呂新，劉蘭英，李玥仁

1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所（福州 350003）；2.福建省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（福州 350003）

沙門菌是全球范圍內(nèi)最重要的幾種食源性致病菌之一，由其引起的食物中毒占細(xì)菌性食物中毒病例的前2位[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織不完全統(tǒng)計(jì)，每年至少有1 600萬沙門菌感染病例，導(dǎo)致約60萬人死亡。僅在2005—2011年間，國外發(fā)生的19件蔬菜因食源性致病菌污染而導(dǎo)致的食物中毒事件，其中11件的元兇是沙門菌[2]。在我國沙門菌也是最主要食源性致病菌，其中80%左右的細(xì)菌性食物中毒事件為沙門菌污染所致[3]，國內(nèi)已發(fā)現(xiàn)多種蔬菜中存在沙門菌污染風(fēng)險(xiǎn)[4-6]。農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地環(huán)境的質(zhì)量安全是農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的前提，蔬菜產(chǎn)地環(huán)境包括大氣、灌溉水源和栽培土壤等因素，其中栽培土壤又是產(chǎn)地環(huán)境中最重要因素之一，蔬菜的沙門菌污染可能發(fā)生在從農(nóng)田到餐桌的每個(gè)環(huán)節(jié)[7-8]，近年來，隨著對蔬菜供應(yīng)鏈每個(gè)環(huán)節(jié)中沙門菌污染風(fēng)險(xiǎn)和來源的深入研究，研究發(fā)現(xiàn)蔬菜沙門菌污染主要還是發(fā)生在栽培環(huán)節(jié)中，尤以栽培土壤中沙門菌污染而導(dǎo)致蔬菜二次污染為甚，這也是防控蔬菜沙門菌污染重要節(jié)點(diǎn)[8-12]。

沙門菌檢測所采用的GB 4789.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》[13]，主要包括沙門菌疑似菌落篩選和生化試驗(yàn)鑒定，整個(gè)檢測過程不但步驟繁瑣而且耗時(shí)費(fèi)力，從樣品開始檢測到最終檢測結(jié)果取得需要5~7個(gè)工作日，難以滿足大規(guī)模樣品檢測需求，且最終檢測結(jié)果也僅為定性分析難以定量分析。而實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）方法則可以完美解決上述問題，已被應(yīng)用于沙門菌、副溶血弧菌、陰溝腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌等病原菌的分析檢測[14-20]，但國內(nèi)尚未見有關(guān)蔬菜栽培土壤中沙門菌定量檢測方法的研究報(bào)道。qPCR方法包括探針法和嵌合熒光法，其中嵌合熒光法以使用SYBR Green I熒光染料為主，其原理是SYBR Green I作為一種具有綠色激發(fā)波長的熒光染料，主要結(jié)合于雙鏈DNA（dsDNA）雙螺旋小溝區(qū)域，在游離狀態(tài)下SYBR Green I不會散發(fā)熒光信號，但當(dāng)與雙鏈DNA結(jié)合后其熒光信號將顯著增強(qiáng)，其熒光信號強(qiáng)度與雙鏈DNA的數(shù)量呈正比，因此可利用SYBR Green I熒光信號強(qiáng)弱變化監(jiān)測PCR體系中雙鏈DNA的數(shù)量。試驗(yàn)以沙門菌特有侵襲蛋白A（invasion protein A）基因?yàn)榘谢颍⒒赟YBR Green I嵌合熒光法的沙門菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，可滿足蔬菜栽培土壤中沙門菌污染的定量檢測技術(shù)需求，以期為蔬菜產(chǎn)地環(huán)境中沙門菌污染的防控和蔬菜質(zhì)量安全的提升提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、蛋白胨緩沖水（BPW）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、無菌均質(zhì)袋（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司）；TB Green?Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus，日本寶生物公司）；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（北京天根公司）；FastDNA?Spin Kit for Soil土壤提取試劑盒（美國MP Bio公司）；NaCl（分析純，阿拉丁公司）；熒光定量PCR八聯(lián)管（無錫Nest公司）。

