邱光明，周遠(yuǎn)祥，朱叢戎，周勝

重慶中煙工業(yè)有限責(zé)任公司（重慶 400060）

五布紅柚（Citrus grandisOsbeck cv.Wubuhongyou）又稱五布紅心柚，原產(chǎn)重慶巴縣五布鄉(xiāng)。為選出的地方良種柚，以重慶市栽培為多，廣西、浙江等地也有引種。紅柚中含有豐富的類胡蘿卜素。研究發(fā)現(xiàn)，成熟時(shí)期的五布紅柚果實(shí)中含有豐富的類胡蘿卜素，紅柚中以番茄紅素為主要呈色色素，不同類型蜜柚類胡蘿卜素的含量存在明顯差異[1-2]。越來(lái)越多證據(jù)表明，紅柚中含有豐富的類胡蘿卜素類化合物，具有多種有益效果[3-5]。流行病學(xué)證據(jù)表明，攝入高含量類胡蘿卜素類和低含量脂肪酸的食物（如水果和蔬菜）與降低人類疾病如心血管疾病、糖尿病和癌癥等風(fēng)險(xiǎn)直接相關(guān)[2, 6-7]。

五布紅柚提取物中的類胡蘿卜素是親脂性的。其結(jié)構(gòu)不同，提取方法各異[8-9]。采用混合提取溶劑，能夠大幅提高提取效率，從而能夠準(zhǔn)確進(jìn)行分析和定量。類胡蘿卜素的檢測(cè)方法主要為高效液相色譜法，該方法具有分離效能高、分析速度快、樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)，是應(yīng)用最廣也最適用于類胡蘿卜素物質(zhì)的分離測(cè)定方法[9-11]。

采用靈敏度更高的VWD紫外檢測(cè)器的高效液相色譜儀，結(jié)合梯度洗脫建立五布紅柚提取物中5種類胡蘿卜素物質(zhì)的測(cè)定方法，并對(duì)其精確度、回收率等進(jìn)行評(píng)價(jià)；比較不同來(lái)源五布紅柚提取物對(duì)其5種類胡蘿卜素物質(zhì)含量及加香效果的影響，以期為五布紅柚提取物果實(shí)品質(zhì)評(píng)價(jià)和在香精香料中的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Agilent 1260 HPLC系統(tǒng)，配有輸液泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、在線脫氣裝置及化學(xué)工作站；離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司）；200 g 搖擺式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒公司）；0.45 μm及0.22 μm針頭微孔濾膜過(guò)濾器（均購(gòu)于美國(guó)TEDIA公司）；Biocel型密理博超純水系統(tǒng)（美國(guó)密理博公司）。

類胡蘿卜素物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品：番茄紅素（純度≥99.0%）、β-胡蘿卜素（純度≥99.0%）、玉米黃素（純度≥99.0%）、α-胡蘿卜素（純度≥99.0%）、花藥黃素（純度≥99.0%），均購(gòu)于Sigma公司，保存在4 ℃黑暗中。

HPLC級(jí)甲醇、乙腈和正己烷，丁基化羥基甲苯（BHT，≥99% FG），丙酮（GR級(jí)），購(gòu)自上海Macklin生化有限公司。HPLC級(jí)去離子水來(lái)自Milli-Q 50系統(tǒng)（西班牙Millipore Iberica S.A.）。將類胡蘿卜素物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液溶解在二氯甲烷中，用甲醇稀釋至0.1 mg/mL，并在-80 ℃下儲(chǔ)存。0.1，0.5，1.0，10.0，100.0，200.0，500.0和1 000.0 mg/L的類胡蘿卜素物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品用于生成測(cè)試樣品定量的回歸方程。

1.2 五布紅柚提取物樣品處理

將收獲的五布紅柚在37 ℃下保存72 h，通過(guò)AACC 14-50方法測(cè)定樣品水分，研磨成細(xì)粉。在提取類胡蘿卜素之前，將面粉儲(chǔ)存在18 ℃弱光下，以使降解最小化。

從五布紅柚中提取出類胡蘿卜素。將1.0 g五布紅柚添加到聚丙烯或硼硅酸鹽管中的6 mL提取溶液（丙酮與甲醇7︰3，V/V，0.1% BHTW/V）中，并在渦流混合器中劇烈混合45 s。將混合物在35 ℃、恒溫振蕩器上、弱光下以80 r/min搖動(dòng)1 h。將提取物在10 000 r/min（4 ℃）下離心10 min。將固體提取殘余物加入到6 mL提取溶液中，搖動(dòng)并離心。將合并的上清液在氮?dú)饬髡舭l(fā)器中于35 ℃蒸發(fā)至干。

