鄭 豪 張葆青 周 旭

1.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山東濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)兒科，山東濟(jì)南 250014

肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MP）感染是引起兒童社區(qū)獲得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）的重要原因，該病近年呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅患兒的身心健康[1-3]。目前西醫(yī)治療該病多采用抗生素、免疫抑制劑和對(duì)癥治療等措施，但均有一定的缺陷和副作用[4]，因此繼續(xù)尋找安全有效的MP肺炎（Mycoplasmal pneumoniae pneumonia，MPP）治療藥物尤為必要。甘露消毒丹由葉天士所創(chuàng)，后由王孟英收入《溫?zé)峤?jīng)緯》，專為濕溫時(shí)疫而設(shè)，具有較強(qiáng)的抗菌和抗病毒作用[5]。網(wǎng)絡(luò)藥理研究發(fā)現(xiàn)，方中槲皮素、木犀草素等多種化學(xué)成分能有效作用于腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-10 等MPP 核心靶點(diǎn)[6]。張葆青教授化裁本方治療兒童MPP 濕熱閉肺證，并根據(jù)多年經(jīng)驗(yàn)舍棄腎毒性較強(qiáng)的木通，用清熱化痰力強(qiáng)的浙貝母代替川貝母，臨床效果頗驗(yàn)，但關(guān)于本方治療MPP 的實(shí)驗(yàn)依據(jù)相對(duì)欠缺，故本研究探討甘露消毒丹含藥血清對(duì)MP 感染的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞（NR8383）炎癥因子表達(dá)的調(diào)控作用，并將其分解為拆方1（味辛性熱的陽(yáng)性藥物）和拆方2（味苦性寒的陰性藥物），觀察兩類藥物對(duì)炎癥因子的調(diào)控有無(wú)差異，以期從中醫(yī)陰陽(yáng)的角度為MPP 的臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取8 周齡SPF 級(jí)雌性Wistar 大鼠，體重（200±10）g，購(gòu)買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[許可證編號(hào)：SCXK（京）2016-0006；合格證號(hào)：11001121-1104764715]，飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學(xué)（以下簡(jiǎn)稱“我?！保﹦?dòng)物中心，期間給予常規(guī)飲食、自然光線、避免噪聲干擾、定時(shí)更換墊料等措施，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，觀察大鼠飲食、二便、行為等無(wú)明顯異常即可進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理由山東中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)受理（2021-60）。

1.2 細(xì)胞株及菌株

NR8383 細(xì)胞株購(gòu)買于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所；MP 菌株（ATCC-15531）購(gòu)買于上海寶錄生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物

中藥由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院門(mén)診中草藥房提供。甘露消毒丹組成：藿香12 g、茵陳15 g、黃芩9 g、連翹9 g、石菖蒲12 g、豆蔻9 g、浙貝9 g、薄荷6 g、射干9 g、滑石15 g。拆方1 組成：藿香12 g、石菖蒲12 g、豆蔻9 g、薄荷6 g。拆方2 組成：茵陳15 g、黃芩9 g、連翹9 g、浙貝9 g、射干9 g、滑石15 g。阿奇霉素膠囊（北京四環(huán)制藥有限公司，21051751，0.25 g×6 粒）。

1.4 主要儀器與試劑

生物安全柜（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，BHC-1300ⅡA2）、離心機(jī)（長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司，TDZ5-WS）、低溫高速離心機(jī)[美瑞克儀器（上海）有限公司，MH-1650R]、二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo，HERAcell150i）、恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司，LRHS-150-Ⅲ）、低溫冰箱（合肥美菱股份有限公司，BCD-200MCX）、熒光倒置顯微鏡（OLYMPUS，CKX41）、酶標(biāo)儀（北京普朗新技術(shù)有限公司，DNM-9602）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（Roche，Light Cycle）、顯影儀（GE 醫(yī)療，Amersham Imager 600）。

F-12K 培養(yǎng)基和進(jìn)口胎牛血清（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所），支原體肉湯培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司，HB7025-2），注射用青霉素鈉（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，43210512），增強(qiáng)型細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒（CCK-8，Elabsciense，E-CK-A362），大鼠TNF-α、IL-1β、IL-10 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒（El-absciense，E-EL-R2856c、E-EL-R0012c、E-EL-R 0016c），SPARKeasyImprovedTissue/CellRNAKit（Spark-Jade，AC0202），SPARKscriptⅡRT Plus Kit（SparkJade，AG0304），2× SYBR Green qPCR Mix（Spark Jade，AH0104），PAGE 凝膠快速制備試劑盒（Epizyme，PG112），β-Actin Rabbit mAb（Cell Signaling Technology，4970），Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）Polyclonal Antibody（Thermo Fisher，48-2300），MyD88 Rabbit mAb（Cell Signaling Technology，4283），核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）-p50 Rabbit mAb（Cell Signaling Technology，13586），Anti-rabbit IgG HRPlinked Antibody（Cell Signaling Technology，7074）。

