張巖，曹薇，熊小寶，趙玉龍，鄧鎮(zhèn)濤

遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū)生物工程系（珠海 519041）

四季桔（Citrus mitisBlanco）是蕓香科（Rutaceae）柑橘屬（CitrusL.）常綠灌木或小喬木，是金桔（Fortunella margarita）和柑橘（Citrus reticulata）的雜交種，分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)，我國(guó)南方栽培較為常見(jiàn)。樹(shù)冠聚集，葉為深綠色，呈橢圓形。果實(shí)成熟時(shí)為橘黃色，直徑約3~3.5 cm，果肉可食，口味較酸，可代綠檬使用。藥用價(jià)值明顯，有化痰、止咳、理氣、消食等功效[1]，民間應(yīng)用廣泛。

四季桔作為一種觀賞植物，在南方地區(qū)尤受歡迎。年前常被“請(qǐng)進(jìn)家門”，俗稱“年桔”。但節(jié)慶一過(guò)就要“下崗”，2020年僅深圳福田區(qū)年橘回收量高達(dá)30多萬(wàn)盆。若被亂丟亂扔，造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。針對(duì)這一現(xiàn)狀，針對(duì)“廢棄期”四季桔開(kāi)展研究，提取不同部位（桔葉、青皮、黃皮）精油并分析其化學(xué)成分，對(duì)抗氧化和抑菌活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為四季桔資源的綜合利用提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。目前關(guān)于四季桔精油的研究主要集中在化學(xué)成分方面[2-4]，關(guān)于藥理和生物活性方面的研究較少，所以課題具有一定的創(chuàng)新性。

植物精油是植物體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物，主要由小分子化合物組成，芳香易揮發(fā)[5]。蕓香科柑橘屬植物精油（Citrus essential oils，CEOs）因抗菌活性好、安全性高（被美國(guó)FDA列為公認(rèn)安全物質(zhì)“GRAS”）、來(lái)源廣、產(chǎn)量高、香味獨(dú)特等特點(diǎn)，而備受關(guān)注；具有抑菌[5]、抗真菌[6]、抗氧化[7]、殺蟲(chóng)[8]、改善肝毒性和腎毒性[9]等多種生物活性；被廣泛于醫(yī)療保健、食品防腐、果蔬保鮮、害蟲(chóng)防治、生態(tài)旅游和日化產(chǎn)品等領(lǐng)域。所以該課題具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景和現(xiàn)實(shí)意義。

1 試驗(yàn)

1.1 試驗(yàn)材料

植物：四季桔新鮮葉子、青果、黃果（采于2021年3月廣東珠海西部，22°16’14.57”N 113°34’36.21”E）。

菌種：鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14 028、金黃葡萄球菌CVCC 1 885、李斯特菌ATCC 19 111、大腸桿菌CVCC 1 555（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司），按產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行復(fù)蘇；青霉素G藥敏片（杭州濱河微生物試劑有限公司）。

儀器：Agilent 7 890 B Agilent 5 977 A氣質(zhì)聯(lián)用分析儀（安捷倫科技有限公司）；UV 2 600全自動(dòng)紫外分光光度計(jì)（日本島津）；FA 2 004電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；TC-15電熱套（新華醫(yī)療器械廠）；JP-1 500 B高速多功能粉碎機(jī)（永康市久品工貿(mào)有限公司）；LDZX-75 KB立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；SPX-150 B-Z生化培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；SWCJ-2 F超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；TS-200 B全溫震蕩培養(yǎng)箱（上海市善志儀器設(shè)備有限公司）；101-2 A電熱恒溫干燥箱（廣州市康恒儀器有限公司）。

試劑：C 7-C 30正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品、DPPH（1, 1-二苯基-2-苦基肼）、ABTS（2, 2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽），美國(guó)Sigma公司；芳樟醇、桉葉油醇、欖香醇、檸檬烯、反式石竹烯、月桂烯、β-蒎烯、α-蒎烯（上海麥克林生化有限責(zé)任公司）；其他試劑（分析純，上海麥克林生化有限責(zé)任公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 精油的提取

參照文獻(xiàn)[6]方法并修改。將新鮮四季桔葉（800~900 g）、青皮（800~900 g）、黃皮（800~900 g），洗凈、陰干、粉碎，過(guò)篩（0.250~0.850 mm）。采用克萊文格式裝置，物料比為1∶5 g/mL，經(jīng)水蒸氣蒸餾1 h制得精油，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。精油得率按式?）計(jì)算。

