王麗，李淑榮，句榮輝，楊洋，公麗艷

1.北京農業(yè)職業(yè)學院食品與生物工程系（北京 102442）；2.沈陽師范大學糧食學院（沈陽 110034）

蜂蜜是蜜蜂從花蜜或蜜露中獲得的天然產物，自古以來具有藥食兩用珍貴物質的美譽，不同植物來源直接影響蜂蜜的品質特性[1]。天然蜂蜜具有抗菌特性，可用于治療感染的傷口[2]。為滿足消費者的需求，許多國家天然蜂蜜需求量不斷增長，而如何區(qū)分蜂蜜的種類及來源是多數消費者關注的焦點。研究學者通過不同的方法區(qū)分蜂蜜的來源及真實性，如糖標記物[3]、脯氨酸含量[4]、抗氧化性等[5-6]。脯氨酸含量在不同的蜂蜜中差異很大，可用于測量總氨基酸含量水平。Dominguez等[4]報道自由基清除活性與脯氨酸含量呈正相關。研究發(fā)現，天然蜂蜜具有獨特的化學成分，如天然蜂蜜比加工過的蜂蜜含有更高的淀粉酶值[7]；天然蜂蜜具有較高的脯氨酸含量、總酚含量和抗氧化活性[8-9]。然而，這些特性受條件、產地、工藝方法和添加劑等因素的影響[9]，往往降低了蜂蜜分類中參數的有效性。

近年來，天然蜂蜜、加工蜂蜜和蜂蜜替代品的市場份額不斷增加。但不同樣本中數據集相對復雜，導致很難通過單獨某種物質含量的多少判斷蜂蜜的來源和質量。PCA方法是一種多變量建模和降維技術，能夠管理和解釋大型數據集，被有效用于脂肪酸[10]、肉類[11]和輻照食品[12]的區(qū)分與鑒別研究中。Brodnjk-Von?ina等[13]應用PCA對各種植物油進行分析，結果顯示花生中脂肪酸在PCA評分圖PC1-PC2中存在聚類，油酸和亞油酸之間存在近乎完美的負相關（r=-0.970）。國外對蜂蜜的理化和抗氧化能力進行一些研究[6,14]；我國還沒有詳細的采用PCA方法分析蜂蜜的理化和抗氧化能力。通過分析天然蜂蜜和商品蜂蜜品質特性指標之間的關系，旨在揭示蜂蜜主要品質特性，構建天然蜂蜜和商品蜂蜜的區(qū)分方法。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用樣品采集于專業(yè)合作社及當地超市典型蜂蜜樣品（如表1所示）。所有樣品均存放在4 ℃冰箱中備用。

表1 蜂蜜理化品質的描述性分析

1.2 試劑與儀器

氫氧化鈉、碳酸鈉等所有使用的化學品和試劑均為分析純均購自索萊寶（北京，中國）。沒食子酸、蘆丁、葡萄糖、槲皮素和脯氨酸（均購自美國Sigma公司）。

分光光度計（UV-2550，日本島津）；色度計（CR-400，日本島津）。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

5 g蜂蜜樣品用10 mL 20 ℃蒸餾水溶解，離心過濾定容至25 mL備用。

1.3.2 基本化學成分分析

水分測定參考GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》；酸度測定參考GB 5009.239—2016《食品中酸度的測定》；果糖、葡萄糖測定參考GB 5009.8—2016《食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定》；淀粉酶值測定參考GB/T 18932.16—2003《蜂蜜中淀粉酶值的測定》；羥基甲基糠醛（HMF）測定參考GB/T 18932.18—2003《蜂蜜中羥甲基糠醛含量的測定方法》。均采用國標法測定。

