張汝凡，閆瑛楠，鄭婕

河南省食品和鹽業(yè)檢驗(yàn)技術(shù)研究院（鄭州 450003）

豆芽是我國的一種傳統(tǒng)食材，因其營養(yǎng)豐富且價(jià)格低廉深受消費(fèi)者喜愛[1-2]。然而豆芽在培育的過程中極易受到各種微生物的侵蝕，其中以克雷伯菌屬和埃希菌屬的數(shù)量最多[3]。為防止豆芽腐敗，部分生產(chǎn)者會(huì)在生產(chǎn)運(yùn)輸中添加喹諾酮類抗生素。喹諾酮是一種廣譜抗菌藥，其效用明顯且價(jià)格相對(duì)較低，能夠有效抑制細(xì)菌內(nèi)的脫氧核糖核酸旋轉(zhuǎn)酶的活性，使其無法做到正常分裂，從而達(dá)到殺菌作用[4-5]。有研究表明，長(zhǎng)期食用含有喹諾酮類藥物殘留的食品會(huì)導(dǎo)致相關(guān)藥物在人體內(nèi)蓄積，可能會(huì)造成食用者消化系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及消化系統(tǒng)（消化系統(tǒng)改為肝腎心臟）等產(chǎn)生不良反應(yīng)[6-7]，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致人體的耐藥性變強(qiáng)，進(jìn)而影響相關(guān)疾病的治療效果[8-11]。因此，為保障消費(fèi)者的健康和安全，開展豆芽中喹諾酮類藥物檢測(cè)非常有必要。

針對(duì)豆芽中的喹諾酮類藥物的檢驗(yàn)方法以高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法為主[12-15]，前處理方法有液液萃取法[16]、固相萃取法[17]和QuEChERS法[18]等，但是這些方法都存在不同程度的問題。QuEChERS法作為一種廣泛用于農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)的新型快速前處理技術(shù)，對(duì)樣品中的蛋白質(zhì)及脂類去除效果明顯[19-23]。試驗(yàn)旨在建立一種快速便捷的QuEChERS檢測(cè)方法，為豆芽中喹諾酮藥物殘留的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供更加高效精準(zhǔn)的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆芽，從鄭州市各大市場(chǎng)、超市隨機(jī)抽取。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：恩諾沙星（enrofloxacin，CAS號(hào)：93106-60-6）、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CAS號(hào)85721-33-1）、諾氟沙星（norfloxacin，CAS號(hào)70458-96-7）、達(dá)氟沙星（danofloxacin，CAS號(hào)112398-08-0）、培氟沙星（pefloxacin，CAS號(hào)70458-92-3）、沙拉沙星（sarafloxacin，CAS號(hào)98105-99-8）、氧氟沙星（ofloxacin，CAS號(hào)82419-36-1）、奧比沙星（orbifloxacin，CAS號(hào)113617-63-3）、雙氟沙星（difloxacin，CAS號(hào)98106-17-3）、氟羅沙星（fleroxacin，CAS號(hào)79660-72-3）、依諾沙星（enoxacin，CAS號(hào)74011-58-8）、司帕沙星（sparfloxacin，CAS號(hào)111542-93-9）、氟甲喹（flumequine，CAS號(hào)42835-25-6）、噁喹酸（oxolinic acid，CAS號(hào)26893-27-6）、洛美沙星（lomefloxacin，CAS號(hào)98079-51-7），質(zhì)量濃度均為100 μg/mL，純度均為100%，天津阿爾塔科技有限公司。甲酸、乙腈（質(zhì)譜純，德國默克公司）；試驗(yàn)用水為Milli-Q超純水；氯化鈉（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；乙二胺-N-丙基硅烷（PSA，Biosun有限公司）；無水硫酸鎂（MgSO4，天津大茂化學(xué)試劑廠）；十八烷基硅烷（C18，上海安譜公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀（Agilent 1290-6470，安捷倫科技有限公司）；電子分析天平（ME204，梅特勒托利多科技有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（SIGMA 4-16KS，德國SIGMA公司）；振蕩器（MV-3000，北京萊譜科技有限公司）；渦旋混合器（WH966，上?？等A生化儀器制造有限公司）；超聲波清洗器（KQ-500TDB，昆山超聲儀器有限公司）；全自動(dòng)氮吹儀（ORGN-EVAP24，美國Organomation公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

