文│張晶（福建省農產品質量安全檢驗檢測中心）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是豬中最嚴重、傳播最迅速的傳染病之一。豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）是豬繁殖與呼吸綜合征的直接病原體。

目前PCR是檢測PRRSV病毒標準而有效的診斷方法，具有較高的特異性和敏感性。但因其耗時較長，需要昂貴的設備、有經驗的技術人員和專業(yè)實驗室等限制了其進一步應用，尤其是即時現(xiàn)場檢測應用領域。因此，開發(fā)一種簡單、準確、快速的檢測方法至關重要。

環(huán)介導等溫擴增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是2000年由Notomi等提出的一種核酸等溫擴增方法，即針對特定靶標的6～8個區(qū)段設計的4～6條不同的引物，在恒定溫度（60～65℃）下15～60分鐘內實現(xiàn)109～1010倍的擴增，結果可通過熒光變化、溶液渾濁情況（擴增產生的副產物焦磷酸鎂白色沉淀為依據觀察白色沉淀）、比色法等進行判斷，具備高靈敏、高特異性、高效性、快速、簡便、易檢測等特點。LAMP技術是一種快速有效識別病原體感染的即時診斷技術，已廣泛應用于人類及動植物細菌、病毒、寄生蟲、真菌等病原體檢測，尤其在新型冠狀病毒SARS-CoV-2的檢測中發(fā)揮了重要作用。

本研究在RT-LAMP的基礎上建立了一種簡便、快速、靈敏的PRRSV檢測方法。筆者先是設計并篩選出高擴增性能的PRRSVRT-LAMP引物對，同時通過體系優(yōu)化添加化學試劑，進一步提高反應速率，縮短反應時間。最后對PRRSVRT-LAMP體系（包括熒光法、可視化檢測）性能進行評價。

一、材料與方法

1.P R R S V R T-L A M P 引物對設計與合成。我們以P R R S V SRV07菌株的基因組（GenBank No.JX 512910.2）為標準序列，采用BLAST在線網站（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）進行同源序列比對，而后用引物設計網站NEBRLAMP Primer Design Tool（https://lamp.neb.com）進行LAMP引物對設計。同時合成帶有PRRSV M基因14460-14810片段（GenBank No. JX512910.2）的PUC57為載體的質粒和RNA假病毒作為陽性參照。引物（表1）、質粒和RNA假病毒均由上海生工生物股份有限公司生產。

表1 PRRSV RT-LAMP引物對序列

2.PRRSV RT-LAMP引物對篩選。PRRSV RT-LAMP引物對篩選采用RT-LAMP實時熒光法。我們通過文獻選取了額外4組公開報道的用于PRRSV臨床樣本檢測驗證的LAMP引物對（表1），并與本研究所設計的LAMP引物對進行擴增效率比較，用以確定最佳檢測效率的引物對。其中，25微升反應體積的PRRSV RT-LAMP熒光法檢測體系成分包含1×Bst 4.2 Basic Mix（Cat. No.:A3831-01，HaiGene），0.32 U/微升HotStart Bst 4.2（Cat. No.: A3831-01，HaiGene），1×SYBRTMGreen I（Cat.No.: S7563，ThermoFisher），0.2微米 F3/B3，1.6微米FIP/BIP，0.4微米LF/LB（若有），1微升反應模板（基因組、質?；騌NA假病毒等），剩余用無核酸酶水補足25微升。在熒光PCR儀中65℃反應1小時，每隔1分鐘收集一次熒光。注：HotStart Bst 4.2具有DNA/RNA通擴能力，因此，PRRSV RT-LAMP體系不需要額外添加逆轉錄酶。

3.化學添加劑對PRRSV RTLAMP檢測體系性能的影響。甜菜堿（Betaine）不僅可以通過減小二級結構的形成來提高DNA的擴增，還可以通過消除DNA融化/變性時對堿基對的依賴提高擴增特異性，常用于PCR擴增。甘氨酸（Glycine）類似于L-脯氨酸，據文獻資料報道，其有助于提高LAMP反應速率，縮短反應時間。因此，我們采用了上述兩種化學添加劑研究其對PRRSV RT-LAMP檢測體系性能的影響。