1.2.2 GC-MS分析條件

采用Agilent 7 890 B氣相色譜系統(tǒng)，色譜柱為HP-5 MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm），以正己烷為溶劑（10 mg/mL），載氣為氦氣，進(jìn)樣量為1 μL，流速為1.0 mL/min，分流比為20∶1。升溫程序：50 ℃至150℃，3 ℃/min；150 ℃至250 ℃，15 ℃/min；升溫至250 ℃后保持20 min。進(jìn)樣口和離子源的溫度都是250℃。電離能量EI 70 eV，質(zhì)量掃描范圍為29~450。通過(guò)質(zhì)譜庫(kù)（NIST）、保留指數(shù)（RI）及參考文獻(xiàn)數(shù)據(jù)鑒定化合物成分，通過(guò)面積歸一化法各組分進(jìn)行定量。

1.2.3 抗氧化活性評(píng)估

1.2.3.1 DPPH法

參照Sarrou等[10]方法并修改。取不同濃度的四季桔桔葉、青皮、黃皮精油溶液各50 μL，加入2.95 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液（乙醇為溶劑），混合均勻，室溫下暗處放置0.5 h，在517 nm測(cè)定吸光度。以BHT為陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)樣品做三組，每組測(cè)三次，取均值，DPPH自由基清除率按式（2）計(jì)算。

1.2.3.2 ABTS法

參照Tu等[11]方法并修改。將7.0 mmol/L ABTS 溶液和2.0 mmol/L K2S2O8等比例混合均勻，室溫下暗處放置16 h，用二甲基亞砜將ABTS母液稀釋至734 nm處吸光度為0.70±0.02。取1.8 mL ABTS+溶液，加入不同濃度的四季桔桔葉、青皮、黃皮精油溶液各0.2 mL，混合均勻，室溫下暗處放置6 min，在734 nm測(cè)定吸光度。以BHT為陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)樣品做三組，每組測(cè)三次，取均值，ABTS自由基清除率按式（3）計(jì)算。

1.2.4 抑菌活性評(píng)估

1.2.4.1 抑菌圈的測(cè)定

采用濾紙片瓊脂擴(kuò)散法[12]，用無(wú)菌移夜槍吸取200 μL 106CFU/mL的懸菌液，在營(yíng)養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基平皿均勻涂布。取10 μL精油輕輕吸附在滅菌濾紙片（6 mm）上，將濾紙片輕放在含菌平皿后，于37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑大小。以無(wú)菌蒸餾水為空白對(duì)照，以青霉素G藥敏片為陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)樣品做三組，每組測(cè)三次，取平均值。精油對(duì)菌種的抑菌效果的判斷標(biāo)準(zhǔn)[13]：抑菌圈直徑大?。? mm，沒(méi)有敏感抑菌作用；6~9 mm，低度敏感作用；10~14 mm，中度敏感抑制作用；15~20 mm，高度敏感抑制作用；＞20 mm，極度敏感抑制作用。

1.2.4.2 最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定

采用微量肉湯稀釋法[14]，用比濁法配制108CFU/mL的懸菌液，用培養(yǎng)液調(diào)整為106CFU/mL。配制一系列梯度濃度的精油溶液（0.94，1.88，3.75，7.50，15.00，30.00，60.00，120.00，240.00和480.00 μL/mL）。向96孔板加入懸菌液和精油溶液各50 μL，混合均勻，細(xì)菌的最終濃度為5×105CFU/mL。以不接種菌液，不加精油溶液的液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，以接種相同數(shù)量菌液，不加精油溶液的液體培養(yǎng)基作為培養(yǎng)對(duì)照，每個(gè)樣品做三組。于96孔板37 ℃培養(yǎng)20 h后觀察，記錄MIC。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理用SPSS軟件進(jìn)行，差異不顯著（P＞0.05）用同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同字母表示，差異顯著（P＜0.05）則用不同字母表示。采用線性回歸方法計(jì)算IC50值。

2 結(jié)果與討論

2.1 精油得率

通過(guò)水蒸氣蒸餾法從四季桔桔葉、青皮、黃皮中提取精油，精油狀態(tài)及得率詳見(jiàn)表1。LEO、IPEO、MPEO得率分別為0.28%，1.06%和0.80%，與文獻(xiàn)報(bào)道基本相似。Cuevas-Glory等[4]發(fā)現(xiàn)四季桔桔葉、桔皮精油得率為0.29%和1.05%。Asikin等[15]對(duì)9—12月份臺(tái)灣香檬研究表明，其果皮精油的得率為0.75%~1.75%，且果實(shí)成熟度越高，得率越低。MPEO的得率低于IPEO，與上述結(jié)論相符。精油的提取有水蒸氣蒸餾法、壓榨法、超臨界萃取法等多種方法。其中水蒸氣蒸餾法較為常見(jiàn)，具有設(shè)備簡(jiǎn)單、易操作、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，但提取時(shí)間較長(zhǎng)，提取溫度較高，易引起精油成分散失[16]。該法精油得率會(huì)受到植物品種、提取部位、成熟度、料液比、提取溫度等多種因素的影響[17]。