1.5 研究方法

1.5.1 藥物制備 各組中藥分批熬制，加水沒(méi)過(guò)藥材（滑石先下包煎，藿香、豆蔻、薄荷后下），大火煮沸后轉(zhuǎn)小火煮30 min，濾出藥液，重復(fù)3 次，藥液合并后低溫冷凝回流濃縮至2 g/ml 的生藥濃縮液，分裝后于-20℃冷凍保存。阿奇霉素膠囊用生理鹽水配制成5 mg/ml 的混懸液。

1.5.2 含藥血清制備 將35 只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白血清組、甘露消毒丹血清組、阿奇霉素血清組及拆方1、2 血清組，每組7 只。根據(jù)計(jì)算公式換算大鼠的給藥標(biāo)準(zhǔn)，以6 歲兒童（體重20 kg）的用量為標(biāo)準(zhǔn)，大鼠劑量=（藥物總量/兒童體重）×比例系數(shù)6.3[7]，阿奇霉素血清組，拆方1、2 血清組，甘露消毒丹血清組的給藥劑量分別為0.063、12.3、20.8、33 g/（kg·d），空白血清組予2ml/d 的生理鹽水，五組均灌胃給藥，1次/d，連續(xù)給藥1 周，末次給藥2 h 后采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉（3 ml/kg），腹主動(dòng)脈取血，離心（轉(zhuǎn)速為3 000 r/min，離心半徑為170 mm，離心時(shí)間為15 min）分離血清，水浴滅活（56℃下30～40 min），無(wú)菌條件下用0.22 μm 過(guò)濾器過(guò)濾，分裝至2 ml 凍存管并做好標(biāo)記，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 NR8383 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)于含15%滅活胎牛血清的F-12K 培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2～3 d 換液1 次，待細(xì)胞在T25 瓶中匯合至80%時(shí)按1∶2 的比例傳代。

1.5.4 細(xì)胞活力檢測(cè)96 孔板采用5×105個(gè)/ml 細(xì)胞鋪板，100 μl/孔，加入100 μl 培養(yǎng)基，孵育過(guò)夜后分別加入5 種血清5 μl，無(wú)血清處理的細(xì)胞加入5 μl 培養(yǎng)基，孵育24 h。孵育結(jié)束后，所有孔加10 μl CCK-8 溶液，2 h 后采用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm 處的吸光度，每孔測(cè)量3 次取平均值，每種處理設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，計(jì)算細(xì)胞存活率[7]。

1.5.5 MP 培養(yǎng)MP 培養(yǎng)于含20%胎牛血清和800 U/ml青霉素的支原體肉湯培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，待菌液由紅色變?yōu)辄S色時(shí)按1∶10 的比例傳代。

1.5.6 MP 濃度測(cè)定96 孔板設(shè)10 個(gè)組，每組3 復(fù)孔平行操作，向所有孔中加入180 μl MP 肉湯培養(yǎng)基，取20 μl 待傳代的菌液加入第1 孔，混勻后從第1 孔吸取20 μl 菌液加入第2 孔，以此類推，依次按1∶10 的比例遞減稀釋，并設(shè)陰性和陽(yáng)性對(duì)照，所有孔加3滴石蠟油防止蒸發(fā)，蓋好板蓋，做好標(biāo)記，37℃恒溫孵育，每日觀察，直至顏色不再發(fā)生改變，取106～107CCU/ml菌液備用[8]。

1.5.7 細(xì)胞分組及給藥 將NR8383 細(xì)胞設(shè)置對(duì)照組、模型組、甘露消毒丹組、阿奇霉素組及拆方1、2 組。調(diào)整細(xì)胞濃度為1.2×106個(gè)/ml，取6 個(gè)T25 瓶，每瓶加入5 ml 孵育過(guò)夜。取30 ml 濃度為106～107CCU/ml的MP 菌液離心（溫度為20℃，離心條件為12 000 g，離心時(shí)間為20 min），用5 ml 細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，平均加入模型組、甘露消毒丹組、阿奇霉素組及拆方1、拆方2 組中，每組1 ml，對(duì)照組加1 ml 不含MP 的細(xì)胞培養(yǎng)液，孵育4 h。然后分別向甘露消毒丹組、阿奇霉素組及拆方1、2 組加300 μl 對(duì)應(yīng)含藥血清，對(duì)照組和模型組加300 μl 空白血清，孵育24 h 后收集細(xì)胞及上清液，按試劑盒要求保存?zhèn)錅y(cè)。