稱取5 g（精確至0.001 g）豆芽樣品置于50 mL塑料離心管中，加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入10 mL 1%甲酸乙腈溶液，加入5 g氯化鈉，渦旋混合1 min，超聲提取15 min后，以10 000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，殘?jiān)?0 mL 1%甲酸乙腈溶液同法重復(fù)提取1次，合并2次上清液，充分混勻，待凈化。吸取5 mL上清液于QuEChERS提取凈化管中（含100 mg MgSO4+100 mg C18），劇烈振蕩2 min，以10 000 r/min離心5 min，精密吸取2 mL上清液于10 mL離心管中，在40 ℃水浴中氮?dú)獯抵两桑瑲堅(jiān)屑尤? mL 20%乙腈水溶液，渦旋溶解，過0.22 μm有機(jī)濾膜后，供高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.3.2 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確吸取15種喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各100 μL于同一10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋并定容至刻度，振蕩搖勻后，作為混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20 ℃避光保存。選擇豆芽空白樣品進(jìn)行提取、凈化等前處理，得到空白基質(zhì)溶液。準(zhǔn)確吸取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用豆芽空白基質(zhì)溶液將混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成質(zhì)量濃度為1，2，5，10，20和50 ng/mL的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.3 色譜條件

色譜柱Agilent Eclipse XDB-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流速0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量2 μL；流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈，流動(dòng)相梯度；洗脫條件見表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

1.3.4 質(zhì)譜條件

離子源采用電噴霧離子源（ESI），正離子掃描；氣簾氣壓力（CUR）5 psi；電噴霧電壓（IS）4 000 V（正離子模式）；離子源溫度（TEM）340 ℃；質(zhì)譜掃描方式采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）；15種喹諾酮類藥物的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 15種喹諾酮類藥物的質(zhì)譜參數(shù)

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

文獻(xiàn)報(bào)道的前處理方法中，抗生素選用較多的提取溶劑有甲醇、乙腈、酸化乙腈和EDTA-Mcllvaine緩沖溶液等。與甲醇相比，乙腈具有較低的基質(zhì)干擾效應(yīng)，易于沉淀蛋白，更容易通過鹽析從水相中分離出來，對(duì)于喹諾酮類藥物而言，酸性提取劑可以提高目標(biāo)物的離子化效率，促進(jìn)[M+H]+峰的形成，提高質(zhì)譜響應(yīng)并改善峰形，回收率也會(huì)有所提升[19]。所以試驗(yàn)考察乙腈、1%甲酸乙腈、1%乙酸乙腈、EDTAMcllvaine緩沖溶液4種試劑作為提取溶劑進(jìn)行前處理提取。經(jīng)前處理試驗(yàn)驗(yàn)證，EDTA-Mcllvaine緩沖溶液提取出的溶液混沌度高，經(jīng)高速冷凍離心后樣品基質(zhì)與提取液仍不能進(jìn)行有效分離，可見EDTA-Mcllvaine緩沖溶液對(duì)豆芽中的脂肪蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的去除效果較差，在后續(xù)檢測(cè)過程中可能會(huì)損壞色譜柱，污染檢測(cè)器，故排除此提取溶劑。其他3種提取溶劑經(jīng)儀器測(cè)定，以化合物對(duì)應(yīng)峰面積為指標(biāo)，考察提取結(jié)果，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示，1%甲酸乙腈對(duì)豆芽中的15種喹諾酮類藥物的提取效果較優(yōu)，故選定1%甲酸乙腈溶液作為提取溶劑。

圖1 不同提取試劑對(duì)豆芽中15種喹諾酮類藥物的提取結(jié)果對(duì)比

2.2 凈化條件的優(yōu)化

N-丙基乙二胺（primary secondary amine sorbent，PSA）可去除樣品基質(zhì)中的極性干擾物質(zhì)；C18作為一種反向硅膠鍵合吸附劑，可較好地吸附脂肪，除去樣品中脂類雜質(zhì)；無水硫酸鎂（MgSO4）可快速吸附樣本中多余的水分，降低目標(biāo)物在水相中的溶解[19]，故試驗(yàn)考察PSA、C18、無水硫酸鎂3種凈化材料對(duì)喹諾酮類藥物回收率的影響，樣品在使用相同提取試劑以及相同加標(biāo)量10 μg/kg條件下分別考察凈化材料單獨(dú)使用與組合使用對(duì)待測(cè)物回收率的影響，效果對(duì)比如圖2所示。結(jié)果表明100 mg MgSO4+100 mg C18對(duì)目標(biāo)化合物的凈化效果最好，所以選擇100 mg MgSO4+100 mg C18作為凈化劑。

