邱爽 ，張新科，孔文茹，王姝麒，王東亮

1.北京小仙燉生物科技有限公司（北京 100020）；2.河北省燕窩鮮燉技術(shù)創(chuàng)新中心（廊坊 065700）；3.山東大學(xué)藥學(xué)院（濟(jì)南 250012）

燕窩（Edible Bird’s Nest，EBN）原產(chǎn)于東南亞，是由雨燕科金絲燕屬（Aerodramus）、侏金絲燕屬（Collocalia）和雨燕屬（Apus）在繁殖季節(jié)分泌的唾液與羽毛、草等混合，粘合在墻壁或者洞穴上而鑄成的“育兒床”，用于產(chǎn)卵及孵育雛燕[1]。能夠產(chǎn)燕窩的金絲燕主要分布在印度尼西亞、馬來(lái)西亞、泰國(guó)、緬甸、越南、菲律賓、柬埔寨和中國(guó)南部[2]。印度尼西亞生態(tài)環(huán)境適宜，燕屋應(yīng)用成功，是全球最大的燕窩輸出國(guó)，年產(chǎn)量約為全球的85%。

燕窩性平味甘，歸肺經(jīng)、胃經(jīng)、腎經(jīng)，在我國(guó)歷史悠久，早在明代就有燕窩記載?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)燕窩含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、唾液酸和微量元素等[3-4]，具有抗病毒、抗氧化、抗神經(jīng)退行性疾病及皮膚保護(hù)等多種生物功能[5-6]。中國(guó)是世界上最大的燕窩消費(fèi)國(guó)，也是每年全球最大的燕窩進(jìn)口國(guó)。僅2021年1月至6月，中國(guó)從印尼和馬來(lái)進(jìn)口了約170 t燕窩[2]。燕窩行業(yè)附加值高，供小于求，1 kg燕窩在我國(guó)的售價(jià)高達(dá)6 000美元，不少商家通過(guò)摻假來(lái)牟取高額利潤(rùn)，以次充好現(xiàn)象更是屢屢發(fā)生[7]。消費(fèi)者們并不能很好地對(duì)燕窩真?zhèn)渭笆欠駬郊龠M(jìn)行鑒別。建立一套高效、便捷、準(zhǔn)確的燕窩真?zhèn)舞b定方法一直是燕窩行業(yè)的一大難題。針對(duì)目前國(guó)內(nèi)外燕窩摻假方式及真?zhèn)舞b別方法進(jìn)行了匯總，為后續(xù)燕窩真?zhèn)舞b別研究提供一定的參考。

1 目前燕窩常見(jiàn)的摻假方法

燕窩摻假分為完全造假和部分摻假兩種情況。前者是產(chǎn)品中完全不含有燕窩，將瓊脂、魚鰾、卡拉膠、豬皮、銀耳等摻假物與調(diào)和劑混合制成；后者制成的產(chǎn)品中含有燕窩，為了提高產(chǎn)品重量、風(fēng)味、口感或賣相，在燕窩中混入瓊脂、銀耳、豬皮、蛋清、葡萄糖、卡拉膠等[7-9]。燕窩常見(jiàn)摻假物分為兩類。第一類為魚鰾、豬皮、卡拉膠、珊瑚粉、瓊脂和銀耳等固體，它們附著在燕窩表面，可以利用顯微鏡觀察到表面結(jié)構(gòu)的差異。第二種是水溶性物質(zhì)，如糖類（葡萄糖、蔗糖）、多肽（水解膠原蛋白）和鹽，在干燥時(shí)很容易被燕窩內(nèi)部吸附形成復(fù)合物，使其難以目視檢測(cè)[7]。

除了人為摻假外，還有許多商家為了牟取高額利潤(rùn)，混淆燕窩產(chǎn)區(qū)、品種以及生產(chǎn)方式。人們認(rèn)為天然洞燕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高于屋燕，燕窩市場(chǎng)便出現(xiàn)了大量將白燕熏制染色成血燕的現(xiàn)象，特別是2011年發(fā)生的“血燕”事件，此次食品安全事件的根本原因就是不法商家采購(gòu)便宜的白燕窩熏制、發(fā)酵、染色加工成血燕，這給燕窩行業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重打擊，直到近年才有所恢復(fù)[10]。

