鄒沫君

樂(lè)山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心（樂(lè)山 614000）

硝酸鹽和亞硝酸鹽在食品加工工業(yè)中常被用作發(fā)色劑、增香劑和防腐劑[1]。如果保存和處理不當(dāng)，在硝基還原酶的作用下，食品中的硝酸鹽可能轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽[2-3]。過(guò)量攝入亞硝酸鹽可導(dǎo)致食用者中毒，亞硝酸鹽被人體血液吸收后，可將血紅素中Fe2+氧化為Fe3+，造成正常的血紅蛋白被氧化為高鐵血紅蛋白，從而失去攜帶氧氣的功能，出現(xiàn)組織缺氧現(xiàn)象。與此同時(shí)，亞硝酸鹽與蛋白質(zhì)代謝的中間產(chǎn)物仲胺反應(yīng)，生成強(qiáng)致癌作用的亞硝胺，對(duì)人的身體健康構(gòu)成巨大危害[4-5]。因此，食品中硝酸鹽和亞硝酸鹽的含量都必須得到有效監(jiān)控，以保障人類生活安全[6]。

在奶牛的飼養(yǎng)過(guò)程中，如果環(huán)境水源、喂養(yǎng)飼料的添加劑以及奶牛生長(zhǎng)環(huán)境等硝酸鹽、亞硝酸鹽含量過(guò)高，都會(huì)發(fā)生牛奶中的硝酸鹽及亞硝酸鹽的超標(biāo)[7-8]。隨著人們生活質(zhì)量的提高，牛奶及奶制品在人們?nèi)粘ｏ嬍持兴急戎卦絹?lái)越大，質(zhì)量安全也越來(lái)越受到重視[9]。根據(jù)GB 2762—2022[10]《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》規(guī)定，生乳中亞硝酸鹽（以NaNO2計(jì)）限量為0.4 mg/kg，乳粉、調(diào)制乳粉及嬰幼兒配方食品中亞硝酸鹽（以NaNO2計(jì)）限量為2.0 mg/kg，嬰幼兒配方食品中硝酸鹽（以NaNO3計(jì)）限量為100 mg/kg。因此，加強(qiáng)預(yù)防和檢測(cè)牛奶及奶制品的硝酸鹽、亞硝酸鹽污染是非常必要的。

硝酸鹽和亞硝酸鹽檢測(cè)常用的方法有分光光度法[11-12]、電化學(xué)法[13-14]、分子熒光法[15-16]、氣相色譜法[17-18]、離子色譜法[19-20]等。分光光度法操作繁瑣，需鹽酸萘乙二胺柱前衍生，操作繁瑣，干擾大，會(huì)引入重金屬污染物鎘，對(duì)檢驗(yàn)員及環(huán)境危害很大。電化學(xué)法重現(xiàn)性不好，定量結(jié)果不精確。分子熒光法易受試樣中干擾物的影響導(dǎo)致相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差增大。氣相色譜法需配備電子捕獲檢測(cè)器，衍生試劑昂貴，操作過(guò)程復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。離子色譜法一直是牛奶及奶制品中硝酸鹽及亞硝酸鹽檢測(cè)的研究熱點(diǎn)，其前處理相對(duì)簡(jiǎn)單，分析快速，無(wú)有害物質(zhì)生成，分離度高，重現(xiàn)性好，可同時(shí)進(jìn)行多組分測(cè)試。此試驗(yàn)探索建立離子色譜法同時(shí)測(cè)定牛奶及奶制品中硝酸鹽、亞硝酸鹽的快速檢測(cè)方法，試樣用乙腈沉淀蛋白，經(jīng)固相萃取柱凈化，用陰離子交換柱IonPac AS 19分離，電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)，測(cè)定牛奶及奶制品中硝酸鹽、亞硝酸鹽的含量。旨在為更精確更快速地檢測(cè)牛奶及奶制品中硝酸鹽、亞硝酸鹽提供參考依據(jù)，達(dá)到有效監(jiān)控牛奶及奶制品中硝酸鹽、亞硝酸鹽含量的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)所用牛奶和奶制品（16個(gè)批次，每個(gè)批次均來(lái)自不同的生產(chǎn)廠家，市售）；硝酸根NO3-標(biāo)準(zhǔn)品[1 000 μg/mL，唯一標(biāo)識(shí)204036-3，國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心、國(guó)標(biāo)（北京）檢驗(yàn)認(rèn)證有限公司]；亞硝酸根NO2-標(biāo)準(zhǔn)品[1 000 μg/mL，唯一標(biāo)識(shí)223028-1，國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心、國(guó)標(biāo)（北京）檢驗(yàn)認(rèn)證有限公司]；乙腈、冰乙酸（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；鹽酸（原子熒光純，成都市科隆化工試劑廠）；實(shí)驗(yàn)室用水（超純水）（電阻率為18.25 MΩ·cm）。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo Scientific TM ICS-1 100離子色譜系統(tǒng)（含電導(dǎo)檢測(cè)器、陰離子抑制器、自動(dòng)淋洗液發(fā)生器、自動(dòng)進(jìn)樣器、色譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)，美國(guó)Thermo SCIENTIFIC公司）；XSE 205 DU電子天平[梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司]；TGL-16臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（四川蜀科儀器有限公司）；Dionex OnGuard II RP柱（1.0 mL）、DionexOnGuard II Ag柱（1.0 mL）、DionexOnGuard II Na柱（1.0 mL），Thermo SCIENTIFIC公司；UPT-II-10 T優(yōu)普系列超純水器（四川優(yōu)普超純科技有限公司）；0.22 μm水系進(jìn)口聚醚砜PES針式過(guò)濾器（美國(guó)PALL公司）；φ15 cm定量濾紙（杭州特種紙業(yè)有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：IonPacTMAS-194 mm×250 mm（帶IonPacTMAG-19型保護(hù)柱4 mm×50 mm）；淋洗液：淋洗液自動(dòng)發(fā)生器，濃度為6~70 mmol；抑制器：連續(xù)自動(dòng)再生膜陰離子抑制器；檢測(cè)器：電導(dǎo)檢測(cè)器，檢測(cè)池溫度：35 ℃；淋洗液流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣體積：50 μL。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確移取一定量的硝酸根NO3-標(biāo)準(zhǔn)品和亞硝酸根NO2-標(biāo)準(zhǔn)品，用水逐級(jí)稀釋成硝酸根NO3-濃度分別為0.00，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.50和2.00 mg/L，亞硝酸根NO2-濃度分別為0.00，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.15和0.20 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。在1.3.1小節(jié)色譜條件下從低到高濃度依次進(jìn)樣，得到上述各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖。以硝酸根NO3-和亞硝酸根NO2-的濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算線性回歸方程。