將干燥殘余物在3 mL乙醚和3 mL水解介質(zhì)（50%KOH水溶液和乙醇1∶9，V/V）中重構(gòu)，并在室溫下黑暗中振蕩2 h。將3 mL水解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到另一個(gè)試管中，并加入3 mL乙醚/正己烷（1∶1，V/V）和3 mL水。將試管在4 ℃下以10 000 r/min離心10 min，用針和注射器除去含有KOH的下層（水相）。有機(jī)層在氮?dú)饬髡舭l(fā)器中于35 ℃蒸發(fā)至干燥。

將干殘留物加入0.5 mL乙腈/甲醇/正己烷（7︰2︰1，V/V），轉(zhuǎn)移到1.5 mL試管中，并在10 000 r/min（4℃）下離心5 min。上清液通過(guò)0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾，并儲(chǔ)存在-20 ℃棕色微量離心管中，直至HPLC分析。對(duì)于HPLC分析過(guò)程中的自動(dòng)取樣，將50 μL樣品轉(zhuǎn)移到帶螺旋蓋的琥珀色玻璃瓶中。

1.3 色譜條件及方法評(píng)價(jià)

使用Infinity Lab Poroshell 120EC-C18柱（4.6 mm×150 mm，4 μm），在Agilent 1260 HPLC系統(tǒng)上進(jìn)行色譜分析。使用自動(dòng)進(jìn)樣器自動(dòng)進(jìn)樣50 μm的注射體積和1 mL/min的流速。柱烘箱的溫度分別保持25 ℃。葉黃素在450 nm處被檢測(cè)到。流動(dòng)相為乙腈（A相）、甲醇（B相）和正己烷（C相）。流動(dòng)相通過(guò)超聲處理20 min脫氣。梯度洗脫程序：76%溶液A、21.5%溶液B、2.5%溶液C的初始條件。流動(dòng)相A的比例在20~22 min內(nèi)從76%線性下降至70%，B在20~22 min內(nèi)從21.5%線性下降至20%。在28~30 min內(nèi)，A相增加到76%，B相增加到21.5%。

5種類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品的5種不同稀釋度用于設(shè)置分析條件和確定保留時(shí)間。五布紅柚樣品中的類胡蘿卜素通過(guò)保留時(shí)間進(jìn)行鑒定，并使用外標(biāo)法生成的五點(diǎn)校準(zhǔn)曲線回歸線進(jìn)行定量。給出校準(zhǔn)線的線性。通過(guò)添加類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)評(píng)估準(zhǔn)確度，評(píng)估類胡蘿卜素添加濃度的回收率。

1.4 加香分析試驗(yàn)

分別將1.2小節(jié)所得提取液，用丙二醇稀釋到50%質(zhì)量濃度，混合均勻后，按0.05%的用量，用微量噴霧器分別均勻地噴于成品煙絲50 g上，放入溫度22±1℃、相對(duì)濕度60%±2%的恒濕箱內(nèi)平衡24 h，卷制成煙支，由評(píng)吸專家小組進(jìn)行評(píng)吸?？瞻捉M只加入等量蒸餾水。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜分析結(jié)果及評(píng)價(jià)

基于該方法的色譜條件結(jié)合VWD檢測(cè)器，對(duì)5種類胡蘿卜素物質(zhì)標(biāo)樣進(jìn)行最大吸收光譜掃描，掃描波長(zhǎng)190~500 nm。分析不同類胡蘿卜素物質(zhì)的最大吸收光譜，5種類胡蘿卜素物質(zhì)在450 nm左右均有較大吸收峰，因此，選取450 nm作為類胡蘿卜素物質(zhì)的定量檢測(cè)波長(zhǎng)。按照方法提供的液相色譜分離和分析條件，分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液、重慶巴縣產(chǎn)五布紅柚提取物、廣西賓陽(yáng)縣產(chǎn)五布紅柚提取物、浙江麗水產(chǎn)五布紅柚提取物、湖南懷化產(chǎn)五布紅柚提取物供試樣品溶液各50 μL，自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，分析結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，在上述色譜條件下，色譜峰尖銳，各相鄰色譜峰之間的分離度均大于1.4，理論塔板數(shù)均大于3 000，滿足類胡蘿卜素物質(zhì)定量要求。

2.2 色譜分析檢測(cè)方法學(xué)考察

2.2.1 色譜分析方法線性范圍及檢出限

精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別稀釋0，5，10，20，50和100倍，吸取上述6種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 μL進(jìn)行測(cè)定。以各色譜峰峰面積積分值（Y）對(duì)其濃度（X）進(jìn)行線性回歸。結(jié)果顯示，5種成分至少在0.02~500 mg/L的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r＞0.990 0），檢出限（rSN=3）在0.003~0.03 mg/kg，回歸方程、相關(guān)系數(shù)見表1。