燕窩摻假事件層出不窮，燕窩行業(yè)良莠不齊，使得消費(fèi)者對(duì)燕窩產(chǎn)生信任危機(jī)。多數(shù)消費(fèi)者難以對(duì)燕窩真?zhèn)芜M(jìn)行鑒別，開發(fā)有效、快速的燕窩真?zhèn)舞b別方法一直是重要的研究課題。

2 燕窩真?zhèn)舞b別檢測(cè)方法

2.1 遺傳學(xué)方法

蛋白質(zhì)分析和DNA分析是食品溯源和真實(shí)性分析最常見(jiàn)的方法。DNA比許多蛋白質(zhì)耐熱，穩(wěn)定性高，這使其成為區(qū)分和鑒定食品成分的首選分子。

在燕窩真?zhèn)我约把喔C基源鑒別中，針對(duì)特定核酸序列鑒定可以提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度，常見(jiàn)的有線粒體細(xì)胞色素b（Cytb）基因和NADH脫氫酶亞基2（ND2）基因。Lin等[11]基于Cytb基因序列，構(gòu)建了用于燕窩樣本遺傳鑒定的系統(tǒng)發(fā)育樹。何國(guó)林等[12]設(shè)計(jì)了一條特異靶向Taq Man探針，通過(guò)鑒定金絲燕屬與雨燕屬Cytb基因進(jìn)行燕窩的真?zhèn)舞b別。在該類研究中，DNA的提取效率是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵，研究表明異硫氰酸胍法是燕窩DNA的最佳提取方法[13]，特定序列的檢測(cè)降低了全基因檢測(cè)中可能出現(xiàn)的假陽(yáng)性誤差。DNA分析用于燕窩真?zhèn)舞b別更準(zhǔn)確，可實(shí)現(xiàn)燕窩的相對(duì)定量。然而DNA技術(shù)操作繁瑣，應(yīng)用于燕窩流通中的真?zhèn)舞b別還存在一定的局限。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）

ELISA具有免疫反應(yīng)的特異性和酶標(biāo)記物檢測(cè)的高敏度雙重優(yōu)勢(shì)。豬明膠是食用燕窩中的常見(jiàn)摻假物，為了快速檢測(cè)燕窩中的豬明膠，研究針對(duì)豬種特異性氨基酸序列的α2 Ⅰ型膠原（pAb 1、pAb 2）與α1 Ⅰ型膠原（pAb 3）鏈建立了競(jìng)爭(zhēng)性間接ELISA反應(yīng)，該技術(shù)能夠檢測(cè)到樣品中至少0.05%的豬明膠[14]。對(duì)比3種ELISA反應(yīng)，pAb 3鏈反應(yīng)穩(wěn)定且未與蛋清發(fā)生交叉反應(yīng)，更適合于燕窩中豬明膠的檢測(cè)[15]。除了設(shè)計(jì)摻假物的特異性抗體外，還可以針對(duì)燕窩特定成分進(jìn)行ELISA反應(yīng)。唾液酸糖蛋白是燕窩中唾液酸的主要載體，由106和128 kda蛋白組成。Zhang等[16-17]利用夾心ELISA法制備了兩種抗特征性唾液酸糖蛋白單克隆抗體，并用Western印跡法檢測(cè)，優(yōu)化后的ELISA條件IC50僅為1.5 ng/mL。ELISA的特異性強(qiáng)，但受到摻假物種類的限制，針對(duì)不同的燕窩摻假物需篩選制備出不同的抗體。

