張凡瑤, 張再美, 陳萌琦, 韋東升, 徐嚴歡, 姚 冰, 孫振寧, 李 慧, 楊艷艷, 周 興, 李 凡, 陳翠霞

基于沉積物eDNA評估三疣梭子蟹資源量的方法初探

張凡瑤1, 張再美1, 陳萌琦1, 韋東升1, 徐嚴歡1, 姚 冰1, 孫振寧2, 李 慧1, 楊艷艷2, 周 興3, 李 凡2, 陳翠霞1

(1. 中國石油大學(華東)化學化工學院, 山東 青島 266580; 2. 山東省海洋資源與環(huán)境研究院, 山東省海洋生態(tài)修復重點實驗室, 山東 煙臺 264006; 3. 山東省青島市黃島區(qū)海洋發(fā)展局, 山東 青島 266499)

本文旨在通過沉積物eDNA(environmental DNA)的分析, 建立一種快速評估三疣梭子蟹資源量的方法。采用柱狀采泥器對萊州灣同一地點(37°30″E、119°20″N)不同深度(0~24 cm, 7個深度)進行樣品采集, 提取不同深度地層沉積物中的eDNA, 并以此為模板, 運用三疣梭子蟹COI基因通用型引物和特異性引物分別進行普通PCR和實時熒光定量PCR (quantitative PCR, qPCR)擴增, 評估萊州灣近年來三疣梭子蟹的資源量變化。結果顯示: 7個樣品的eDNA中均能擴增出700 bp長度的DNA產(chǎn)物, 表明在不同深度沉積物所代表的年份均有三疣梭子蟹的存在; 通過Clustal X與MEGA 7.0軟件比對各序列堿基之間的差異性, 發(fā)現(xiàn)不同柱深沉積物中的COI基因共出現(xiàn)11個變化位點, 包括8個轉換位點、2個顛換位點和1個插入位點; qPCR結果顯示, 8~9 cm處的三疣梭子蟹COI基因拷貝數(shù)要大于其他深度地層沉積物, 說明此柱深代表的年份中三疣梭子蟹的資源量高于其他年份。利用沉積物eDNA評估萊州灣海域內的三疣梭子蟹資源量的方法, 可以打破時間和空間的限制, 檢測不同年份三疣梭子蟹的資源量的變化。

eDNA; 三疣梭子蟹; COI基因; qPCR; 資源量

三疣梭子蟹()俗稱海蟹或大蟹, 屬于甲殼綱十足目梭子蟹科, 在我國大陸架海域廣為分布, 具有體型較大、肉質肥美、營養(yǎng)豐富等優(yōu)點, 是我國單物種產(chǎn)量最高的一種蟹類, 同時也是山東近海主要的增殖放流物種之一[1-2]。但是, 由于過度捕撈和環(huán)境變化的雙重影響, 其資源量不斷衰退[3]。因此, 自2007年起, 山東省開始在萊州灣大規(guī)模放流三疣梭子蟹[4], 截至2020年, 已累計放流三疣梭子蟹稚蟹超過10億尾。為合理確定放流數(shù)量和地點、提高放流效率、科學評價放流效果, 急需一種科學、準確、便捷的三疣梭子蟹資源量評估技術。

近年來, 不少學者對三疣梭子蟹的資源量進行研究, 楊剛等[5]、張明亮等[6]構建ECOPATH模型, 將生態(tài)系統(tǒng)簡化為不同功能組, 利用各功能組的能量輸入與輸出的關系, 估算三疣梭子蟹在萊州灣的生態(tài)容量為3 749 t。王彬等[7]、Sun等[8]、吳強等[9]利用掃海面積法, 即根據(jù)拖網(wǎng)單位時間的掃海面積和拖網(wǎng)漁獲量估算單位面積內三疣梭子蟹的絕對數(shù)量。高麗等[10]利用Ricker親體-補充量關系模型即群體資源量與補充量之間的關系對浙江漁場內三疣梭子蟹進行動態(tài)變化的預測。上述研究為三疣梭子蟹在特定地點的資源量估算提供了科學的方法, 然而掃海面積法存在資金投入大、取樣時間受限制等局限性, 難以高效準確地掌握三疣梭子蟹的資源量及其時間序列信息; 由于種群數(shù)量較大且呈現(xiàn)動態(tài)變化, 使得ECOPATH模型與Ricker親體-補充量關系模型法對于物種資源量的評估仍存在投入資金大、非標準取樣、對物種數(shù)量有破壞性等方面的局限性。

