植菌主要是需氧和兼性厭氧細(xì)菌,通過(guò)消耗可用的氧氣來(lái)創(chuàng)建厭氧環(huán)境,以利于專性厭氧腸道微生物群,如雙歧桿菌和類桿菌的定植,這與腸道細(xì)菌在其他新生哺乳動(dòng)物中的定植進(jìn)化相似[18]。

出生24 h后,鏈球菌和腸桿菌(Enterobacteriaceae)在腸道中大量存在,在犢牛的后腸道中檢測(cè)到了很高豐度的大腸桿菌、志賀菌屬以及少量的致病菌,如沙門菌及腸球菌(Enterococcus)等[19]。說(shuō)明在生命早期,新生犢牛易患上腸道疾病,可能導(dǎo)致死亡。這也是目前畜牧業(yè)所面臨的一個(gè)重要挑戰(zhàn),加強(qiáng)對(duì)幼齡反芻動(dòng)物腸道微生物調(diào)控的研究對(duì)提高新生兒存活率具有重要意義。

在出生后24 h還檢測(cè)到了相對(duì)豐度極低的乳酸桿菌的存在,表明嚴(yán)格厭氧菌此時(shí)已經(jīng)開始在腸道中定植,擬桿菌在乳酸桿菌之后定植,犢牛出生2 d后在可在盲腸和糞便中檢測(cè)到[17,19]。新生反芻動(dòng)物的飲食大多為初乳,富含糖、脂、蛋白質(zhì)等物質(zhì),但是研究發(fā)現(xiàn),在3～5日齡的犢牛腸道中就已經(jīng)有了少量纖維素降解細(xì)菌的存在,而且它們的數(shù)量會(huì)在2～3周齡時(shí)變的豐富[20]。一般來(lái)說(shuō),反芻動(dòng)物在出生3～4周齡時(shí)會(huì)逐漸開始攝入少量飼料,但是由于在生命早期瘤胃還沒(méi)有發(fā)育完全,不能通過(guò)瘤胃發(fā)酵攝入纖維素等物質(zhì),因此,來(lái)自后腸道的能量可能是犢牛在這個(gè)階段的主要能量來(lái)源,對(duì)生命最初幾周齡的幼齡反芻動(dòng)物來(lái)說(shuō),后腸道微生物發(fā)酵更加重要[21]。

反芻動(dòng)物出生7 d后,腸道微生物的物種多樣性再次增加,多樣性在門水平上已經(jīng)和成年反芻動(dòng)物相似,之前豐度最高的變形菌門(Proteobacteria)逐漸被厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門、擬桿菌門和放線菌門(Actinobacteria)所替代。在檢測(cè)的腸道區(qū)域中,普氏棲糞桿菌(Faecalibacteriumprausnitzii)、擬桿菌屬占據(jù)了主導(dǎo)地位,其次是乳酸桿菌、丁酸球菌(Butyricicoccus)和雙歧桿菌等,但是隨著年齡的增加,普氏棲糞桿菌在總菌群中所占比例會(huì)逐漸降低,而乳桿菌和雙歧桿菌的相對(duì)豐度在逐漸升高[19]。產(chǎn)后5周齡,在犢牛消化道內(nèi)觀察到黃色瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)和其他纖維降解菌,但是未觀察到鏈球菌屬和乳球菌屬(Lactococcuslactis)[22]。這種現(xiàn)象表明,在出生后5周齡,生命最早期定植的好氧菌和兼性厭氧菌基本被其他厭氧菌群取代,并且腸道內(nèi)已經(jīng)定植了大量的纖維素降解細(xì)菌,腸道微生物發(fā)酵產(chǎn)生的SCFA為幼齡反芻動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育提供了能量來(lái)源。

到了6～8周齡時(shí),犢牛腸道微生物組成和成年牛相似,厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門占主導(dǎo)地位。另外,腸道中早期定植的好氧和兼性厭氧菌群下降到了一個(gè)恒定的水平,并被雙歧桿菌和乳酸桿菌等嚴(yán)格厭氧菌取代[23]。對(duì)成年奶牛糞便中的微生物進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序發(fā)現(xiàn),在門水平上,厚壁菌門(637%)和變形菌門(183%)是主要優(yōu)勢(shì)菌,其次是擬桿菌門(76%)和放線菌門(68%),其他菌門僅占很小一部分[24]。成年反芻動(dòng)物不同于幼齡反芻動(dòng)物,它們的飲食主要為植物,富含大量纖維素,所以和能量代謝相關(guān)的擬桿菌門在成年反芻動(dòng)物腸道中則為絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)菌群,大約占總細(xì)菌的70%以上,且基本上為普雷沃氏菌(Prevotella)[25]。本文總結(jié)的新生反芻動(dòng)物從出生到8周齡腸道微生物的定植規(guī)律如圖1所示。最初定植的是需氧及兼性厭氧菌,24 h后嚴(yán)格厭氧菌開始定植,且有致病菌定植。3～5日內(nèi)有少量的纖維素降解菌定植,1周齡后腸道微生物豐富度增加,門水平上已與成年動(dòng)物相似。5周齡后最初定植的需氧及兼性厭氧菌已經(jīng)被嚴(yán)格厭氧菌取代,6～8周齡腸道微生物組成已與成年動(dòng)物相似。