2.3 光譜法

燕窩中的唾液酸與酸性茚三酮能形成穩(wěn)定物質(zhì)，利用紫外光譜法（Ultraviolet Spectrophotometry，UV）檢測(cè)時(shí)在470 nm處有最大吸收峰[18]。對(duì)于燕窩本身來(lái)說(shuō)，真品燕窩在280 nm處有最大紫外吸收，而偽品無(wú)最大吸收峰[19]。核磁共振技術(shù)操作簡(jiǎn)便、普適性高、異構(gòu)體分析能力強(qiáng)。高志亮[20]對(duì)比了燕窩及摻假物的1H-NMR譜圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)假燕窩在化學(xué)位移δ3.4~4.0未檢測(cè)到與唾液酸相似的共振峰，而真品燕窩能檢測(cè)到。然而單從指定成分的光譜結(jié)果衡量燕窩真?zhèn)尾⒉粶?zhǔn)確，更不能對(duì)摻假物的種類和含量做出準(zhǔn)確的判別。擴(kuò)大樣本量結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)建模是提高準(zhǔn)確度的重要手段。Shi等[21]利用近紅外光譜和化學(xué)計(jì)量學(xué)建立了一種快速、簡(jiǎn)單的燕窩真?zhèn)渭胺旨?jí)認(rèn)證方法。研究從印尼、馬來(lái)和泰國(guó)共收集了80多種燕窩，制備了200個(gè)摻假燕窩，利用化學(xué)計(jì)量學(xué)提取與燕窩品質(zhì)相關(guān)的光譜特征，基于這些光譜特征建立的模型對(duì)燕窩真?zhèn)巍①|(zhì)量分級(jí)的識(shí)別率可達(dá)到90%以上，該方法通過(guò)擴(kuò)大樣本量和來(lái)源建立了一套較為準(zhǔn)確的鑒別模型。

在光譜相關(guān)的鑒別方法上，傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）技術(shù)應(yīng)用于燕窩真?zhèn)舞b別在不斷發(fā)展。早在2001年，孫素琴等[22]首次將鉆石ATR探頭FTIR技術(shù)應(yīng)用于燕窩鑒別，研究發(fā)現(xiàn)各個(gè)燕窩紅外譜圖的峰形相似，但部分營(yíng)養(yǎng)成分吸收峰的強(qiáng)度和位置存在差異，特別是蛋白質(zhì)、氨基酸和多糖。后續(xù)的研究大多利用燕窩及摻假物的FTIR譜圖、特征峰進(jìn)行分析建模[23]，然而此類模型在摻假物含量較低時(shí)判別不準(zhǔn)確[8]。

除了燕窩真?zhèn)舞b別外，光譜法還可用于血燕的區(qū)分。Cheng等[24]通過(guò)1H-NMR技術(shù)發(fā)現(xiàn)燕窩熏制后苯環(huán)發(fā)生改變，并將燕窩人工硝化過(guò)程中SERS指紋圖譜的變化歸因于氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)改變[25]，這些研究證明了燕窩熏制過(guò)程導(dǎo)致氨基酸序列改變，從本質(zhì)上實(shí)現(xiàn)了對(duì)天然血燕和人工熏制血燕的識(shí)別。

相比于遺傳學(xué)和蛋白學(xué)，光譜技術(shù)樣品前處理和操作更簡(jiǎn)單，通過(guò)擴(kuò)大樣本量聯(lián)合化學(xué)計(jì)量學(xué)可以建立一套較為穩(wěn)定的燕窩真?zhèn)舞b別模型。然而該方法無(wú)法實(shí)現(xiàn)摻假物的定量，對(duì)于一些未知摻假原料不能做出準(zhǔn)確的判斷，精準(zhǔn)度不如其他鑒別方法。

2.4 色譜法

利用色譜技術(shù)進(jìn)行燕窩真?zhèn)舞b別多集中在對(duì)特定成分定性或定量來(lái)區(qū)分燕窩中是否含有摻假物。燕窩中單糖組成是燕窩真?zhèn)舞b別的重要指標(biāo)，Tung等[26]采用高效離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)器（High-performance anion-exchange chromatography-pulsed amperometric detector，HPAEC-PAD）進(jìn)行糖譜分析，最終將唾液酸相對(duì)含量（10.8%±0.76%）作為評(píng)估燕窩含量的指標(biāo)。此外，真正的燕窩含有甘露糖、半乳糖、N-乙酰基-D-半乳糖胺、N-乙酰氨基葡萄糖和唾液酸，而多數(shù)假冒品不含[27]。利用氣質(zhì)聯(lián)機(jī)（Gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）、氣象色譜（Gas chromatography，GC）檢測(cè)燕窩中揮發(fā)性成分、氨基酸、脂肪酸組成也被用于燕窩真?zhèn)舞b別、產(chǎn)區(qū)溯源以及加工工藝的區(qū)分[28-30]。