表1 四季桔精油得率

2.2 四季桔精油GC-MS分析

四季桔桔葉、青皮、黃皮精油經(jīng)GC-MS分析，通過(guò)質(zhì)譜庫(kù)（NIST）、保留指數(shù)（RI）及參考文獻(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行定性，通過(guò)面積歸一化法進(jìn)行定量，化學(xué)成分結(jié)果詳見(jiàn)表2。從LEO、IPEO、MPEO依次鑒定出35，7和5種化合物，分別占各自總量的100.00%，99.89%和99.88%。

表2 四季桔精油GC-MS分析

四季桔不同部位精油的化學(xué)成分差異較大。桔葉精油（LEO）的主要化學(xué)成分是含氧倍半萜（32.74%）和含氧單萜類化合物（32.30%），含量較多的化合物是芳樟醇（27.24%）、欖香醇（12.57%）和大根香葉烯（8.69%）。桔皮精油（IPEO、MPEO）中的主要成分是單萜類化合物（＞95.00%），其中檸檬烯含量最高（＞85.00%）。IPEO含有少量含氧單萜（1.24%），而在MPEO中并未檢測(cè)到（表2）。

植物精油的化學(xué)成分受到多種因素的影響，其中植株的品種是確定含量和成分的主要原因[5]。四季桔果皮精油的主要成分是檸檬烯，與柑橘屬果皮精油成分一致[2-4,7]。提取部位也是重要的影響因素，四季桔桔葉精油和果皮精油化學(xué)成分差異較大（詳見(jiàn)表2）。Cuevas-Glory等[4]發(fā)現(xiàn)四季桔桔葉主要成分是單萜（41.8%）和含氧倍半萜（13.5%），桔皮精油的主要成分是檸檬烯（77.0%）。即使是同一部位，果實(shí)的成熟度對(duì)化學(xué)成分也有影響。MPEO的檸檬烯含量略高于IPEO，與文獻(xiàn)中果實(shí)越成熟，精油檸檬烯的含量越高的結(jié)論一致[15]。此外，植物精油的化學(xué)成分還受到提取方法、氣候條件、地理位置及土壤組成等因素影響[5,18]。

2.3 四季桔精油抗氧化活性

抗氧化試驗(yàn)中，四季桔桔葉、青皮、黃皮精油對(duì)兩種自由基均呈現(xiàn)出一定的清除能力，對(duì)DPPH的清除能力優(yōu)于ABTS。如表3和圖1所示，MPEO、IPEO、LEO和BHT對(duì)兩種自由基的抗氧化能力依次增強(qiáng)，且呈濃度依賴關(guān)系。在DPPH中，IC50值分別為4.563±0.275，3.013±0.060，2.699±0.424和0.229±0.022 mg/mL；ABTS中，LEO和BHT的IC50值分別為5.149±0.132和0.206±0.021 mg/mL，MPEO、IPEO抗氧化能力較弱。

圖1 四季桔精油對(duì)DPPH和ABTS的清除能力

表3 四季桔精油IC50值

研究表明柑橘屬植物精油具有抗氧化活性[10,13,19]。Choi等[19]發(fā)現(xiàn)34種柑橘屬植物精油對(duì)DPPH自由基的清除率為17.7%~64.0%。同濃度下，LEO、IPEO、MPEO的清除率分別為70.6%，61.4%和44.9%，與文獻(xiàn)基本一致。

四季桔不同部位精油的抗氧化活性差異較大，可能與其化學(xué)成分有關(guān)[13,25]。研究表明化合物鄰-傘花烴、4-萜烯醇、松油醇、石竹烯、β-蒎烯、β-月桂烯、芳樟醇具有較好抗氧化活性。LEO活性最強(qiáng)，可能與其含有鄰-傘花烴、4-萜烯醇、松油醇、芳樟醇、石竹烯等化學(xué)成分有關(guān)[13,25]。