供試土壤樣品采自福州市閩清縣東橋鎮(zhèn)綠輝蔬菜種植農(nóng)場，按五點(diǎn)采樣法采集0~20 cm土壤表層樣品，混合均勻后置無菌袋中放置在4 ℃冷藏箱中運(yùn)回，挑出植物根系、石頭等雜物，土壤理化指標(biāo)測定前過2 mm篩網(wǎng)。具體土壤理化指標(biāo)：土壤類型為黃紅壤，0~20 cm土層pH 5.31，有機(jī)質(zhì)含量16.61 g/kg，堿解氮含量126.54 mg/kg，速效磷含量18.25 mg/kg，速效鉀含量113.79 mg/kg。

1.2 儀器與設(shè)備

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（BIO-RADTMCFX96 Touch，美國伯樂公司）；核酸提取儀（FastPrepTMFP120，美國MP Bio公司）；拍擊式均質(zhì)器（easyMixTM，法國AES Chemunex公司）；臺式離心機(jī)（Sigma 1-14，德國希格瑪公司）；恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9082，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；核酸蛋白定量儀（Qubit 2，美國Thermo Scientific公司）；超凈工作臺（C2HJH-C1112B，上海智城公司）。

1.3 菌株

供試的7個(gè)菌株微生物菌株除鼠傷寒沙門菌為陽性對照菌株外，其余6個(gè)菌株均為試驗(yàn)的干擾菌株，菌株來源分別為中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）、中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC）和美國典型培養(yǎng)物保存中心（ATCC）。具體菌株編號及來源等信息見表1。

表1 供試菌株

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)沙門菌侵襲蛋白A（invA）基因（Genbank Accession：M90846.1），使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)1對qPCR引物invA-U/invA-D用于沙門菌實(shí)時(shí)熒光定量檢測。檢測引物交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。具體檢測引物序列見表2。

表2 qPCR擴(kuò)增引物

1.4.2 沙門菌計(jì)數(shù)及基因組DNA提取

沙門菌計(jì)數(shù)。將-70 ℃保存的沙門菌菌株在TSA平板內(nèi)劃線后，置37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)16~24 h，在5 mL TSB液體培養(yǎng)基中使用無菌牙簽挑取TSA平板內(nèi)的單個(gè)沙門菌菌落進(jìn)行接種，置37 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)16~24 h后，取1 mL振蕩培養(yǎng)的TSB液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接于新的100 mL TSB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、160 r/min振蕩養(yǎng)至A600=0.55的對數(shù)生長期。以10倍濃度梯度將對數(shù)生長期菌液進(jìn)行稀釋后，吸取100 μL稀釋液在TSA平板上進(jìn)行涂布，置37 ℃培養(yǎng)18~24 h后計(jì)數(shù)。

沙門菌基因組DNA提取。吸取1 mL沙門菌培養(yǎng)菌液，在臺式離心機(jī)上按12 000 r/min離心4 min，吸棄上清液，菌體沉淀使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒按步驟進(jìn)行提取。使用Qubit 2測定DNA濃度后，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 qPCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件優(yōu)化

分別對qPCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件中的引物濃度、退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，其中：引物濃度分別為0.1，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 μmol/L；退火溫度分別設(shè)置55，56，57，58，59，60和61 ℃。每個(gè)因子設(shè)置3個(gè)重復(fù)，同時(shí)以無菌水為模板設(shè)置陰性對照，利用Bio-Rad CFX Manager軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以擴(kuò)增曲線獲得最小的Ct值和熔解曲線不產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增峰為指標(biāo)，確定最佳引物濃度和退火溫度。

1.4.4 qPCR反應(yīng)特異性檢測

以鼠傷寒沙門菌為陽性對照菌株、金黃色葡萄球菌等6個(gè)菌株為干擾菌株，使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取各菌株DNA，對沙門菌qPCR反應(yīng)進(jìn)行特異性分析。采取已優(yōu)化的qPCR反應(yīng)體系和條件進(jìn)行分析，以管內(nèi)熒光信號強(qiáng)弱變化來判斷陰陽性，陽性管內(nèi)具有明顯的熒光擴(kuò)增曲線，陰性管內(nèi)則沒有明顯的熒光擴(kuò)增曲線。每個(gè)菌株DNA模板均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，同時(shí)以無菌水為模板設(shè)置陰性對照。

1.4.5 qPCR反應(yīng)靈敏度檢測

將沙門菌DNA按10倍遞減方式稀釋至1×104，1×103，1×102，1×101，1，0.1和0.01 pg/μL 7個(gè)濃度，以上述DNA為模板對沙門菌qPCR反應(yīng)靈敏度進(jìn)行檢測。反應(yīng)結(jié)束后，陽性管內(nèi)具有明顯的熒光擴(kuò)增曲線，陰性管內(nèi)則沒有明顯的熒光擴(kuò)增曲線。每個(gè)濃度的DNA模板均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，同時(shí)以無菌水為模板設(shè)置陰性對照。