eDNA是20世紀90年代發(fā)展起來的一項技術, 是指從水、沉積物等環(huán)境樣本中提取到的DNA, 包括細胞內DNA和細胞外DNA, 可用于監(jiān)測水生生物物種豐富度[11]。Ficetola等[12]利用eDNA信息分析成功檢測到入侵物種牛蛙的存在, 被認為是eDNA首次用于水生生物監(jiān)測。隨后, eDNA被用來檢測海洋脊椎動物和海洋無脊椎動物等[13], 實現(xiàn)了對水生生物種類的評估。自2010年以來, 隨著qPCR和DNA條形碼技術的發(fā)展, eDNA技術逐漸從定性分析物種存在與否逐漸擴展到定量分析物種的豐度[14-17]。海洋沉積物是許多生物的歸宿, 記錄著海洋環(huán)境長期演變信息[18], 而沉積柱樣品作為胞外DNA的載體[19], 保留了多種物種的混合復雜基因組信息, 相較于其他海洋環(huán)境樣品, 基因組信息豐富, 故海洋沉積物是研究海洋生物的重要物質[20]。評估同一地點不同深度沉積物中生物的DNA的含量, 有助于重建某段時間內、某一海域某一物種的種群數(shù)量信息[21], 尤其利于某一物種的歷史變動分析[22]。

與傳統(tǒng)的生物監(jiān)測手段不同, eDNA無需對物種本身而只要對環(huán)境樣本進行操作處理, 具有資金投入少、取樣簡單、靈敏度高等優(yōu)勢, 逐漸被應用于生物物種監(jiān)測、生物量估算等方面[23]。本文通過對萊州灣同一地點不同深度地層沉積物進行eDNA提取, 并利用qPCR的方法, 初步建立一種基于沉積物eDNA評估三疣梭子蟹資源量的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 三疣梭子蟹

本實驗所用的三疣梭子蟹由青島慧鵬海水養(yǎng)殖公司(青島海清)提供, 大小為0.3 kg/只, 從養(yǎng)殖場取回后, 保存于?80℃冰箱里備用。

1.1.2 沉積物樣品

沉積物樣品來自萊州灣(37°30″E、119°20″N)柱狀采泥器采集的樣品, 樣品運送過程中, 用生物冰塊保存, 收到樣品后, 保存于?80℃冰箱里備用。實驗中采用的柱深分別為0~1 cm, 7~8 cm, 8~9 cm, 9~10 cm, 10~11 cm, 13~14 cm, 22~24 cm。每一深度沉積物在進行eDNA提取時, 取5個重復樣品。設置連續(xù)柱深和非連續(xù)柱深的目的是為驗證不同地層深度eDNA含量的差異性。

1.2 實驗方法

1.2.1 蟹肌肉組織DNA和環(huán)境DNA提取與檢測

取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm(約0.5 g)大小的三疣梭子蟹肌肉組織樣品, 剪碎, 加入550 μL DNA裂解液(0.5 mol/L Tris-HCl, 0.1 mol/L EDTA, 5 mol/L NaCl, 10% SDS, 1 g RNA酶), 混勻后, 加入20 μL蛋白酶K, 置于56℃水浴鍋中水浴消化2~3 h至溶液透明, 采用苯酚-氯仿提取法提取三疣梭子蟹基因組DNA。分別取0.5 g不同地層深度的沉積物樣品(5個重復樣品), 采用Fast DNA Spin Kit for Soil試劑盒提取沉積物樣品DNA, 并溶于60 μL的緩沖液中。用NANODrop 2000超微量分光光度計檢測三疣梭子蟹肌肉組織DNA和沉積物樣品DNA濃度, ?20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 普通PCR與qPCR擴增

PCR擴增引物: 采用COI基因普通PCR引物序列(COIL1490, COIH2198)[24-25]擴增三疣梭子蟹COI基因, 以進行序列一致性分析, 利用Primer 5.0設計三疣梭子蟹特異性qPCR引物COI-qPCR for和COI-qPCR rev用于COI基因的定量分析, 用Primer 5.0設計引物COI-NE for 和COI-NE rev, 擴增特定COI基因片段, 作為模板建立qPCR標準曲線(表1), 各引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

