黃瑩，趙彤，黃晶，孫鑫，陳曦，楊曉

中國健康促進基金會抗衰老營養(yǎng)與健康研發(fā)中心（武漢 430100）

近紅外光譜（near infrared spectroscopy，NIRS）技術(shù)是一項實現(xiàn)樣品定性或定量分析的綠色、快速直接分析方法[1]，其標(biāo)準(zhǔn)方法多達20余項[2]，被廣泛應(yīng)用到食品、制藥等領(lǐng)域。研究報道，Caporaso等[3]利用NIRS技術(shù)實現(xiàn)谷物無損質(zhì)量評估；Levasseur[4]和Femenias等[5]使用NIRS技術(shù)為谷物污染真菌后的檢測提供了便捷方法。NIRS技術(shù)在大米中的應(yīng)用非常普遍，如：鑒別摻假[6]、糊化[7]；區(qū)分不同地區(qū)[8-9]、年份的大米[10]；檢測蛋白質(zhì)[11]、重金屬[12]、直鏈淀粉[13]、水分[14]、脂肪酸[15]等，實現(xiàn)大米各項指標(biāo)的快速檢測。

大米加工過程中會產(chǎn)生大量碎米和米糠，這些副產(chǎn)物通常僅簡單處理后作為動物飼料利用，近年來這些副產(chǎn)物被加工提取得到大米肽，因為大米肽中的氨基酸和大米蛋白基本保持一致，但大米肽具有低抗原

性，低分子量，能被腸道快速吸收而被廣泛應(yīng)用。大米肽具有降血壓[16-17]、調(diào)節(jié)免疫[18-19]、抗氧化[20]、抗高尿酸[21]、預(yù)防阿爾茲海默病[22]及預(yù)防牙周炎[23]等生物活性。雖然NIRS技術(shù)在大米中的應(yīng)用較為廣泛，但關(guān)于該技術(shù)在大米肽的應(yīng)用鮮有報道，也缺乏相應(yīng)的國家和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致大米肽品質(zhì)參差不齊，實驗利用NIRS技術(shù)建立模型，通過近紅外光譜技術(shù)快速檢測大米肽蛋白質(zhì)、多肽、水分、灰分和脂肪含量的方法，為大米肽相關(guān)品質(zhì)指標(biāo)的快速檢測提供方法。

1 材料與方法

1.1 原料

105種大米肽（均為市售）。

1.2 材料與試劑

NaOH、CuSO4、K2SO4、H2SO4、HCl、硼酸、硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；TCA、酒石酸鉀鈉、乙酸鎂、無水乙醚、石油醚（沸程30~60 ℃，麥克林生化科技股份有限公司）；牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（Albumin Bovine V cas 9048-46-8≥98%，HPLC）。

1.3 儀器與設(shè)備

SPX622ZH電子天平[奧豪斯儀器（常州）有限公司]；TDZ5-WS離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；TU180紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；K1100全自動凱式定氮儀（海能未來技術(shù)集團股份有限公司）；JRX-10S曲線升溫消化爐（濟南精銳分析儀器有限公司）；S-433Dup全自動氨基酸分析儀[賽卡姆（北京）科學(xué)儀器有限公司]；HPX-9052MBE電熱恒溫干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司）；SupNIR-2700近紅外光譜儀[聚光科技（杭州）股份有限公司]。

1.4 試驗方法

1.4.1 測定蛋白質(zhì)的方法

參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定（第一法 凱氏定氮法）》，試驗重復(fù)3次取平均值。

1.4.2 測定多肽的方法

采用雙縮脲法，參考汪志華等[24]和魯偉等[25]的方法。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確配制分別為0，2，4，6，8和10 mg/mL的牛血清蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取1 mL，加入4 mL雙縮脲試劑?；旌暇鶆颍?5 ℃下放置30 min，并在540 nm下測量顏色。第一支不含牛血清蛋白質(zhì)溶液的比色管作為空白對照溶液。取2組測量值的平均值，以牛血清蛋白質(zhì)的含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.047 1X+0.003 4，R2=0.999。