圖1 新生反芻動(dòng)物從出生到8周齡腸道微生物的定植規(guī)律Fig.1 Colonization pattern of gut microorganisms in newborn ruminants from birth to 8 weeks old

3 早期腸道微生物群定植的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控手段

3.1 日糧調(diào)控

新生反芻動(dòng)物需要飼喂初乳,其飼喂策略會(huì)顯著影響生命初期腸道微生物定植。Fischer等[26]研究表明,延遲初乳飼喂會(huì)延緩腸道微生物的定植過(guò)程,從而導(dǎo)致動(dòng)物斷奶前潛在的感染風(fēng)險(xiǎn)。在生產(chǎn)中,為了減少病原菌污染,加熱初乳也是一種常見策略,有研究表明,在出生后的12 h內(nèi)喂食經(jīng)過(guò)熱處理的初乳可以增加雙歧桿菌,減少大腸桿菌在犢牛小腸的定植[27]。同時(shí),有研究嘗試向初乳中添加日糧添加劑以改善反芻動(dòng)物生命初期的健康,例如Yang等[28]向初乳中添加甘露寡糖,發(fā)現(xiàn)向初乳中添加甘露寡糖能促進(jìn)乳酸菌的定植。

斷奶期間,反芻動(dòng)物腸道微生物發(fā)生劇烈變化,斷奶前的日糧組成是變化的主要因素。斷奶過(guò)程中固體飼料的添加是調(diào)控腸道微生物定植的一個(gè)關(guān)鍵窗口,隨著固體飼料逐漸替代母乳,降解纖維素的腸道細(xì)菌如普雷沃氏菌和瘤胃球菌(Ruminococcus)所占比例逐漸增加,最終成為優(yōu)勢(shì)菌[29]。為了使幼齡反芻動(dòng)物順利斷奶,生產(chǎn)中常用開食料進(jìn)行母乳與飼料間的過(guò)渡,開食料中的淀粉也是影響腸道微生物定植的因素。戴求仲等[30]研究表明,提高飼糧直/支鏈淀粉比值能增加后腸道中腸球菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量,減少大腸桿菌數(shù)量。

3.2 益生菌和益生元等

益生菌是有活性的微生物,可以通過(guò)改善宿主腸道微生物平衡而對(duì)宿主產(chǎn)生有益影響,其作為飼料添加劑而被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)中[3]。常見的益生菌有乳酸桿菌、酵母菌(Saccharomyces)、芽孢桿菌(Bacillus)、雙歧桿菌等。雙歧桿菌和乳酸桿菌可以定植和黏附在新生兒的腸道黏膜上,與致病細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng),從而減少腹瀉的發(fā)生率,增加幼齡反芻動(dòng)物的體重[31]。Zhao等[32]給斷奶前的犢牛飼喂益生菌,將從成年牛的糞便和組織中分離出來(lái)的益生菌添加到飼糧中飼喂給斷奶前的犢牛,雖然沒(méi)有改變糞便細(xì)菌的豐富度和多樣性,但是益生菌處理組的犢牛糞便中的發(fā)酵菌和有益菌的數(shù)量明顯增多,一些條件致病菌如蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、阪崎腸桿菌(Enterobactersakazakii)的生長(zhǎng)受到明顯抑制,有效減少腸道中病原性大腸桿菌O157:H7的數(shù)量。但He等[33]研究發(fā)現(xiàn),在新生犢牛的代乳粉中補(bǔ)充酵母菌并沒(méi)有影響犢牛的采食量、平均日增重和糞便評(píng)分等,對(duì)引起腹瀉的大腸桿菌以及腸道有益菌的影響都微乎其微,在犢牛沒(méi)有疾病的情況下,喂養(yǎng)酵母益生菌對(duì)犢牛的生長(zhǎng)性能和健康沒(méi)有明顯效果。腸道微生物會(huì)隨著時(shí)間的推移產(chǎn)生變化,因此對(duì)于幼齡反芻動(dòng)物日糧添加益生菌的研究中也應(yīng)該注意年齡因素對(duì)結(jié)果的影響。