表1 PCR擴增引物及產(chǎn)物

PCR擴增體系及反應條件: PCR擴增體系為25 μL, 反應液包括12.5 μL 2×GC buffer I, 4 μL dNTP Mixture (2.5 mmol/L), 0.25 μL TaKaRa LA Taq (5 U/μL), 1 μL模板DNA, 引物各1 μL(10 mmol/L), 無菌去離子水補齊至25 μL。PCR擴增程序為: (1)95℃ 5 min; (2)95℃ 50 s, 52℃ 45 s, 72℃ 1 min, 35個循環(huán); (3)72℃ 10 min。

qPCR擴增體系及反應條件: 使用寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司的TB Green Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus) qPCR試劑盒進行qPCR擴增。為建立標準曲線, 以COI-NE for和COI-NE rev為引物, 以三疣梭子蟹肌肉組織DNA為模板進行PCR擴增, 得到COI特定基因片段, 純化回收后作為模板用于qPCR擴增。將模板DNA以5倍濃度進行梯度稀釋, 進行qPCR。qPCR擴增體系為20 μL反應體系, 反應液包括SYBR?Premix ExTaq? 10 μL, 0.4 μL上、下游引物(10 μmol/L), 模板 2 μL, ROXII 0.4 μL, 水6.8 μL。擴增反應程序為3步法: 95℃預變性30 s; 95℃變性5 s, 57℃退火30 s, 72℃延伸32 s, 40個循環(huán)。沉積物eDNA模板不經(jīng)稀釋, 取2 μL作為模板, 采用相同的條件進行擴增。沉積物DNA與標準品DNA均做3個重復。

PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 將大小正確的條帶純化回收后送生工生物工程(上海)有限公司測序。

1.2.3 COI基因序列比對

將測序所得到的8條序列(三疣梭子蟹肌肉組織DNA和7個沉積物eDNA)分別在NCBI Gene Bank比對, 確定所擴增序列是否為三疣梭子蟹COI基因。利用Clustal X與MEGA 7.0軟件比對各序列堿基之間的差異性。

1.2.4 qPCR分析

首先, 采用ABI 7500 Software自動計算各樣品的t值(t值為每個反應管內的熒光信號到達設定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)), 同時, 根據(jù)作為標準曲線模板的COI基因(1348 bp)的DNA濃度, 利用下列公式計算模板COI基因的拷貝數(shù), 以平均t值為橫坐標, 以lg(已知COI基因拷貝數(shù))為縱坐標, 繪制標準曲線。將沉積物平均t值代入標準曲線, 計算得到沉積物中COI基因的拷貝數(shù)。

2 結果與分析

2.1 三疣梭子蟹基因組DNA及沉積物eDNA COI基因擴增

通過NANODrop2000超微量分光光度計檢測, 三疣梭子蟹及沉積物樣品中DNA的質量濃度分別為8 376、446.4、336、174、156、267.6、57.6、92.4 ng/g, 以三疣梭子蟹和不同地層沉積物eDNA為模板, 采用通用型COI基因引物(COIL1490, COIH2198)擴增COI基因, 并對擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳驗證。結果顯示, 凝膠電泳條帶明亮清晰且均可擴增得到長度在700 bp左右的目的條帶(圖1), 證明各DNA均可成功擴增得到COI基因, 并且特異性良好。

2.2 不同柱深沉積物三疣梭子蟹COI基因序列比對

利用1.2.3方法對所測得的序列(647 bp)進行分析。序列堿基組成分析發(fā)現(xiàn), 各樣品擴增的COI基因的A+T的平均含量為62.27%, G+C的平均含量37.73%。序列堿基突變位點分析結果顯示通過通用引物擴增得到的COI基因有11個突變位點(表2), 包括8個轉換位點、2個顛換位點和1個插入位點。與NCBI數(shù)據(jù)庫中的三疣梭子蟹COI基因序列相比[26], 養(yǎng)殖的三疣梭子蟹COI基因在574位插入T并在594位出現(xiàn)G-C顛換。其余地層深度所提取的eDNA擴增的COI基因序列在134位均出現(xiàn)A-G轉換, 10~11 cm所提取的eDNA擴增的COI基因序列在276位出現(xiàn)了G-C顛換?？傮w分析結果說明7個沉積物中所提取到的eDNA擴增得到的COI基因與2020年新上傳的三疣梭子蟹COI基因序列相似度達到99%以上[26], 表明不同沉積物中三疣梭子蟹未發(fā)生明顯的遺傳變異。

圖1 COI基因PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

注: M表示D2000 plus DNA Ladder; 1表示三疣梭子蟹肌肉組織DNA; 2—8分別表示不同地層沉積物DNA(對應地層分別為0~1 cm; 7~8 cm; 8~9 cm; 9~10 cm; 10~11 cm; 13~14 cm; 22~24 cm)