1.4.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

取6份10 g無沙門菌污染的栽培土壤樣品，加入0.5 mL不同濃度的沙門菌菌液，制備沙門菌濃度分別為2，20，200，2×103，2×104和2×105CFU/g的土壤樣品，全部轉(zhuǎn)移至含90 mL蛋白胨緩沖水的均質(zhì)袋中，將均質(zhì)袋放置在拍擊式均質(zhì)器中拍打1~2 min混勻，置37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中增菌4 h。增菌后重新混勻樣品，吸取1 mL混勻土壤樣品至FastDNA?Spin Kit for Soil試劑盒中的土壤裂解管中，按12 000 r/min離心3 min，吸棄上清液，在FastPrepTMFP120核酸提取儀上按操作說明提取土壤微生物總DNA，用于栽培土壤中沙門菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線建立。

以不同濃度沙門菌提取的DNA作為定量標(biāo)準(zhǔn)品，利用優(yōu)化的qPCR方法檢測各濃度標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值，以不同濃度沙門菌對數(shù)值為橫坐標(biāo)，qPCR擴(kuò)增Ct值為縱坐標(biāo)，建立Ct值與不同濃度沙門菌對數(shù)值線性函數(shù)關(guān)系的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.7 蔬菜栽培土壤中沙門菌污染對比檢測

采用qPCR方法和GB 4789.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》，分別對采自全省的35份栽培土壤樣品中沙門菌污染情況進(jìn)行檢測，驗(yàn)證所建立的qPCR方法應(yīng)用于蔬菜栽培土壤中沙門菌污染檢測的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 qPCR方法的建立

分別對qPCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件中引物濃度、退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，確定qPCR檢測最佳反應(yīng)體系25 μL，包括12.5 μL 2×TB GreenPremix Ex Taq（Tli RNaseH Plus），0.2 μmol/LinvA-U，0.2 μmol/LinvAD，DNA模板1 μL，滅菌水補(bǔ)足至25 μL體積。優(yōu)化退火溫度后反應(yīng)條件：95 ℃/30 s，95 ℃/5 s，56 ℃/30 s和72 ℃/30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。優(yōu)化的qPCR方法反應(yīng)結(jié)果如圖1所示，其熒光擴(kuò)增曲線實(shí)時(shí)反映PCR的指數(shù)增長期和平臺期，且熔解曲線只有單一擴(kuò)增峰，未見非特異性擴(kuò)增峰。

圖1 qPCR方法檢測沙門菌

2.2 特異性檢測結(jié)果

采用優(yōu)化的qPCR方法，以鼠傷寒沙門菌、大腸埃希菌O157：H7、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌等7個(gè)菌株DNA為模板進(jìn)行特異性分析，結(jié)果顯示，除鼠傷寒沙門菌能產(chǎn)生明顯的熒光擴(kuò)增曲線，且呈現(xiàn)陽性結(jié)果，其余大腸埃希菌O157：H7等6個(gè)干擾菌株DNA及無菌水陰性對照均無明顯熒光擴(kuò)增曲線產(chǎn)生，均呈現(xiàn)陰性結(jié)果（圖2）。試驗(yàn)表明所建立的qPCR方法具有良好的特異性。

圖2 qPCR方法檢測沙門菌的特異性

2.3 靈敏度檢測結(jié)果

使用7個(gè)不同濃度沙門菌DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增檢測qPCR體系的靈敏度，檢測結(jié)果顯示，在每管25 μL qPCR反應(yīng)體系中沙門菌DNA濃度為0.1~1×104pg/μL時(shí)均出現(xiàn)明顯的熒光擴(kuò)增曲線，3個(gè)平行樣品間擴(kuò)增曲線重復(fù)性好且Ct值均＜35，而當(dāng)沙門菌DNA濃度0.01 pg/μL時(shí)雖然也出現(xiàn)熒光擴(kuò)增曲線，但3個(gè)平行樣品間擴(kuò)增曲線重復(fù)性較差且Ct值均＞35（見圖3）。因此，qPCR反應(yīng)體系的檢測靈敏度為0.1 pg/μL的沙門菌DNA。