表1 類胡蘿卜素物質(zhì)的線性關(guān)系（n=6）

2.2.2 色譜分析方法驗(yàn)證

吸取50.0 μL標(biāo)準(zhǔn)品，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別記錄5種組分的峰面積，計(jì)算得番茄紅素、β-胡蘿卜素、玉米黃素、α-胡蘿卜素、花藥黃素的SRSD（n=6），分別為1.36%，2.46%，3.37%，2.52%和1.77%，表明儀器精密度良好。

取紅柚提取物供試樣品溶液，在0~24 h內(nèi)每隔4 h進(jìn)樣1次，分別記錄5種組分的峰面積，計(jì)算得番茄紅素、β-胡蘿卜素、玉米黃素、α-胡蘿卜素、花藥黃素的SRSD（n=6），分別為3.79%，2.39%，2.49%，3.66%和2.75%，表明供試樣品溶液中5種組分在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

稱取6份紅柚提取物樣品，制備供試樣品溶液，在高效液相色譜下測(cè)得番茄紅素、β-胡蘿卜素、玉米黃素、α-胡蘿卜素、花藥黃素的SRSD（n=6），分別為4.25%，3.99%，2.74%，3.95%和2.72%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

取6份紅柚提取物（番茄紅素、β-胡蘿卜素、玉米黃素、α-胡蘿卜素、花藥黃素含量分別是316.79，50.81，7.19，6.37和4.03 mg/kg，總計(jì)類胡蘿卜素物質(zhì)含量為221.42 mg/kg），每份2.00 g，精密稱定，置于50.0 mL具塞錐形瓶中，分別精密加入3個(gè)不同濃度的番茄紅素、β-胡蘿卜素、玉米黃素、α-胡蘿卜素、花藥黃素標(biāo)準(zhǔn)品（10.0，40.0和80.0 mg/kg），按照前述制備供試樣品溶液，在高效液相色譜下色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，番茄紅素、β-胡蘿卜素、玉米黃素、α-胡蘿卜素、花藥黃素的平均回收率（n=6）在86.39%~105.96%之間，SRSD（n=6）在2.65%~4.30%。

表2 類胡蘿卜素物質(zhì)檢測(cè)加標(biāo)回收率

2.3 不同產(chǎn)地紅柚樣品檢測(cè)結(jié)果

分別取上述五布紅柚提取物樣品，制備供試樣品溶液，在高效液相色譜下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算5種組分的含量，結(jié)果見表3。

表3 不同樣品類胡蘿卜素物質(zhì)測(cè)定結(jié)果單位：mg/kg（以干基計(jì)）

從表3可以看出，不同五布紅柚提取物中番茄紅素、β-胡蘿卜素、玉米黃素、α-胡蘿卜素、花藥黃素總含量由高到低為五布紅柚（重慶巴縣）＞五布紅柚（廣西賓陽(yáng)縣）＞五布紅柚（浙江麗水）＞五布紅柚（湖南懷化）。

2.4 煙絲加香效果

不同來(lái)源五布紅柚提取物在煙草中的加香試驗(yàn)評(píng)吸結(jié)果見表4。重慶巴縣五布紅柚提取物能與煙香協(xié)調(diào)，增加香氣厚實(shí)、飽滿度和爆發(fā)力，改善余味，而且能增加焦甜香韻，明顯提升豐滿度和煙氣透發(fā)明亮度。

表4 煙絲加香效果評(píng)價(jià)結(jié)果

3 結(jié)論

采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定五布紅柚提取物及不同來(lái)源得到的五布紅柚提取物中番茄紅素、β-胡蘿卜素、玉米黃素、α-胡蘿卜素、花藥黃素5種類胡蘿卜素物質(zhì)含量，初步比較不同提取方法對(duì)5種類胡蘿卜素物質(zhì)含量的影響。檢測(cè)方法顯示，5種成分至少在0.02~500 mg/L的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r＞0.990 0），檢出限（rSN=3）在0.003~0.03 mg/kg，加標(biāo)回收率在86.39%~105.96%，檢測(cè)方法靈敏有效。重慶巴縣產(chǎn)五布紅柚提取物的煙絲加香最為明顯，尤其在增加焦甜香韻方面較為明顯，這與對(duì)類胡蘿卜素物質(zhì)中含量的試驗(yàn)結(jié)果一致。