表2 不同地層沉積物中eDNA擴增的COI基因片段遺傳一致性分析

注: “-”表示無堿基變化, 括號內為變化位點

2.3 qPCR定量分析

2.3.1 標準曲線

以三疣梭子蟹肌肉基因組DNA為模板, COI- NE for和COI-NE rev為引物, 進行PCR擴增, 獲得1 348 bp大小的COI基因片段, 將基因片段進行純化回收, 利用NANODrop 2000超微量分光光度計測定模板質量濃度為20.8 ng/μL。將該溶液梯度稀釋后作為模板, 并按照1.2.4公式計算COI基因的拷貝數(shù)。隨后, 采用COI-qPCR引物對, 進行qPCR。擴增結果如圖2所示, 在指數(shù)擴增區(qū)域每條擴增曲線之間均被隔開, 且每個反應的熔解曲線在80~80.5℃處均出現(xiàn)單峰, 表明設計的qPCR引物特異性強, 擴增效果好。

依據(jù)qPCR的結果, 三疣梭子蟹COI基因的標準曲線如圖3所示, 該曲線擬合方程為=10.183?0.265 5,2=0.992 3, 表明t值與COI基因拷貝數(shù)的對數(shù)之間呈現(xiàn)良好的線性關系, 該基因可用來測定環(huán)境中三疣梭子蟹基因組DNA含量。

圖2 COI基因擴增曲線和基因溶解曲線

圖3 COI基因拷貝數(shù)標準曲線

2.3.2 三疣梭子蟹基因拷貝數(shù)分析

按照1.2.4所示方法, 以不同柱深沉積物eDNA為模板, 進行qPCR, 得到不同柱深沉積物中eDNA模板擴增的t值, 利用標準曲線, 獲得不同沉積物中三疣梭子蟹COI基因的拷貝數(shù), 進而獲得每克沉積物中COI基因的拷貝數(shù)(圖4)。結果顯示, 0~1 cm、7~8 cm、9~10 cm、10~11 cm、22~24 cm這5個深度的COI基因拷貝數(shù)大致相同, 8~9 cm的柱狀沉積物中COI基因的拷貝數(shù)最高, 而13~14 cm的柱狀沉積物中COI基因的拷貝數(shù)最低。

圖4 地層深度與COI基因拷貝數(shù)的關系

3 討論

eDNA是生物體釋放到環(huán)境中的DNA, 其濃度與生物量有關, 且不受溫度的影響[27]。研究發(fā)現(xiàn)表層沉積物中eDNA相對比較穩(wěn)定, 一旦進入水體后會被快速降解[28-29]。因此可通過不同地層eDNA的豐度及特定物種DNA探針檢測不同生物在特定時期內的資源量, 然而, 沉積物eDNA的提取效率一直是困擾科研人員的一個問題。目前, 沉積物中eDNA的提取有SDS提取法、高鹽法、蛋白酶K法、試劑盒法等, 大致可以分為兩類, 即直接提取法和間接提取法[30]。本研究前期利用直接法提取不同地層深度沉積物中的eDNA, 獲得的eDNA含量低, 凝膠電泳結果顯示PCR擴增后無條帶或條帶較暗且有雜帶和拖帶, 說明提取的eDNA質量較差, 可能與沉積物中所含的腐殖質酸、eDNA提取試劑酚類化合物等抑制了PCR過程有關[31]。而試劑盒法能較好地解決該問題, 本研究采用MP BIO公司開發(fā)的Fast DNA Spin Kit for Soil試劑盒[32]對沉積物進行eDNA快速提取, 在較短時間內有效提取eDNA且避免PCR抑制劑等的干擾, 凝膠電泳結果顯示PCR擴增后條帶清晰且明亮。同時, 為提高eDNA提取的重復性, 在提取eDNA樣品時, 采用同一平面九點取樣法, 大大提高了各樣品eDNA提取的效率和準確率。在以后的研究中, 如何保證提取各沉積物eDNA濃度的重復性, 仍是需要研究的重點。

在獲取高質量的eDNA后, 本研究以其為模板, 采用三疣梭子蟹特異性COI基因的引物COI-qPCR for和COI-qPCR rev進行PCR擴增, 結合熒光定量PCR技術, 可預估不同地層深度沉積物中三疣梭子蟹COI基因的拷貝數(shù)。參考海洋沉積物同位素年代測定結果[33-34], 預估本實驗7~8 cm沉積物對應年代約為2013年。從DNA拷貝數(shù)與不同地層深度的關系可知, 相較于其他地層, 8~9 cm所對應的2012年左右所對應的DNA拷貝數(shù)較多, 13~14 cm所處的2007年左右所對應的DNA拷貝數(shù)較少, 其余地層深度所對應年代的DNA拷貝數(shù)大致相同, 說明自實施漁業(yè)修復計劃以來三疣梭子蟹產(chǎn)量有所增加, 但0~1 cm所處的地層含有的DNA拷貝數(shù)較少, 間接說明三疣梭子蟹含量可能在降低。這一發(fā)現(xiàn), 能夠有效地監(jiān)測三疣梭子蟹在不同地層年代的資源量, 科學評價三疣梭子蟹自然資源量的變化并依此制定相應的政策。