桔皮精油中，MPEO抗氧化活性弱于IPEO，與文獻(xiàn)中果皮成熟度越高精油清除DPPH自由基的能力越弱[15]結(jié)論一致。檸檬烯在MPEO中含量高達(dá)92.03%，說(shuō)明它不是果皮精油抗氧化活性的關(guān)鍵成分。如圖1所示，當(dāng)質(zhì)量濃度小于2.4 mg/mL時(shí)，IPEO和MPEO清除DPPH自由基能力基本一致（P＞0.05），當(dāng)質(zhì)量濃度大于2.4 mg/mL時(shí)，兩者差異明顯（P＜0.05）?？赡苁荌PEO中含量較少的成分在起主要作用，它們的濃度隨著精油濃度的提高而增加，當(dāng)達(dá)到一定值后，它們使IPEO的抗氧化能力明顯增強(qiáng)，與MPEO出現(xiàn)顯著差異（P＜0.05），推測(cè)IPEO的各組分之間可能會(huì)有協(xié)同作用，對(duì)精油的抗氧化活性起主要作用。

2.4 四季桔精油抑菌活性

抑菌試驗(yàn)中，四季桔精油對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌（金黃色葡萄球菌、李斯特菌）和革蘭氏陰性菌（沙門氏菌、大腸桿菌）都有抑菌的效果，具有廣譜抗菌性。由表4可知：LEO對(duì)四種菌都為極敏（26.76~32.20 mm），IPEO對(duì)大腸桿菌為極敏（22.76 mm），其余為中敏（12.60~13.70 mm）；MPEO對(duì)李斯特菌為中敏（10.03 mm），其余為低敏（7.53~9.13 mm），而陽(yáng)性對(duì)照青霉素藥敏片抑菌直徑為14.43~20.93 mm。由表5可知：LEO對(duì)金黃色葡萄桿菌、沙門桿菌、大腸桿菌、李斯特的MIC分別為1.88，1.88，1.88和30 L/mL；MPEO為2 240，40，60，240 L/mL；MPEO在0.94~240 L/m時(shí)，對(duì)四種菌均無(wú)抑菌效果。以上結(jié)果顯示，三種精油中，LEO的抑菌活性最強(qiáng)，IPEO次之，MPEO最弱。

表4 四季桔精油及相關(guān)化學(xué)成分抑菌圈大?。ā繱） 單位：mm

表4 四季桔精油及相關(guān)化學(xué)成分抑菌圈大小（±S） 單位：mm

樣品金色葡萄球菌大腸桿菌沙門氏菌李斯特菌LEO32.20±0.20a26.76±0.35a27.13±0.15a28.53±0.25a IPEO13.17±0.15c22.76±0.15b12.60±0.20d13.70±0.26e MPEO9.13±0.25e7.53±0.32g7.30±0.20hi10.03±0.94g芳樟醇9.74±0.32d11.88±0.62d11.27±0.33e16.10±0.83c桉葉油醇7.32±0.17f9.95±0.57e7.78±0.44gh21.24±1.79b欖香醇7.42±0.19f11.33±0.42d11.23±0.41e16.04±0.92c檸檬烯7.38±0.01f13.17±0.24c8.34±0.13fg11.85±0.35f反式石竹稀6.81±0.32g6.00±0.00h6.75±0.23i11.27±0.06f月桂稀7.04±0.27fg6.00±0.00h8.57±0.71f6.00±0.00h β-蒎稀6.56±0.01g8.88±0.12f8.17±0.56fg11.71±0.54f α-蒎稀9.97±0.14d22.46±0.30b13.68±0.70c14.79±0.16d青霉素藥敏片15.26±0.11b11..43±0.20d16.33±0.15b20.93±0.30b蒸餾水6.00±0.00h6.00±0.00h6.00±0.00j6.00±0.00h注: 敏感性的標(biāo)準(zhǔn): ≤6 mm不敏, 6~9 mm低敏, 10~14 mm中敏,15~20 mm高敏, ＞20 mm極敏。數(shù)據(jù)處理用SPSS軟件進(jìn)行, 差異不顯著 (P＞0.05) 用同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同字母表示, 差異顯著 (P＜0.05)則用不同字母表示。

表5 四季桔精油最低抑菌濃度

研究表明植物精油抑菌活性與其化學(xué)成分相關(guān)[13,20-22]。此試驗(yàn)對(duì)四季桔精油的主要化學(xué)成分進(jìn)行了抑菌活性評(píng)價(jià)，詳見(jiàn)表4。芳樟醇、欖香醇、桉葉油醇、檸檬烯、檜烯、月桂烯、α-蒎烯、β-蒎烯均顯示出一定的抑菌活性，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[13,20-22]。其中含氧化合物（芳樟醇、欖香醇、桉葉油醇）對(duì)李斯特菌的抑菌活性明顯強(qiáng)于萜類化合物（檸檬烯、檜烯等）。LEO的抑菌活性顯著強(qiáng)于其主要成分芳樟醇、欖香醇、桉葉油醇的抑菌活性（P＜0.05）；IPEO的抑菌活性強(qiáng)于主要成分檸檬烯的抑菌活性（P＜0.05），推測(cè)四季桔精油中各組分可能有協(xié)同作用，雖然有的化學(xué)成分含量少，但對(duì)精油的生物活性起重要作用。

