沈昌瑩，蘇駿敏，莫淑梅，朱潔靈

東莞市食品藥品檢驗(yàn)所（東莞 523808）

NDMA是由其前體物質(zhì)亞硝酸鹽和胺類在一定條件下發(fā)生亞硝基化反應(yīng)生成的一類亞硝胺類化合物[1]，具有強(qiáng)致癌性和肝毒性，長(zhǎng)期小劑量攝入和一次性大劑量攝入均可引發(fā)癌癥[2]。在2013年的復(fù)旦投毒案中，受害人因被投毒NDMA，導(dǎo)致急性肝壞死引起急性肝功能衰竭，繼發(fā)多器官功能衰竭死亡；2018年，加拿大女王大學(xué)的中國(guó)博士留學(xué)生投毒室友一案中，受害人因多次攝入NDMA最終導(dǎo)致肝臟嚴(yán)重受損。在食品尤其是腌臘肉制品中，常用作發(fā)色和抑菌作用的亞硝酸鹽與微生物分解蛋白質(zhì)形成的胺類為NDMA的形成提供了條件。因此，GB 2762—2022《食品中安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》[3]規(guī)定肉及肉制品中NDMA的限量為3.0 μg/kg。目前檢測(cè)食品中的NDMA主要采用GB 5009.26—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中N-亞硝胺類化合物的測(cè)定》[4]，該方法利用水蒸氣蒸餾的方式提取試樣中的NDMA，經(jīng)二氯甲烷萃取濃縮后，采用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS）中的選擇離子掃描（SIM）模式進(jìn)行測(cè)定。采用國(guó)標(biāo)方法測(cè)定時(shí)，稱樣量需要200 g，平行測(cè)定時(shí)最少需要400 g，試樣取樣量大；單個(gè)試樣需要用到70 g氯化鈉和250 mL的二氯甲烷，對(duì)試劑的消耗量大；實(shí)驗(yàn)室多用凱氏定氮儀進(jìn)行蒸餾提取，單次只能蒸餾一個(gè)試樣，后續(xù)對(duì)提取液進(jìn)行萃取和減壓蒸餾濃縮，試驗(yàn)過(guò)程耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)；采用SIM模式進(jìn)行測(cè)定時(shí)，由于NDMA經(jīng)電離后產(chǎn)生特征碎片離子質(zhì)量較小，樣品基質(zhì)對(duì)目標(biāo)峰影響較大，定性不夠準(zhǔn)確。近年來(lái)許多關(guān)于氣相色譜質(zhì)譜法測(cè)定肉制品中的NDMA的研究被報(bào)道，通過(guò)減少試樣的取樣量至10~25 g，經(jīng)水、乙腈或二氯甲烷提取，結(jié)合QuEChERS或固相萃取柱凈化，采用SIM或MRM模式進(jìn)行測(cè)定，外標(biāo)或同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量[5-8]。此研究建立了一種采用超純水提取、乙腈萃取、QuEChERS凈化的GC-MS/MS同位素內(nèi)標(biāo)法測(cè)定腌臘肉制品中的NDMA，可以減少測(cè)定肉制品中的NDMA所需要的試樣和試劑用量，提高提取和凈化的效率，測(cè)定時(shí)采用MRM模式減少雜質(zhì)對(duì)NDMA的定性的干擾，在稱樣后加入NDMA的同位素內(nèi)標(biāo)N-二甲基亞硝胺-D6（NDMA-D6）減少實(shí)驗(yàn)和進(jìn)樣過(guò)程對(duì)定量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試樣及來(lái)源

臘肉、臘腸、臘鴨（市售）。

1.1.2 試劑及來(lái)源

乙腈（色譜純，德國(guó)Merck集團(tuán)）；試劑組合1：Agilent Bond Elut EMR-Lipid dSPE增強(qiáng)型脂質(zhì)去除凈化管、Agilent Bond Elut EMR-Lipid Polish反萃管（美國(guó)安捷倫科技公司）；試劑組合2：N-二甲基亞硝胺專用凈化鹽包、QuEChERS凈化管（深圳逗點(diǎn)生物技術(shù)有限公司）；試驗(yàn)用水（Milli-Q超純水）。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)品及來(lái)源

NDMA（CAS號(hào)：62-75-9；質(zhì)量濃度100.1 μg/mL，北京曼哈格生物科技有限公司）；NDMA-D6（CAS號(hào)：17829-05-9；質(zhì)量濃度100.1 μg/mL，北京曼哈格生物科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

1.2.1 輔助儀器設(shè)備及來(lái)源

HS 501數(shù)顯型震蕩搖床（德國(guó)IKA公司）；BC-1 000多管渦旋混勻儀（深圳逗點(diǎn)生物公司）；3 K 15低溫離心機(jī)（配備19776-H轉(zhuǎn)子，德國(guó)SIGMA公司）；移液器（規(guī)格：200 μL，1 000 μL，5 mL和10 mL；德國(guó)Eppendorf公司）。