1.5.8 qRT-PCR 根據(jù)試劑盒要求提取細(xì)胞RNA 后，將其逆轉(zhuǎn)為cDNA，反應(yīng)體系為2×SYBR qPCR Mix 5.0 μl，cDNA 1.0 μl，正、反向引物各0.2 μl，RNase Free H2O 3.6 μl。用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1，ACTB 為內(nèi)參基因。

表1 引物序列

1.5.9 蛋白質(zhì)印跡法 提取各組細(xì)胞蛋白，采用BCA 法測(cè)定蛋白濃度，SDS-PAGE 法分離蛋白后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉過(guò)夜，兔β-actin、TLR4、MyD88、NF-κB-p50 抗體（稀釋倍數(shù)為1∶1 000、1∶50、1∶1 000、1∶1 000）室溫孵育2 h，HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG（稀釋倍數(shù)為1∶2 000）室溫孵育1 h，顯色成像獲得蛋白條帶，Image J 軟件計(jì)算灰度值。

1.5.10 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞上清液炎癥因子的表達(dá) 分別檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-10 的表達(dá)，操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用Origin 9.64 進(jìn)行促炎性細(xì)胞因子的濃度換算。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組比較采用t 檢驗(yàn)；多組計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 含藥血清對(duì)NR8383 細(xì)胞活力的影響

各血清處理的細(xì)胞存活率均低于無(wú)處理的細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各血清處理細(xì)胞存活率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 不同血清處理細(xì)胞與未處理細(xì)胞存活率比較（n=3）

2.2 六組TLR4、MyD88、NF-κB-p50 mRNA 表達(dá)比較

模型組TLR4、MyD88、NF-κB-p50 mRNA 表達(dá)高于對(duì)照組，甘露消毒丹組、拆方2 組TLR4、MyD88、NFκB-p50 mRNA 表達(dá)低于模型組，拆方1 組MyD88 mRNA 表達(dá)低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。甘露消毒丹組TLR4、MyD88mRNA 表達(dá)低于拆方1組，NF-κB-p50 mRNA 表達(dá)高于拆方2 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 六組TLR4、MyD88、NF-κB-p50 mRNA 表達(dá)比較（n=3）

2.3 六組TLR4、MyD88、NF-κB-p50 蛋白水平比較

模型組TLR4、MyD88、NF-κB-p50 蛋白水平高于對(duì)照組（P＜0.05）。甘露消毒丹組、拆方2 組TLR4、MyD88、NF-κB-p50 蛋白水平低于模型組，拆方1 組TLR4 蛋白水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。甘露消毒丹組TLR4、MyD88、NF-κB-p50蛋白水平低于拆方1 組，TLR4 蛋白水平高于拆方2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖3～4。

圖3 六組TLR4、MyD88、NF-κB-p50 蛋白表達(dá)條帶圖

圖4 六組TLR4、MyD88、NF-κB-p50 蛋白水平比較（n=3）

2.4 五組細(xì)胞上清液炎癥因子水平比較

甘露消毒丹組、拆方2 組TNF-α、IL-1β 水平低于模型組，拆方1 組IL-1β 水平低于模型組，拆方2組IL-10 低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。甘露消毒丹組TNF-α、IL-1β、IL-10 水平均低于拆方1 組，TNF-α、IL-1β 水平高于拆方2 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖5。

圖5 五組細(xì)胞上清液炎癥因子水平比較（n=3）

3 討論

兒童MPP 屬于中醫(yī)“肺炎喘嗽”“馬脾風(fēng)”“風(fēng)溫時(shí)疫”等范疇，多因小兒衛(wèi)外不固、復(fù)感外邪所致[9-10]。MP感染與濕熱因素關(guān)系密切[11]，夏秋為MP 感染流行的季節(jié)，正值濕熱邪氣當(dāng)令[12]，小兒為純陽(yáng)之體，外邪侵襲，易入里化熱，內(nèi)外合邪，發(fā)為本病[13]，故以清利濕熱為治療大法。甘露消毒丹主治濕熱并重之濕溫時(shí)疫，恰合兒童MPP 濕熱證的病因病機(jī)，方中茵陳、黃芩、滑石清利濕熱；豆蔻、石菖蒲、藿香化濕和中；連翹、薄荷、射干清熱解毒，浙貝母化痰止咳、清熱散結(jié)，相較于川貝母少甘潤(rùn)而多苦寒，更適合濕熱郁結(jié)之咳嗽，諸藥合用共奏利濕化濁、清熱解毒之功。