將市售大米肽分別準(zhǔn)備3份，每份0.5 g左右，各用水溶解后定容至10 mL，每個樣品取1 mL分別加入3 mL 15%的三氯乙酸水溶液，于渦漩混合儀混合均勻，靜置10 min，在4 000 r/min下離心20 min，取1 mL上清液置另一支比色管中，加入4.0 mL雙縮脲試劑，搖勻后在30 ℃下放置30 min，于540 nm測定吸光度（A），試驗重復(fù)3次取平均值，肽含量（%）按式（1）計算。

式中：C為標(biāo)曲查得的牛血清蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL；V為取樣體積，mL；n為樣品稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量，g。

1.4.3 測定水分的方法

參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》（第一法 直接干燥法），試驗重復(fù)3次取平均值。

1.4.4 測定灰分的方法

參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測定》（第一法 食品中總灰分的測定），試驗重復(fù)3次取平均值。

1.4.5 測定脂肪的方法

參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定》（第一法 索氏抽提法），試驗重復(fù)3次取平均值。

1.4.6 近紅外光譜掃描參數(shù)

表1 近紅外光譜建掃描參數(shù)

1.4.7 建模方法和異常樣品剔除

根據(jù)105個大米肽樣品的蛋白質(zhì)、多肽、水分、灰分和脂肪含量和近紅外的光譜數(shù)據(jù)，采用偏最小二乘（partial least squares，PLS）回歸方法分別對這5個指標(biāo)建立定量模型，并對模型進行優(yōu)化，結(jié)合Savitzky-Golay-平滑、Savitzky-Golay-導(dǎo)數(shù)、多元散射校正、均值中心化等光譜預(yù)處理方法，得到大米肽主要成分的模型，并以模型評價參數(shù)SEC、RC、SECV、SEP、RP、RPDC、RPDV表征模型的預(yù)測效果[26-27]。

建模過程中，發(fā)現(xiàn)異常樣品，一般要遵循重構(gòu)光譜殘差、預(yù)測濃度殘差、杠桿值與學(xué)生化殘差及光譜PLS分解主成分得分的聚類分析等標(biāo)準(zhǔn)進行異常樣品的剔除[28]。

2 結(jié)果與討論

2.1 大米肽樣品掃描結(jié)果

大米肽樣品經(jīng)掃描后得到的近紅外光譜如圖1所示。大米肽樣品的蛋白質(zhì)、多肽、水分、灰分和脂肪含量結(jié)果見表2。

圖1 大米肽樣品近紅外反射光譜

表2 大米肽樣品的主要成分指標(biāo)的含量

2.2 數(shù)據(jù)處理

對表2中105個大米肽樣品的蛋白質(zhì)、多肽、水分、灰分和脂肪進行統(tǒng)計分析，可知：105個大米肽樣品的蛋白質(zhì)含量范圍為29.73%~103.00%，平均為64.84%±21.93%；多肽含量范圍為25.88%~78.97%，平均為52.50%±16.95%；水分范圍為3.71%~8.34%，平均為6.29%±1.00%；灰分范圍為0.28%~5.63%，平均為2.07%±1.21%；脂肪的含量范圍為0.01%~0.45%，平均為0.13%±0.08%。上述指標(biāo)的數(shù)據(jù)范圍可用于近紅外光譜技術(shù)定量建模，將105個數(shù)據(jù)中84個樣品作為定標(biāo)集建立模型，21個樣本作為驗證集驗證模型，數(shù)據(jù)統(tǒng)計如表3所示。

表3 大米肽樣本主要成分數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2.3 大米肽樣品主要成分模型指標(biāo)的建立

利用近紅外光譜儀對大米肽樣品進行建模方法的預(yù)處理，得到各主要成分模型的最佳條件，結(jié)果如表4所示。

表4 大米肽蛋白質(zhì)、多肽、水分、灰分和脂肪模型的最佳條件

通過化學(xué)計量學(xué)軟件得到各主要成分的馬氏距離值與學(xué)生化殘差值，從而排除異常樣品。發(fā)現(xiàn)排除異常樣品后的模型預(yù)測能力優(yōu)于排除異常樣品前。最終優(yōu)化后各主要成分的模型參數(shù)如表5所示。