1.3.3 顏色分析

采用色差計測定。

1.3.4 脯氨酸含量

采用茚三酮法[15]測定。

1.3.5 總酚含量

采用福林酚法[16]測定。

1.3.6 總黃酮含量

采用槲皮素標準曲線法[17]測定。

1.3.7 總抗氧化活性

采用蘆丁標準曲線法[16]測定。

1.3.8 DPPH自由基清除活性

采用DPPH法[18]測定。

1.3.9 超氧陰離子自由基清除活性

采用鄰苯三酚法[19]測定。

1.4 數據分析

所有數據均以平均數±標準差表示。顯著性分析、相關性分析和主成分分析通過SPSS軟件完成。

2 結果與討論

2.1 基本化學成分分析

測定了10種蜂蜜的水分、酸度、果糖、葡萄糖、淀粉酶值和羥基甲基糠醛（HMF）（結果未顯示）。蜂蜜的含水量取決于環(huán)境條件、蜂蜜收獲期的操作及制造商的加工條件。蜂蜜中的水分與儲存期間的發(fā)酵情況密切相關。試驗所有蜂蜜樣品中的含水率為16.41%~19.56%，低于國際蜂蜜質量標準（≤20%）[20]。該結果與已報道不同類型蜂蜜的研究結果（13.63%~20.60%）[8]一致。蜂蜜的酸度主要是由于有機酸的存在，主要是葡萄糖酸與其相應的內酯及無機離子的平衡，如磷酸鹽、硫酸鹽和氯化物[21]。試驗中蜂蜜樣品的酸度范圍為0.12 °T~0.39 °T，平均值為0.21 °T。

蜂蜜主要由果糖和葡萄糖組成。其中蜂蜜樣品中果糖和葡萄糖含量分別為36.69%~45.74%和29.40%~33.53%，所有蜂蜜樣品中果糖含量均高于葡萄糖，這與Dagdeviren等[8]的報道一致。果糖和葡萄糖的總含量占蜂蜜質量的60%以上，符合GB 14963—2011對蜂蜜質量的規(guī)定。

淀粉酶值是評價蜂蜜新鮮度的重要指標。結果顯示P4的淀粉酶值最高[18.1 mL/（g·h）]，C3的淀粉酶值最低[2.57 mL/（g·h）]，所有天然蜂蜜的淀粉酶值均大于12 mL/（g·h），高于我國蜂蜜標準中要求淀粉酶值[4 mL/（g·h）]。市售蜂蜜的淀粉酶值為2.57~3.12 mL/（g·h），低于國家蜂蜜標準，試驗結果與Seow等[7]結果一致。淀粉酶值是天然蜂蜜中的主要成分，而淀粉酶值會受溫度等因素影響。蜂蜜中的HMF含量常用于分析確定蜂蜜的質量，與蜂蜜所處的不同美拉德反應階段、貯存時間有關[22]。結果顯示不同蜂蜜樣品中HMF含量有顯著差異。天然蜂蜜中HMF含量低于5 mg/kg，而商品蜂蜜中HMF含量在35~50 mg/kg，后者高于我國蜂蜜質量標準（低于40 mg/kg）。

2.2 顏色分析

不同蜂蜜樣品中色澤L*、a*、b*分析發(fā)現，C1的L*參數平均值最高（65.68），表示亮度大，P1的L*值最低（33.51），顏色偏暗。P2、P4和P5的L*值非常相似，分別為45.86，48.73和47.36。Brand-Williams等[18]根據亮度值將蜂蜜樣本分為2組：L*＞50的為淺色蜂蜜和L*≤50的為深色蜂蜜。據此分類，P3、P6、P7、C1、C2、C3可歸為淺色蜂蜜組，其他可歸為深色蜂蜜組。不同樣品a*值的變化范圍為-2.18~5.41，b*值的變化范圍為9.99~41.94。因此，所有顏色較深的樣品顯然都含有紅色和黃色成分。據報道，深色蜂蜜比淺色蜂蜜含有更多的酚酸衍生物，但黃酮含量較低。也有研究表明，蜂蜜的顏色與其抗氧化能力呈正相關[9]。蜂蜜的顏色是其花卉來源的特征，但加熱和貯藏時間也可能會影響蜂蜜的顏色，因此，后續(xù)可研究蜂蜜顏色與蜂蜜品質特性之間的關系。