圖2 不同凈化條件下的凈化效果比較

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

由于喹諾酮類化合物的分子結(jié)構(gòu)中含有羰基結(jié)構(gòu)，在質(zhì)譜ESI源的正離子模式下易于形成[M+H]+的準(zhǔn)分子離子，正離子模式下的響應(yīng)值遠(yuǎn)高于負(fù)離子模式[24]。所以試驗(yàn)采用ESI+模式對(duì)15種目標(biāo)化合物進(jìn)行質(zhì)譜全掃描分析，得到相應(yīng)的母離子后，通過測(cè)試不同的Fragmentor電壓值下母離子的響應(yīng)強(qiáng)度選出最佳電壓值，而后進(jìn)行子離子掃描，選出2個(gè)響應(yīng)值最高的特征離子作為定量離子和定性離子。在MRM模式下優(yōu)化碰撞能量（collision energy，CE），確定每種化合物的最佳質(zhì)譜條件，15種喹諾酮類藥物質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化結(jié)果見表2，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)提取的離子色譜圖見圖3。

圖3 15種喹諾酮類藥物的離子色譜圖

2.4 線性關(guān)系及定量限

將空白樣品按上述前處理方法制得空白基質(zhì)溶液，用空白基質(zhì)溶液將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成1，2，5，10，20和50 ng/mL的系列溶液。以目標(biāo)化合物定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)得到線性回歸方程。15種喹諾酮類化合物在豆芽基質(zhì)中的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.997，表明在1~50 ng/mL范圍內(nèi)各化合物均呈良好的線性關(guān)系。通過豆芽的陰性樣品加標(biāo)測(cè)定，15種喹諾酮類藥物在3 μg/kg的添加水平下經(jīng)過前處理所得試液的信噪比（rSN）均大于10，表明該方法15種喹諾酮類化合物的定量限均可達(dá)3 μg/kg。線性方程、相關(guān)系數(shù)及定量限見表3。

表3 豆芽中15種喹諾酮類藥物的線性關(guān)系及定量限

2.5 方法回收率和精密度

分別制備相當(dāng)于含15種喹諾酮類藥物10，20和80 μg/kg的低、中、高3個(gè)濃度水平豆芽樣品，每個(gè)水平分別做6份平行試驗(yàn)，計(jì)算回收率和精密度。15種喹諾酮類藥物在豆芽中不同濃度的回收率及精密度見表4。結(jié)果顯示，15種喹諾酮在10 μg/kg的添加水平下，回收率為75.1%~102.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）為2.4%~9.3%（n=6），在20 μg/kg的添加水平下，回收率為77.2%~97.4%，SRSD為1.3%~9.0%（n=6），在80 μg/kg的添加水平下，回收率為74.3%~96.6%，SRSD為2.2%~8.6%（n=6）。在不同的添加水平下，樣品基質(zhì)中的重現(xiàn)性與平行性均較好，可滿足多種樣品基質(zhì)大批量檢測(cè)的需求。表明該方法準(zhǔn)確性、精密度和重復(fù)性良好。

表4 豆芽中15種喹諾酮類藥物的回收率及精密度（n=6）

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

從周邊不同市場(chǎng)隨機(jī)購買28批豆芽進(jìn)行檢測(cè)，共有8個(gè)批次檢出環(huán)丙沙星，含量介于20.9~685 μg/kg，檢出率為28.6%。整個(gè)試驗(yàn)過程操作快速便捷，檢驗(yàn)效率高，表明該方法適合用于大批量豆芽樣品的檢測(cè)。

3 結(jié)論

試驗(yàn)改進(jìn)豆芽中15種喹諾酮類化合物測(cè)定的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法，從經(jīng)濟(jì)成本上考慮，QuEChERS前處理方法相較傳統(tǒng)的HLB柱固相萃取柱凈化法，節(jié)約了試驗(yàn)成本。從效率上考慮，QuEChERS前處理操作更加簡(jiǎn)單快速、凈化效果良好、試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，能一次性測(cè)定豆芽中15種喹諾酮類化合物，滿足監(jiān)管需要，可為豆芽中喹諾酮藥物殘留的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支持。