4.PRRSV RT-LAMP檢測體系靈敏度和特異度考察。

（1）PRRSV RT-LAMP熒光法快速檢測體系。PRRSV RT-LAMP熒光法檢測體系中額外添加0.5M Glycine，其余反應參數不變。

（2）PRRSV RT-LAMP熒光法快速檢測體系靈敏度。PRRSV RNA假病毒經EASY Dilution（for Real Time PCR）（Cat. No.: 9160，Takara）進行稀釋，用PRRSV RT-LAMP熒光法快速檢測體系進行檢測，并以無核酸酶水作為陰性對照。根據有無熒光信號及其信號強弱判定體系最低檢測下限。

（3）PRRSV RT-LAMP熒光法快速檢測體系特異度。以豬圓環(huán)病毒Ⅱ型PCV-2）、非洲豬瘟（CSFV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）基因組作為研究對象，并以PRRSV RNA假病毒為陽性對照，研究PRRSV RTLAMP熒光法快速檢測體系特異度。

5.PRRSV RT-LAMP可視化檢測。除了熒光檢測，PRRSV RTLAMP檢測結果還可通過以下兩種方法用肉眼判讀結果。渾濁法：以擴增產生的副產物焦磷酸鎂白色沉淀為依據觀察白色沉淀；比色法：反應體系中加入染料觀察擴增結果是否產生相應顏色來判定是否有目的產物擴增。對比熒光法快速檢測體系，渾濁法體系不加入1×SYBRTMGreen I，反應時間為35分鐘，其他條件不變；而比色法體系則是1×WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix（M1800，NEB），0.2微米F3/B3，1.6微米FIP/BIP，0.4微米LF/LB，1微升反應模板，剩余用無核酸酶水補足25微升。65℃反應1小時，每隔1分鐘收集一次熒光。

二、結果與討論

1.PRRSV RT-LAMP引物對篩選。采用相同濃度的PRRSV質粒（105copies/微升）作為體系反應模板，研究上述5組引物對的擴增效率。結果發(fā)現(xiàn)，5組引物對陰性對照均沒有信號，而陽性質粒在不同引物對體系中呈現(xiàn)不同的Ct值。Ct值越小，即陽性信號產生所需時間越短，體系反應效率越高。其中，引物對1，即本研究所設計的引物對（1-F3/1-B3，1-FIP/1-BIP，1-LF/1-LB），陽性Ct值最小，反應速度最快，擴增效率最高。選擇該引物對做后續(xù)分析。

2.化學添加劑對PRRSV RTLAMP體系反應速率影響。結果發(fā)現(xiàn)，甜菜堿降低了PRRSV RT-LAMP體系擴增效率，與馬翠萍等的研究結果一致。而0.5 M甘氨酸用量顯著提高了檢測體系的反應速率，使反應時間縮短了一半（106拷貝數陽性質粒：30分鐘→15分鐘以內；103拷貝數陽性質粒：60分鐘→30分鐘以內）。而添加甜菜堿減弱了體系的擴增效率可能是由于本研究采用的是商業(yè)化的LAMP試劑盒（HaiGene），體系buffer已達到較優(yōu)水平，甜菜堿具有弱化氫鍵的能力，反而不利于LAMP反應的進行。

3.PRRSV RT-LAMP快速檢測體系敏感性和特異性分析。利用快速體系（熒光法）檢測一系列濃度梯度（107→102拷貝數）的PRRSV RNA假病毒，結果發(fā)現(xiàn)，體系在35分鐘左右實現(xiàn)500拷貝數/反應的最低檢測下限。同時，與PCV-2、CSFV、PEDV等豬藍耳病相似癥狀的病毒無交叉反應，體系特異度良好。

4.PRRSV RT-LAMP體系可視化檢測。為了進一步提高PRRSV RT-LAMP體系在各種場合的靈活應用，尤其是資源有限的場所，擺脫對復雜、昂貴光學儀器的依賴，我們比較了兩種肉眼判讀結果的方法。采用渾濁法判讀結果，快速檢測體系在35分鐘左右實現(xiàn)500拷貝數/反應的最低檢測下限。采用比色法判讀結果，加入甘氨酸的檢測體系均不變色（仍保持黃色），不加入甘氨酸的檢測體系最低檢測下限為103拷貝數/反應，與PCV-2、CSFV、PEDV等豬藍耳病相似癥狀的病毒無交叉反應，體系特異度良好。

三、結語