Sadgrove等[22]對(duì)蕓香科21種植物精油研究發(fā)現(xiàn)含有倍半萜醇如欖香醇、桉葉油醇異構(gòu)體的精油抑菌活性較強(qiáng)，而主成分是單萜類的精油抑菌活性較弱。此試驗(yàn)呈現(xiàn)出同樣的規(guī)律，LEO主要成分是含氧單萜和含氧倍半萜，活性最強(qiáng)；IPEO和MPEO主要成分是是單萜（檸檬烯＞85%），活性次之。IPEO和MPEO同為果皮精油，但抑菌活性差異顯著（P＜0.05），推測(cè)可能是IPEO中含量極少的含氧單萜類化合物（1.24%）在起重要作用。

3 結(jié)論

文章對(duì)四季桔黃皮、青皮、桔葉精油的化學(xué)成分和生物活性開(kāi)展研究。研究發(fā)現(xiàn)：四季桔精油對(duì)DPPH、ABTS自由基均顯示出明顯的清除能力，且有量效關(guān)系；對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌都有抑菌的效果，具有廣譜抗菌性。試驗(yàn)表明精油的生物活性與化學(xué)成分密切相關(guān)。LEO的主要化學(xué)成分是含氧倍半萜（32.74%）和含氧單萜類化合物（32.30%），抗氧化和抑菌活性最好。在DPPH中的IC50值為2.699±0.424 mg/mL，對(duì)金黃葡萄球菌、沙門氏菌、李斯特菌、大腸桿菌都為極敏（26.76~32.20 mm）。而MPEO和IPEO同是桔皮精油，化學(xué)成分相似（檸檬烯＞85%），但抗氧化和抑菌活性差異顯著（P＜0.05）。在DPPH中的IC50值分別為3.013±0.060和4.563±0.275 mg/mL。IPEO對(duì)四種菌的敏感級(jí)別為中敏或極敏（12.60~22.76 mm）；MPEO則為低敏或者中敏（7.53~10.03 mm）。推測(cè)可能是IPEO中含量極少的含氧單萜類化合物（1.24%），對(duì)精油的抗氧化及抑菌活性起了關(guān)鍵性的作用。

四季桔精油作為一種天然混合物，由多種小分子化合物組成。精油的生物活性是各種化合物相互作用的整體表現(xiàn)。四季桔桔葉和青皮精油的抑菌活性強(qiáng)于主要活性單體化合物（如LEO＞芳樟醇、欖香醇、桉葉油醇；IPEO＞檸檬烯）。推測(cè)四季桔精油各組分之間可能存在協(xié)同作用。研究表明，不同的化合物的抑菌作用機(jī)制不同。如萜類化合物通過(guò)損壞微生物細(xì)胞壁質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞質(zhì)外泄，最終導(dǎo)致細(xì)胞裂解而亡[23]。而含氧類化合物如芳樟醇可使細(xì)胞膜產(chǎn)生凹陷皺破，損壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性和通透性，影響能量代謝，導(dǎo)致微生物死亡[24]。各化合物之間的相互作用既可以提升精油的抑菌活性，又可以避免使用單體化合物對(duì)菌種產(chǎn)生的耐藥性。所以四季桔精油作為天然抑菌劑，具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)和良好的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。關(guān)于四季桔精油成分之間的協(xié)同抑菌機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

綜上，針對(duì)節(jié)慶過(guò)后，觀賞類植物四季桔被亂丟亂扔，污染環(huán)境，浪費(fèi)資源的現(xiàn)狀，對(duì)廢棄植物開(kāi)展研究，探究其開(kāi)發(fā)利用價(jià)值，具有現(xiàn)實(shí)意義。試驗(yàn)表明四季桔精油具有較好的抗氧化和抑菌活性，可作為天然食品防腐劑開(kāi)發(fā)利用。此外，柑橘屬精油已經(jīng)被廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥、美容、農(nóng)業(yè)等各個(gè)領(lǐng)域，四季桔精油的其他方面的應(yīng)用價(jià)值有待進(jìn)一步研究。