綜上所述, 本研究成功從不同地層沉積物中提取到包含三疣梭子蟹基因在內的eDNA, 利用qPCR技術檢測沉積物eDNA中的三疣梭子蟹COI基因拷貝數(shù), 可用于評估三疣梭子蟹的資源量。eDNA是含有大量細胞的有機體經(jīng)過時間的推移后在環(huán)境中留下的殘骸, 是目前檢測生態(tài)物種資源量最簡單高效的手段, 但eDNA技術的局限性如樣品污染、DNA的降解、PCR抑制劑以及數(shù)據(jù)庫不完整等技術性問題, 如何通過實驗技術優(yōu)化, 提升eDNA技術在評估特定物種資源量方面的精確度, 仍是需努力解決的問題。

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A preliminary method to assess theresource based on sedimentary eDNA

ZHANG Fan-yao1, ZHANG Zai-mei1, CHEN Meng-qi1, WEI Dong-sheng1, XU Yan-huan1, YAO Bing1, SUN Zhen-ning2, LI Hui1, YANG Yan-yan2, ZHOU Xing3, LI Fan2, CHEN Cui-xia1

(1. College of Chemistry and Chemical Engineering, China University of Petroleum, Qingdao 266580, China; 2. The Key Laboratory of Restoration for Marine Ecology of Shandong Province, Shandong Marine Resources and Environment Research Institute, Yantai 264006, China; 3. Qingdao Municipal Marine Development Bureau, Qingdao 266499, China)

This study aimed to establish a rapid method to assess theresource by analyzing sedimentary environmental DNA (eDNA). Samples were collected at different sediment depths (0~24 cm, 7 depths) from the same location (37°30″ E, 119°20″ N) in Laizhou Bay using a column mud collector. The eDNA samples extracted from the ocean sediments served as the template to amplify the cytochromeoxidase subunit 1 (COI) gene by polymerase chain reaction (PCR) and quantitative PCR (qPCR) using universal and specific primers for theCOI geneThe amplified products were used to assess theresource in Laizhou Bay. The results showed that the 700 bp COI gene fragments were amplified from all extracted eDNA, indicating the presence ofin the years represented by the sediments at different depths. Genetic consistency was analyzed by Clustal X and MEGA 7.0 software, and 11 variable sites, including 8 conversion sites, 2 inversion sites, and 1 insertion site, were found for the COI gene at the different depths, suggesting high homology ofin the years represented by the 7 sediments. The qPCR results showed that theCOI gene copy number at 8–9 cm of soil depth was higher than that at the other depths, suggesting that theresource was richer in the years represented by the 8~9 cm depth than the other years. Using sedimentary eDNA saved time and space when assessing theresource in Laizhou Bay.

eDNA; Portunus trituberculatus; COI gene; qPCR; resource

May 20, 2022

S932.5＋2

A

1000-3096(2023)5-0113-08

10.11759/hykx20220520001

2022-05-20;

2022-07-27

煙臺市科技創(chuàng)新發(fā)展計劃(2020MSGY056); 山東省自然科學基金重點項目(ZR2020KE050); 煙臺市科技創(chuàng)新發(fā)展計劃(2021XDHZ053); 山東省教學改革重點項目(Z2022114)

[The Science and Technology Innovation Development Program of Yantai, No. 2020MSGY056; Key Project of Natural Science Foundation of Shandong Province, No. ZR2020KE050; Science and Technology Innovative Development Programme of Yantai, No. 2021XDHZ053; Shandong Province Teaching Reform Key Project, No. Z2022114]

張凡瑤(1997—), 女, 山東日照人, 碩士生, 攻讀專業(yè)為生物化工, E-mail: 1134688407@qq.com; 陳翠霞(1979—),通信作者, 山東兗州人, 博士, 教授, 主要從事肽生物材料的制備及功能研究, E-mail: chencx@upc.edu.cn; 李凡(1981—), 通信作者, 山東臨沂人, 副研究員, 主要從事漁業(yè)資源與漁業(yè)生態(tài)研究, E-mail: lifan811230@126.com

(本文編輯: 趙衛(wèi)紅)