除單糖組成外，唾液酸含量也是鑒別燕窩真?zhèn)巍⒑饬科焚|(zhì)好壞的重要指標(biāo)，液相色譜是檢測(cè)唾液酸最常用的方法。不同品種燕窩中唾液酸含量具有差異，如白燕中唾液酸含量為13%，血燕中為10%，而銀耳、豬皮、瓊脂等常見(jiàn)偽品中不含唾液酸[31-32]。唾液酸含量也可以用作燕窩等級(jí)劃分的標(biāo)準(zhǔn)，唾液酸含量在10%以上為A級(jí)燕窩，7%~10%為B級(jí)，5%~7%為C級(jí)[21]。該方法在一定程度上可以區(qū)分燕窩及摻有銀耳、豬皮等成分的摻假燕窩，然而市場(chǎng)上還有商家直接向燕窩中添加唾液酸或其他含有唾液酸的原料，在此類產(chǎn)品的檢測(cè)中以唾液酸為基準(zhǔn)的鑒別方法便不準(zhǔn)確。此外，現(xiàn)有研究中多認(rèn)為唾液酸是燕窩的核心營(yíng)養(yǎng)成分，但唾液酸只占燕窩的10%左右，只以唾液酸含量作為燕窩分級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)過(guò)于片面。在燕窩的營(yíng)養(yǎng)成分中，50%以上均為蛋白質(zhì)，特征蛋白或肽段的篩選將成為燕窩真?zhèn)舞b別及分級(jí)的重要方向。

基于以上研究方向，Wu等[33]篩選出了13個(gè)標(biāo)記肽段用于區(qū)分白燕和草燕/摻假物，3個(gè)肽段區(qū)分草燕與白燕/摻雜物。特異性肽段的篩選可實(shí)現(xiàn)摻假物或燕窩的定量。Ma等[34]篩選出了9種來(lái)自摻雜物的特征肽段用于摻雜物的定量分析。類似的方法也被用來(lái)定量燕窩產(chǎn)品中瓊脂的含量，瓊脂是燕窩常見(jiàn)摻雜物，因其不吸收紫外，很難對(duì)燕窩中瓊脂含量進(jìn)行檢測(cè)。Cheng等[35]開發(fā)了一種子寡糖標(biāo)記法對(duì)瓊脂進(jìn)行定性定量。研究利用LC-QTOF-MS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)新瓊四糖信號(hào)豐度高且與標(biāo)準(zhǔn)瓊脂線性關(guān)系好，被選為檢測(cè)標(biāo)記用于定性和定量分析，這種低聚物標(biāo)記法可用于燕窩原料中摻有瓊脂產(chǎn)品的質(zhì)量控制，而且可以定量分析[35]。基于色譜檢測(cè)的蛋白質(zhì)分析方法不僅可以準(zhǔn)確地對(duì)燕窩及摻假物進(jìn)行判別，重要的是可實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品中燕窩及摻假物的定量，具有廣闊的發(fā)展前景。

2.5 凝膠電泳法

凝膠電泳常用于蛋白質(zhì)分析，典型的有聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）和雙向電泳（Two-dimensional electrophoresis，2-DE）。燕窩往往被加工成長(zhǎng)梭形、球形，如白燕條、宮燕餅、草燕等。早在1999年，胡珊梅等[36]就利用PAGE對(duì)燕窩及燕窩加工品進(jìn)行區(qū)分，研究通過(guò)各實(shí)驗(yàn)樣品在電泳圖譜上譜帶的條數(shù)以及深淺進(jìn)行鑒別，證實(shí)了該方法區(qū)分燕窩及加工品的可行性。真燕窩比豬皮、瓊脂等燕窩偽品的特征圖譜更明顯，蛋白質(zhì)種類更多[31]。

電泳技術(shù)也被用于燕窩產(chǎn)地及生產(chǎn)方式的區(qū)分，郭麗麗[8]采集了來(lái)自印尼和馬來(lái)的已知生產(chǎn)方式和產(chǎn)區(qū)的燕窩，利用蛋白條帶數(shù)和相對(duì)含量建立了產(chǎn)區(qū)和生產(chǎn)方式的判別模型，采用2-DE篩選出了不同生產(chǎn)方式和產(chǎn)地的燕窩差異蛋白點(diǎn)，為后續(xù)的質(zhì)譜分析提供一定的參考。SDS-PAGE結(jié)合多變量分析是鑒別燕窩地理來(lái)源和生產(chǎn)方式的一種可行方法，然而該方法的檢測(cè)精度受到建模時(shí)實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)量和覆蓋率大小的影響，應(yīng)通過(guò)擴(kuò)大樣本量和樣本來(lái)源以驗(yàn)證鑒別模型的穩(wěn)定性[37]。