益生元指一些不被宿主消化吸收,能夠選擇性地促進(jìn)體內(nèi)有益菌的代謝和增殖,從而改善宿主健康的有機(jī)物質(zhì)。常見的益生元有低聚糖類、微藻類、多糖類、蛋白質(zhì)水解物及天然植物提取物等。有研究表明,添加低聚果糖能選擇性地促進(jìn)雙歧桿菌、羅伊氏乳桿菌和韋榮氏球菌在瘤胃及后腸道定植,顯著抑制了沙門菌和大腸桿菌在腸道上皮的黏附[34]。Sharma等[35]的研究發(fā)現(xiàn),以每頭犢牛4 g·d-1的甘露寡糖作為益生元添加到5～7日齡的犢牛的飼糧中,可以在犢牛糞便中檢測(cè)到更多的乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量,減少糞便中大腸桿菌的數(shù)量,還可以改善犢牛的采食量,提高飼料轉(zhuǎn)化率。腸道中許多革蘭陰性細(xì)菌依靠菌毛附著于腸上皮,甘露寡糖會(huì)與這些細(xì)菌的菌毛特異性結(jié)合,從而使它們不能黏附于腸上皮,而且甘露寡糖在小腸中不能被酶消化,所以與甘露寡糖結(jié)合的病原性細(xì)菌很可能不與上皮細(xì)胞結(jié)合就離開了腸道[36]。此外,甘露寡糖還會(huì)被腸道中的雙歧桿菌和乳酸菌分解為短鏈脂肪酸,降低腸道pH,從而抑制致病細(xì)菌生長(zhǎng)[37]。同樣,Castro等[38]也發(fā)現(xiàn),給新生犢牛的代乳粉中添加低聚半乳糖可以增加結(jié)腸中乳酸桿菌和雙歧桿菌相對(duì)豐度且犢牛具有更發(fā)達(dá)的腸道上皮結(jié)構(gòu),還減少了糞桿菌屬、梭菌屬和螺旋菌屬等菌屬的相對(duì)豐度,不過(guò)這種結(jié)果在犢牛出生的前2周比較明顯,到了第4周時(shí)對(duì)照組和處理組沒(méi)有顯著差異,這可能說(shuō)明在整個(gè)腸道微生物定植過(guò)程的早期更容易受到影響。

將益生菌與益生元結(jié)合使用的生物制劑稱為合生元,能同時(shí)發(fā)揮益生菌和益生元的作用。接種新鮮的瘤胃液對(duì)幼齡反芻動(dòng)物有積極的影響。出生后接種新鮮的瘤胃液可以促進(jìn)瘤胃發(fā)育,增加斷奶前羔羊的平均日增重[39],但接種瘤胃液引起的腸道微生物變化仍不清楚。據(jù)報(bào)道,接種瘤胃液不僅促進(jìn)了羔羊結(jié)腸中微生物的定植,而且在斷奶時(shí)更容易從母乳過(guò)渡到固體飼料,這有利于反芻動(dòng)物在斷奶后階段的生長(zhǎng),將降低反芻動(dòng)物的負(fù)擔(dān)[40]。所以瘤胃液可視為一種潛在的益生元,在對(duì)反芻動(dòng)物腸道微生物的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控中具有一定價(jià)值。

后生元是益生菌經(jīng)加工處理后的益生菌代謝物成分統(tǒng)稱,包括菌體與代謝產(chǎn)物。有研究表明,在斷奶后羔羊的日糧中添加 0.9% 的植物乳桿菌 RG14 后生元可改善生長(zhǎng)性能、營(yíng)養(yǎng)攝入和營(yíng)養(yǎng)消化率[41]。說(shuō)明后生元是一種潛在的飼料添加劑,可用于促進(jìn)斷奶后反芻動(dòng)物的瘤胃發(fā)酵和生長(zhǎng)。

4 小 結(jié)

近年來(lái),對(duì)于反芻動(dòng)物胃腸道微生物的研究已經(jīng)越來(lái)越多,但是由于腸道內(nèi)微生物的種類較多且數(shù)量龐大,所以到目前為止,對(duì)反芻動(dòng)物胃腸道微生物的認(rèn)識(shí)仍有不足。與成年反芻動(dòng)物穩(wěn)定的腸道微生物群落不同,幼齡反芻動(dòng)物的腸道微生物群落需要經(jīng)歷一些明顯的特定時(shí)期變化,例如從非反芻期到反芻期,從斷奶前到斷奶后,從好氧細(xì)菌的定植到厭氧細(xì)菌取代好氧細(xì)菌。腸道微生物的改變窗口可能會(huì)成為針對(duì)腸道微生物定植的早期干預(yù)提供機(jī)會(huì),如添加益生菌和益生元,以增強(qiáng)免疫系統(tǒng),改善健康狀況,促進(jìn)幼齡反芻動(dòng)物的發(fā)育。

目前,對(duì)腸道微生物定植的最佳干預(yù)時(shí)間的研究還很少。此外,改變的腸道微生物如何影響幼齡反芻動(dòng)物的腸道微生物發(fā)展,以及對(duì)幼齡反芻動(dòng)物健康和發(fā)育的長(zhǎng)期影響值得進(jìn)一步研究。因此,有必要通過(guò)基于基因組學(xué)或代謝組學(xué)的方法進(jìn)一步識(shí)別關(guān)鍵元素,并探索特定腸道微生物的功能作用,更全面地了解腸道微生物群落的發(fā)展規(guī)律,以便有針對(duì)性地進(jìn)行調(diào)控。