1.2.2 計(jì)量?jī)x器設(shè)備及來(lái)源

MS1 003 TS電子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；TQ 8050氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本SHIMADZU公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

氣相條件：毛細(xì)管氣相色譜柱：HP-INNOWAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣：高純度氦氣（純度≥99.999%）；柱流量：1 mL/min；進(jìn)樣口溫度：220 ℃；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣體積：1 μL。升溫程序見(jiàn)表1。

表1 升溫程序

質(zhì)譜條件：離子源，電子轟擊源（EI）；傳輸線溫度：230 ℃；離子源溫度：230 ℃；溶劑延遲時(shí)間：5 min；監(jiān)測(cè)方式：MRM；NDMA和NDMA-D6的保留時(shí)間（RT）、定性離子、定量離子和碰撞電壓（CE）見(jiàn)表2。

表2 NDMA和NDMA-D6的RT、定性離子、定量離子和CE

1.3.2 樣品前處理

稱取10 g試樣于50 mL離心管中，加入200 ng內(nèi)標(biāo)溶液，加入20 mL超純水，振蕩提取30 min，按4 ℃，9 000 r/min離心5 min，取8 mL上清液，加入8 mL乙腈，加入4 g氯化鈉，振蕩15 min，按9 000 r/min離心2 min，取乙腈上清液至50 mL離心管，加入凈化鹽包，渦旋1 min，按9 000 r/min離心2 min，取4 mL上清液到凈化管，渦旋15 min，按9 000 r/min離心2 min過(guò)0.22有機(jī)濾膜后上機(jī)。并進(jìn)行空白試驗(yàn)。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確移取1.00 mL NDMA母液至50.0 mL容量瓶中，乙腈定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為2.00 μg/mL的目標(biāo)物一級(jí)稀釋液（a液），于4 ℃避光保存；準(zhǔn)確移取0.100 mL a液至10.00 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為20.0 ng/mL的目標(biāo)物二級(jí)稀釋液（b液，臨用現(xiàn)配）；準(zhǔn)確移取0.200 mL NDMA-D6母液至20.00 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為1.00 μg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液（c液），于4 ℃避光保存。分別準(zhǔn)確移取0.200，0.250，0.500，1.00和2.50 mL b液以及0.050 0，0.100 mL a液于10.00 mL容量瓶中，分別加入0.100 mL c液，用乙腈定容至刻度，得到NDMA質(zhì)量濃度分別為0.400，0.500，1.00，2.00，5.00，10.0和20.0 ng/mL以及NDMA-D6質(zhì)量濃度均為10.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

2.1.1 氣相條件的優(yōu)化

采用與國(guó)標(biāo)方法中性能相似的毛細(xì)管氣相色譜柱以及與國(guó)標(biāo)方法相同的氣相色譜條件，對(duì)NDMA和NDMA-D6進(jìn)行全掃，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NDMA和NDMA-D6的保留時(shí)間在升溫程序從80 ℃升溫至90 ℃的過(guò)程中，因此升溫程序從40 ℃升至80 ℃后，以1 ℃/min升至90℃，NDMA和NDMA-D6出峰后即可以20 ℃/min升至240 ℃。優(yōu)化后的運(yùn)行時(shí)間為24 min，相較國(guó)標(biāo)方法的33 min縮短了9 min，大大縮短儀器進(jìn)樣分析時(shí)間。

2.1.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用優(yōu)化后的氣相色譜條件對(duì)NDMA和NDMA-D6分別進(jìn)行全掃，獲得NDMA和NDMA-D6的保留時(shí)間和前體離子，CE以3 V為步長(zhǎng)從3 V到45 V，共創(chuàng)建15個(gè)不同CE的產(chǎn)物離子掃描方法，對(duì)NDMA和NDMA-D6的混合溶液進(jìn)樣分析，將得到的數(shù)據(jù)輸入軟件分析后得出NDMA和NDMA-D6各兩對(duì)離子對(duì)信息及其最佳CE，見(jiàn)圖1。

圖1 NDMA和NDMA-D6的產(chǎn)物離子信息

2.2 前處理的優(yōu)化

2.2.1 提取試劑的選擇

在50 mL離心管中加入100 ng的NDMA和100 ng的NDMA-D6，采用1.1.2小節(jié)中兩種試劑組合按照各自使用方法提取和凈化（稀釋倍數(shù)均為10），取上清液過(guò)膜后上機(jī)，比較空白加標(biāo)回收率，試劑組合1處理后的空白加標(biāo)回收率約為80%，試劑組合2處理后的空白加標(biāo)回收率約為100%，可知選用試劑組合2處理更合理。