免疫炎癥是MPP 的自我保護(hù)機(jī)制之一，但過(guò)度炎癥也是導(dǎo)致病情惡化的重要原因[14]。TLR4/MyD88/NF-κB 信號(hào)通路與炎癥有關(guān)，其激活后過(guò)度產(chǎn)生的TNF-α、IL-1β 等促炎性細(xì)胞因子通過(guò)與靶細(xì)胞的特異性受體結(jié)合而加重炎癥反應(yīng)，是造成患兒肺部損傷的重要原因[15-18]。研究發(fā)現(xiàn)，由MP 感染引起的肺炎患兒血清中TNF-α 的表達(dá)明顯上升[19-21]；MP 產(chǎn)生的CARDS TX 可催化腺苷二磷酸核糖基化激活NLRP3炎癥小體，誘導(dǎo)IL-1β 的產(chǎn)生[22]，其表達(dá)與病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)[23]。IL-10 是一種負(fù)性調(diào)節(jié)因子[24]，其可抑制過(guò)度炎癥損害宿主本身[25]，研究顯示，在MPP 患兒急性期IL-10 的表達(dá)相對(duì)較低，經(jīng)治療后其表達(dá)上升[26]，說(shuō)明其參與了疾病恢復(fù)期的炎癥消退和組織修復(fù)。但也有研究指出，重癥MPP[27]和難治性MPP[28]患兒血清中IL-10 的表達(dá)與病情的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，這可能與其調(diào)控免疫的功能相關(guān)，在免疫紊亂時(shí)其表達(dá)隨著炎癥程度的加重而上升，從而限制過(guò)度炎癥帶來(lái)的組織損害，因此IL-10 可能是兒童MPP 嚴(yán)重程度的重要預(yù)測(cè)指標(biāo)。

甘露消毒丹由陽(yáng)性藥物和陰性藥物組成，但兩種藥物對(duì)炎癥因子的表達(dá)調(diào)控可能存在差異，其作用方向也可能不同。本研究結(jié)果顯示，甘露消毒丹及其拆方含藥血清均能不同程度地下調(diào)MP 感染的NR8383細(xì)胞中TNF-α、IL-1β 水平，其機(jī)制可能與調(diào)控TLR4/MyD88/NF-κB 通路相關(guān)。中藥三組綜合來(lái)看拆方2組效果最優(yōu)，甘露消毒丹組次之，拆方1 組下調(diào)作用較低，提示陰性藥物對(duì)促炎性細(xì)胞因子的下調(diào)作用較明顯，陽(yáng)性藥物效果欠佳。從中醫(yī)角度分析其原因可能是炎癥多以紅、腫、熱、痛為主要表現(xiàn)，其為陽(yáng)證，陰性藥物與之相克，故其效佳。正如《景景室醫(yī)稿雜存·以藥治病關(guān)乎氣化說(shuō)》記載：“病也者，不過(guò)寒熱有所偏頗……以寒氣之藥化病氣之熱，以熱氣之藥化病氣之寒……是藥之所以能治病者。”也體現(xiàn)出中醫(yī)“治熱以寒”的診療思維。IL-10 具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功能，在本研究中其表達(dá)上調(diào)可能是為了平衡促炎環(huán)境，避免大量促炎性細(xì)胞因子損害細(xì)胞本身，其表達(dá)水平與炎癥程度呈正相關(guān)，因此推斷拆方2 組IL-10 表達(dá)較低的原因可能是該組含藥血清較大程度地抑制了TNF-α、IL-1β 等促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，從而間接降低了IL-10 的水平。

總之，本研究初步驗(yàn)證了甘露消毒丹及其拆方含藥血清對(duì)MP 感染的NR8383 細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響，但MP 感染后細(xì)胞因子的表達(dá)調(diào)控是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，其表達(dá)在體外細(xì)胞和體內(nèi)有很大差異，因此后期仍需在本研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步闡明甘露消毒丹的作用機(jī)制。此外，雖然拆方1 組和拆方2 組含藥血清均能下調(diào)促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，但僅用辛熱藥或苦寒藥治療疾病不符合中醫(yī)“謹(jǐn)察陰陽(yáng)而調(diào)之，以平為期”的觀點(diǎn)，容易打破機(jī)體“陰平陽(yáng)秘”的狀態(tài)，故其緩解炎癥的機(jī)制究竟是調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)還是破壞免疫平衡有待進(jìn)一步研究。