表5 大米肽樣品蛋白質(zhì)、多肽、水分、灰分和脂肪的內(nèi)部驗證結(jié)果

發(fā)現(xiàn)模型預(yù)測值和實測值的相關(guān)系數(shù)分別為0.983 26，0.985 73，0.968 86，0.978 60和0.976 51，說明各主要成分預(yù)測值和實測值的相關(guān)性較高。將各主要成分的實測值與光譜數(shù)據(jù)相對應(yīng)，擬合出大米肽蛋白質(zhì)模型、多肽模型、水分模型、灰分模型和脂肪模型，如圖2所示。其中，大米肽蛋白質(zhì)模型的線性方程為Y=0.983 26X+1.067 80，多肽模型的線性方程為Y=0.985 73X+0.760 69，水分模型的線性方程為Y=0.968 86X+0.195 71，灰分模型的線性方程為Y=0.978 60X+0.041 71，脂肪模型的線性方程為Y=0.976 51X+0.002 43。

圖2 基于近紅外光譜參數(shù)的大米肽蛋白質(zhì)（a）、多肽（b）、水分（c）、灰分（d）和脂肪（e）的預(yù)測模型

2.4 大米肽樣品主要成分模型指標(biāo)的檢驗

分別對驗證集中21個樣品進行光譜掃描，采用2.3建立的模型預(yù)測蛋白質(zhì)、多肽、水分、灰分和脂肪的含量，預(yù)測值和實際值對比結(jié)果如表6所示。通過t檢驗發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)、多肽、水分、灰分和脂肪的實測值和預(yù)測值相比較均無顯著性差異，主要表現(xiàn)為蛋白質(zhì)（t=0.488，P=0.631＞0.05）、多肽（t=-0.180，P=0.986＞0.05）、水分（t=1.056，P=0.304＞0.05）、灰分（t=1.743，P=0.097＞0.05）和脂肪（t=1.606，P=0.124＞0.05），說明模型具有較好的預(yù)測能力。

表6 預(yù)測模型對大米肽樣品蛋白質(zhì)、多肽、水分、灰分和脂肪含量的預(yù)測結(jié)果

3 結(jié)論

大米肽樣品蛋白質(zhì)含量范圍為29.73%~103.00%，平均為64.84%±21.93%；多肽含量范圍為25.88%~78.97%，平均為52.50%±16.95%；水分范圍為3.71%~8.34%，平均為6.29%±1.00%；灰分范圍為0.28%~5.63%，平均為2.07%±1.21%；脂肪含量范圍為0.01%~0.45%，平均為0.13%±0.08%；數(shù)據(jù)范圍可用于近紅外光譜技術(shù)定量建模。

根據(jù)PLS分別建立大米肽蛋白質(zhì)、多肽、水分、灰分和脂肪的最優(yōu)模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型預(yù)測值和實測值的相關(guān)系數(shù)分別為0.983 26，0.985 73，0.968 86，0.978 60和0.976 51，說明各主要成分預(yù)測值和實測值的相關(guān)性較高。對模型進行外部驗證，蛋白質(zhì)、多肽、水分、灰分和脂肪的實測值和預(yù)測值相比較均無顯著性差異，主要表現(xiàn)為蛋白質(zhì)（t=0.488，P=0.631＞0.05）、多肽（t=-0.180，P=0.986＞0.05）、水分（t=1.056，P=0.304＞0.05）、灰分（t=1.743，P=0.097＞0.05）和脂肪（t=1.606，P=0.124＞0.05），說明模型具有較好的預(yù)測能力。

關(guān)于NIRs技術(shù)在大米肽的應(yīng)用報道相對較少，大部分集中在大米上面的應(yīng)用，如：黃林森等[29]采用近紅外定量模型快速檢測大米的營養(yǎng)成分，實現(xiàn)營養(yǎng)成分的快速檢測；路輝等[30]對大米直鏈淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪、水分建立近紅外光譜檢測模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用近紅外光譜可以實現(xiàn)對大米中營養(yǎng)成分含量同時快速無損的檢測；李路等[31]對大米蛋白質(zhì)、脂肪、總糖、水分近紅外檢測模型研究，驗證該模型適用于大米營養(yǎng)成分的近紅外快速檢測。試驗說明NIRs技術(shù)在對大米營養(yǎng)成分的快速檢測十分方便和快捷，驗證NIRs技術(shù)對大米肽主要成分的快速檢測同樣適用，為大米肽主要成分的快速檢測提供理論依據(jù)。