2.2.2 提取方法的優(yōu)化

稱取多份腌臘肉制品試樣各10 g試樣于50 mL離心管中，采用試劑組合2進(jìn)行提取和凈化，進(jìn)樣分析后發(fā)現(xiàn)部分試樣的NDMA定量離子左側(cè)有雜峰，如圖2（a）所示。雜峰保留時(shí)間與NDMA定量離子保留時(shí)間接近，會(huì)影響部分試樣中NDMA的準(zhǔn)確定量，這是由于試樣直接經(jīng)乙腈提取，凈化不充分導(dǎo)致進(jìn)樣試液中仍帶有部分干擾成分。根據(jù)NDMA易溶于水的特點(diǎn)，采用超純水對(duì)試樣進(jìn)行提取，低溫離心除去油脂，再用乙腈萃取水提取液中的NDMA，通過(guò)加入氯化鈉使乙腈與水分層，最后用試劑組合2對(duì)乙腈層進(jìn)行凈化，進(jìn)樣分析后，如圖2（b和c）所示，同一試樣中的NDMA定量離子的峰不受雜峰干擾。因此，確定提取流程為采用20 mL超純水提取10 g腌臘肉制品，低溫離心除脂后，再用8 mL乙腈萃取8 mL水提取液，乙腈提取液經(jīng)試劑組合2凈化后進(jìn)樣分析（稀釋倍數(shù)為20）。

圖2 MRM模式下不同前處理NDMA的色譜圖

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性關(guān)系和SLOQ

經(jīng)乙腈稀釋的0.400~20.0 ng/mL的NDMA標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，以NDMA-D6為內(nèi)標(biāo)，采用優(yōu)化后的儀器條件進(jìn)樣分析，NDMA和NDMA-D6各離子對(duì)的色譜圖見(jiàn)圖3。以濃度比率為橫坐標(biāo)，以NDMA定量離子峰面積與NDMA-D6定量離子峰面積比值為縱坐標(biāo)，采用強(qiáng)制通過(guò)原點(diǎn)的方式繪制校準(zhǔn)曲線，如圖4所示，NDMA的線性關(guān)系良好，線性回歸方程為Y=0.081 33X，相關(guān)系數(shù)（R）為0.999 983，判定系數(shù)（R2）為0.999 966，滿足GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》[9]對(duì)校準(zhǔn)曲線線性回歸方程相關(guān)系數(shù)的要求。為滿足對(duì)試樣定量與結(jié)果判定的需求，制備加標(biāo)試樣，經(jīng)優(yōu)化后的條件前處理和進(jìn)樣分析，劃定NDMA定量離子對(duì)的峰約10倍信噪比時(shí)所對(duì)應(yīng)的含量為SLOQ，結(jié)果見(jiàn)圖5，劃定SLOQ為1.00 μg/kg，信噪比為12.32。結(jié)果表明，此研究相較國(guó)標(biāo)方法，在減少稱樣量和試劑使用量以及簡(jiǎn)化提取凈化流程后，依然能達(dá)到國(guó)標(biāo)方法的SLOQ。

圖3 NDMA和NDMA-D6各離子的疊加色譜圖

圖4 NDMA的校準(zhǔn)曲線圖譜

圖5 NDMA的SLOQ色譜圖

2.3.2 準(zhǔn)確度和精密度

以SLOQ、3倍SLOQ（即肉及肉制品中NDMA限量）、20倍SLOQ進(jìn)行三水平六平行加標(biāo)試驗(yàn)，每個(gè)水平稱取六份10 g的陰性試樣，三個(gè)水平分別加入10.0，30.0和200 ng的NDMA標(biāo)準(zhǔn)溶液以及200 ng的NDMA-D6標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備1.00，3.00和20.0 μg/kg的加標(biāo)樣液，記錄平均回收率和SRSD。如表3所示，結(jié)果滿足GB/T 27404—2008[9]中對(duì)回收率和精密度的要求。

表3 NDMA的平均回收率及SRSD（n=6）

2.4 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用此研究所建立的方法測(cè)定市售的4批臘腸、3批臘肉、3批臘鴨共10批腌臘肉制品試樣，檢測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10批腌臘肉制品均無(wú)檢出，符合GB 2762—2022[3]中肉及肉制品中NDMA的規(guī)定。

3 結(jié)論

此研究基于國(guó)標(biāo)方法，優(yōu)化了儀器條件和前處理?xiàng)l件，建立了一種QuEChERS結(jié)合GC-MS/MS的同位素內(nèi)標(biāo)法測(cè)定腌臘肉制品中NDMA的方法。該方法減少取樣量以及減少試劑使用量，簡(jiǎn)化提取和凈化過(guò)程，縮短了進(jìn)樣分析時(shí)間，降低檢測(cè)過(guò)程對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的要求；以MRM模式代替SIM模式，以內(nèi)標(biāo)法代替外標(biāo)法定量，提高了定性和定量分析的準(zhǔn)確性，為測(cè)定腌臘肉制品中的NDMA提供一種新的可靠方法。