圖3 qPCR方法檢測沙門菌的靈敏度

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果

將6個(gè)10倍梯度稀釋的定量標(biāo)準(zhǔn)品在優(yōu)化的沙門菌qPCR反應(yīng)體系和條件下進(jìn)行擴(kuò)增，建立不同沙門菌濃度對數(shù)值與Ct值之間對應(yīng)關(guān)系的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，所制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線在2~2×105CFU/g濃度之間的Ct值相差均勻，符合qPCR的Ct值與起始濃度對數(shù)值之間的線性關(guān)系（圖4）。分別以Ct值為縱坐標(biāo)，沙門菌濃度對數(shù)值為橫坐標(biāo)，得出起始濃度對數(shù)值與Ct值的線性方程：Y=-3.427 1X+32.08，斜率-3.427 1，截距32.08，相關(guān)系數(shù)R2為0.998（圖5）。在對樣品進(jìn)行檢測時(shí)，根據(jù)其Ct值和線性方程可以計(jì)算該樣品沙門菌濃度。

圖4 不同濃度沙門菌qPCR擴(kuò)增曲線

圖5 沙門菌qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 蔬菜栽培土壤中沙門菌污染對比檢測結(jié)果

分別采用qPCR方法和GB 4789.4—2016方法對采自全省的35份栽培土壤樣品中沙門菌污染情況進(jìn)行分析，結(jié)果如表3所示。35份栽培土壤樣品檢測結(jié)果均顯示為沙門菌污染陰性樣品，2種方法檢測結(jié)果一致，但qPCR方法在保證準(zhǔn)確性的前提下，將檢測時(shí)間縮短至6 h內(nèi)，縮短了GB 4789.4—2016方法的檢測時(shí)間，降低了檢測強(qiáng)度，同時(shí)提高了檢測效率，為大量栽培土壤樣品中開展沙門菌污染檢測提供可能。

表3 2種方法對比檢測蔬菜栽培土壤沙門菌污染結(jié)果 單位：份

3 結(jié)論與討論

蔬菜產(chǎn)地環(huán)境安全是防控蔬菜沙門菌污染的前提，而檢測技術(shù)則是防控沙門菌污染的有力武器。采用GB 4789.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》，由于檢測時(shí)間長難以滿足大規(guī)模檢測需求且檢測結(jié)果僅為定性分析，普通PCR方法雖然解決GB 4789.4—2016方法檢測時(shí)間長的短板，但也不具備定量分析的能力。利用qPCR方法則兼具檢測時(shí)長短和通量大的優(yōu)點(diǎn)，更彌補(bǔ)GB 4789.4—2016方法和普通PCR方法不能定量檢測的不足。qPCR方法包括探針法和嵌合熒光法，探針法由于探針引物設(shè)計(jì)要求高、合成費(fèi)用貴等原因，導(dǎo)致探針法使用成本較高，而嵌合熒光法則可以使用普通PCR引物再輔以熒光染料如SYBR Green I，相對在引物設(shè)計(jì)上要求簡單和使用成本上低廉，在qPCR中得到越來越多應(yīng)用。

沙門菌侵襲蛋白基因是一類與沙門菌吸附和侵襲腸道上皮細(xì)胞相關(guān)的基因，包括invA~invE等多個(gè)基因，其中對invA基因的研究和應(yīng)用最為廣泛，以invA基因?yàn)榘谢虻纳抽T菌qPCR方法在蛋糕、乳品、烤肉、新鮮農(nóng)產(chǎn)品、雞蛋和牛肉淋巴等中得到成功應(yīng)用[21-23]。試驗(yàn)根據(jù)沙門invA基因序列設(shè)計(jì)特異性qPCR引物，建立一種基于SYBR Green I嵌合熒光法的蔬菜栽培土壤中沙門菌實(shí)時(shí)熒光定量檢測方法，對沙門菌DNA的檢測靈敏度可達(dá)0.1 pg/μL，所制作的qPCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線在2~2×105CFU/g濃度之間有較好的線性關(guān)系，可滿足對沙門菌進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析要求，且qPCR方法與GB 4789.4—2016方法具有相同的準(zhǔn)確性，可應(yīng)用于蔬菜栽培土壤中沙門菌的定量檢測分析，對于有效防控蔬菜沙門菌污染風(fēng)險(xiǎn)保障蔬菜質(zhì)量安全具有重要意義。