1.3.3 試樣制備

1.3.3.1 提取

牛奶：準(zhǔn)確稱取2.5 g（精確至0.01 g）試樣于25 mL比色皿中，加5~10 mL純水，加入10 mL乙腈，加水稀釋至刻度，搖勻超聲30 min，置75 ℃水浴放置5 min。采用定量濾紙初步過(guò)濾，取濾液于10 000 r/min速度離心15 min，取上清液備用。

奶粉、奶制品：準(zhǔn)確稱取2.5 g（精確至0.01 g）試樣，置于50 mL容量瓶中，加10 mL水，待充分溶解后，加入20 mL乙腈，加水稀釋至刻度，搖勻，超聲30 min，置75 ℃水浴中放置5 min，用水稀釋至刻度。溶液經(jīng)定量濾紙過(guò)濾后，于10 000 r/min離心15 min，取上清液備用。

1.3.3.2 凈化

取15 mL濾液，依次通過(guò)0.22 μm水性濾膜針頭濾器、DionexOnGuard II Ag柱、DionexOnGuard II Na柱、DionexOnGuard II RP柱，棄去前面3 mL，收集后面洗脫液待測(cè)。固相萃取柱使用前需進(jìn)行活化：Dionex-OnGuard II Ag柱和DionexOnGuard II Na柱用10 mL水通過(guò)，靜置活化30 min，OnGuard II RP柱使用前依次用10 mL甲醇、10 mL水通過(guò)，靜置活化30 min。

空白試驗(yàn)：除不加試樣外，按1.3.3小節(jié)方法操作，即得。

1.3.4 結(jié)果計(jì)算

式中：X為試樣中硝酸根NO3-或亞硝酸根NO2-的含量，mg/kg；C為測(cè)定用試樣溶液中的硝酸根NO3-或亞硝酸根NO2-的濃度，mg/L；Co為試劑空白液中硝酸根NO3-或亞硝酸根NO2-的濃度，mg/L；V為試樣溶液體積，mL；f為試樣溶液稀釋倍數(shù)；m為試樣取樣量，g；1 000為換算系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的選擇

2.1.1 沉淀劑的選擇

牛奶及奶制品中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，為了能夠充分提取試樣中的硝酸鹽和亞硝酸鹽，此試驗(yàn)比較了不同濃度的沉淀劑乙腈、冰乙酸、鹽酸沉淀蛋白的效果，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知：在乙腈與水體積比4∶6時(shí)，是理想的牛奶及奶制品中蛋白沉淀劑。

圖1 乙腈與水的體積比（A）、冰乙酸濃度（B）及鹽酸濃度（C）對(duì)硝酸鹽和亞硝酸鹽的回收率的影響

2.1.2 提取溫度的選擇

此試驗(yàn)考察了提取溫度為25，35，45，55，65，75，85和95 ℃時(shí)硝酸鹽和亞硝酸鹽的提取效果，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知：不同提取溫度對(duì)硝酸鹽和亞硝酸鹽的提取率影響比較明顯，當(dāng)提取溫度在75 ℃時(shí)，硝酸鹽和亞硝酸鹽的提取率趨于穩(wěn)定，提取完全，故本試驗(yàn)選擇提取溫度為75 ℃。