2.6 其他方法

除上述方法外，還有一部分研究利用氨基酸分析儀、傳感器陣列、同位素等方法進(jìn)行燕窩真?zhèn)舞b別。不同燕窩樣品以及摻假物在氨基酸組成和含量上都存在差異，如真品燕窩中不含羥脯氨酸和胱氨酸，偽品在氨基酸組成上和燕窩均不相同[38]。Eric等[39]首次將熱重分析（Thermogravimetry，TG）、微分熱重（Differential thermogravimetry，DTG）和差示掃描量熱分析（Differential scanning calorimetry，DSC）用于燕窩的快速鑒別。燕窩獨(dú)特的熱重分析和微分熱重分析曲線可作為燕窩真?zhèn)畏治鰳?biāo)準(zhǔn)，該方法只需5~10 mg樣品，無(wú)需樣品預(yù)處理即可檢查燕窩中是否含有摻假物。

表1 燕窩真?zhèn)舞b別技術(shù)的應(yīng)用

Huang等[29]開發(fā)了一種由比色傳感器陣列、智能手機(jī)和多層網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)成的低成本智能系統(tǒng)鑒別和定量摻假燕窩，通過(guò)收集燕窩的揮發(fā)性成分特征和響應(yīng)信號(hào)，利用智能手機(jī)獲取圖像，該系統(tǒng)提供了一個(gè)實(shí)時(shí)、可靠的預(yù)測(cè)模型。隨后該團(tuán)隊(duì)用同樣的方法識(shí)別燕窩的地理來(lái)源，使用PCA、HCA和聚類分析研究樣本組之間的相似性，該設(shè)備能夠識(shí)別未知燕窩的地理來(lái)源[40]。該技術(shù)特異性強(qiáng)，但同樣受到樣本量和樣品來(lái)源的影響，且并未實(shí)現(xiàn)摻假物的定量。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

燕窩具有眾多保健功效，一直被認(rèn)為是名貴的滋補(bǔ)品。然而，目前燕窩行業(yè)沒(méi)有規(guī)范的真?zhèn)舞b別標(biāo)準(zhǔn)，燕窩產(chǎn)品魚龍混雜，摻假現(xiàn)象頻頻發(fā)生，一直是燕窩行業(yè)的一大難題。此研究對(duì)燕窩常見(jiàn)的摻假物進(jìn)行匯總，從遺傳學(xué)、ELISA、光譜學(xué)、色譜學(xué)、凝膠電泳學(xué)方向歸納了燕窩的真?zhèn)舞b別方法，并討論了每種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，為燕窩行業(yè)質(zhì)量監(jiān)控體系提供參考。

基因和蛋白層面的燕窩真?zhèn)舞b別比光譜法以及色譜法中特定成分的檢測(cè)更準(zhǔn)確，然而金絲燕的基因、蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)不完善，現(xiàn)有研究中燕窩的蛋白和肽段數(shù)據(jù)大部分不具有系統(tǒng)性[33]，急需補(bǔ)充金絲燕及燕窩數(shù)據(jù)庫(kù)，找到真正的差異基因或蛋白。燕窩真?zhèn)舞b別常涉及專業(yè)儀器和方法，且需要一定的樣品前處理，不利于在進(jìn)口或商品流通環(huán)節(jié)推廣。后續(xù)還需要開發(fā)準(zhǔn)確、快捷的燕窩真?zhèn)舞b別方法，將其與成熟的計(jì)量學(xué)分析手段結(jié)合，適合于流通環(huán)節(jié)的使用。

此外，燕窩造假事件導(dǎo)致的食品安全問(wèn)題不容忽視。許多生產(chǎn)商為了延長(zhǎng)即食燕窩的保質(zhì)期，使用次氯酸鹽漂白燕窩，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。該過(guò)程會(huì)形成氨基脲，危害消費(fèi)者的健康[47]。然而目前對(duì)漂白燕窩的鑒別方法十分有限，大多僅從味覺(jué)以及觸覺(jué)等感官層面上區(qū)分，沒(méi)有準(zhǔn)確的衡量標(biāo)準(zhǔn)，仍需要更深入的研究。