圖2 提取溫度對(duì)硝酸鹽和亞硝酸鹽的回收率的影響

2.1.3 提取時(shí)間的選擇

試驗(yàn)比較了超聲時(shí)間為5，10，20，30，40，50和60 min時(shí)硝酸鹽和亞硝酸鹽的提取效果，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，隨著超聲時(shí)間的增加，硝酸鹽和亞硝酸鹽的提取率逐漸增大，到30 min后基本趨于穩(wěn)定，為了加快前處理速度，節(jié)約時(shí)間，故此試驗(yàn)選擇超聲30 min為最佳提取時(shí)間。

圖3 提取時(shí)間對(duì)硝酸鹽和亞硝酸鹽的回收率的影響

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 專屬性考察

分別取混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，陰性試樣溶液及陰性加標(biāo)試樣溶液在1.3.1小節(jié)色譜條件下進(jìn)樣50 μL，記錄色譜圖，考察試驗(yàn)方法的專屬性，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，硝酸根NO3-和亞硝酸根NO2-保留時(shí)間分別為10.39和7.56 min，峰型對(duì)稱，加標(biāo)試樣出峰良好，該方法專屬性好，選擇性高，適合牛奶及奶制品中硝酸根NO3-和亞硝酸根NO2-的測(cè)定。

圖4 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（A），陰性試樣溶液（B）及陰性加標(biāo)試樣溶液（C）色譜圖

2.2.2 線性關(guān)系，方法檢出限和定量限考察

取硝酸根NO3-和亞硝酸根NO2-混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.3.1小節(jié)色譜條件從低到高濃度依次進(jìn)樣，分別以硝酸根NO3-和亞硝酸根NO2-的峰面積對(duì)質(zhì)量濃度計(jì)算線性回歸方程，確定相關(guān)系數(shù)。比較硝酸根NO3-和亞硝酸根NO2-色譜信號(hào)峰與基線信號(hào)，確定儀器最低檢出限（rSN=3），按試樣制備過(guò)程，分別得出方法檢出限與定量限，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知：硝酸根NO3-在0.0~2.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 9），且該方法檢出限為0.075 mg/kg，定量限為0.25 mg/kg；亞硝酸根NO2-在0.0~0.20 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 9），且該方法檢出限為0.05 mg/kg，定量限為0.17 mg/kg。試驗(yàn)結(jié)果均能完全滿足分析檢測(cè)要求。

表1 回歸方程，相關(guān)系數(shù)，最低檢出限，定量限

2.2.3 方法精密度考察

取0.20 mg/L硝酸根NO3-和亞硝酸根NO2-標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述條件下分別重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算其結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD），結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，硝酸根NO3-和亞硝酸根NO2-的峰面積SRSD分別為0.46%和0.43%，說(shuō)明該方法精密度良好。

表2 方法精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.2.4 穩(wěn)定性考察

取制備好的牛奶試樣供試品溶液，按1.3.1小節(jié)色譜條件每間隔4 h進(jìn)樣1次，測(cè)定硝酸根NO3-和亞硝酸根NO2-的質(zhì)量濃度，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，硝酸根NO3-和亞硝酸根NO2-穩(wěn)定性試驗(yàn)SRSD值分別為0.64%和0.62%，說(shuō)明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n=7）

2.2.5 回收率考察

為考察方法的準(zhǔn)確性，分別向牛奶，奶制品試樣中添加0.25，0.5和2.5 mg/kg硝酸根NO3-標(biāo)準(zhǔn)溶液以及0.12，0.24和1.20 mg/kg亞硝酸根NO2-標(biāo)準(zhǔn)溶液，各梯度同時(shí)平行測(cè)定3次，扣除樣品空白后，硝酸根NO3-和亞硝酸根NO2-平均回收率及其SRSD如表4所示。硝酸根NO3-平均回收率在92.98%~104.53%范圍內(nèi)，SRSD為0.91%~1.23%；亞硝酸根NO2-平均回收率在92.85%~105.50%范圍內(nèi)，SRSD為0.86%~1.21%。結(jié)果表明，該檢測(cè)方法準(zhǔn)確性良好，符合分析檢測(cè)要求。

表4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

2.2.6 實(shí)際試樣分析

利用此試驗(yàn)所建立的方法，對(duì)市面上采購(gòu)的16個(gè)批次牛奶和奶制品中硝酸根NO3-和亞硝酸根NO2-進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，該方法具有良好的適用性，色譜無(wú)干擾，不同廠家牛奶和奶制品中硝酸根NO3-和亞硝酸根NO2-含量存在一定的差異，均未超過(guò)食品中污染物限量值。

表5 實(shí)際試樣檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立了離子色譜法測(cè)定牛奶及奶制品中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量的方法。試樣以乙腈沉淀蛋白，超聲振蕩提取，固相萃取柱凈化除雜，采用IonPac AS 19陰離子交換色譜柱（250 mm×4 mm）分離，6~70 mmol/L KOH溶液梯度淋洗，抑制性電導(dǎo)檢測(cè)。該方法操作便捷，檢測(cè)時(shí)間短，靈敏度高，回收理想，精密度高，線性范圍廣，適合牛奶及奶制品中硝酸鹽和亞硝酸鹽的測(cè)定，可為牛奶及奶制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升和食品安全監(jiān)管提供一定的數(shù)據(jù)支撐，具有良好的推廣應(yīng)用價(jià)值。