2.3 脯氨酸含量

脯氨酸含量范圍為9.10~45.40 mg/kg，平均值為32.15 mg/kg。Dagdeviren等[8]報道過蜂蜜中脯氨酸的類似值。脯氨酸含量最高（P1、P2）和最低（C3）分別來自天然蜂蜜和商品蜂蜜。其中，天然蜂蜜脯氨酸含量為31.20~45.40 mg/kg，平均值為39.40 mg/kg，商品蜂蜜的脯氨酸含量為9.10~23.30 mg/kg，平均值為15.23 mg/kg。前者的脯氨酸含量是后者的2.5倍。這一結果與Dominguez等[4]的發(fā)現一致，即天然蜂蜜種含有較高的脯氨酸含量。脯氨酸是天然蜂蜜的主要成分，而脯氨酸非常穩(wěn)定，一般加工過程不易破壞。試驗中的天然蜂蜜中的脯氨酸含量顯著高于商品蜂蜜，其原因有待進一步研究。

2.4 總酚含量

酚類成分是影響蜂蜜功能性質的一類重要化合物，具有明顯的抗氧化和自由基清除作用[23]。試驗中，總酚含量通過沒食子酸的標準曲線方程（R2=0.999 4）計算不同樣品蜂蜜中總酚含量的變化范圍是20.05~34.35 mg GAE/100 g，其平均值為28.71 mg GAE/100 g。Dominguez等[4]調查27個來自布基納法索的蜂蜜樣品總酚含量（32.59~114.75 mg GAE/100 g）高于試驗結果。Socha等[24]測定波蘭蜂蜜中酚類物質的含量遠低于試驗中酚類物質的含量（4.46~15.04 mg GAE/100 g）。試驗中總酚的平均含量與Beretta等[25]的研究結果（27.86 mg GAE/100 g）一致。蜂蜜樣品中總酚含量差異顯著，但這些數據不足以區(qū)分2種蜂蜜的差異。

2.5 總類黃酮含量

類黃酮是一類具有強大抗氧化性能的植物成分。因此，可通過蜂蜜中總黃酮含量表征蜂蜜的抗氧化性能。通過槲皮素生成的標準曲線方程（R2=0.999 8）分析蜂蜜樣品中總黃酮含量為18.07~23.74 mg QE/100 g，平均值為21.27 mg QE/100 g。天然蜂蜜中的總類黃酮含量（22.24 mg QE/100 g）高于市場購買蜂蜜的平均值（19.02 mg QE/100 g）。試驗中，蜂蜜的總黃酮含量顯著高于天然蜂蜜的報道值[4]，與Sochar等[26]的報道一致。

2.6 總抗氧化活性

用硫氰酸鐵法測定蜂蜜的總抗氧化活性，測定脂質過氧化初始階段產生的過氧化量。不同蜂蜜樣品的抗氧化性能依次為C1（840.77 mg/100 g）＞C3（747.48 mg RE/100 g）＞P1（716.38 mg RE/100 g）＞C2（702.91 mg RE/100 g）＞P2（690.47 mg RE/100 g）＞P7（673.37 mg RE/100 g）＞P6（669.74 mg RE/100 g）＞P4（643.82 mg RE/100 g）＞P5（627.24 mg RE/100 g）＞P3（585.26 mg RE/100 g）。結果顯示市售蜂蜜樣品具有較高的抗氧化活性。總酚和總黃酮含量是蜂蜜抗氧化特性的主要影響因素，2.4和2.5未發(fā)現市售蜂蜜和天然蜂蜜間有顯著差異，因此需要通過其他數學分析方法進一步分析。

2.7 DPPH自由基清除活性能力

采用有機自由基穩(wěn)定劑1, 1-二苯基-2-三硝基肼的DPPH法測定自由基清除活性，通常用IC50值表示，以及使DPPH初始濃度降低50%所需的抗氧化劑量。因此，樣品的IC50值越低，其抗氧化活性越高[27]。P5的活性最低，IC50值為79.04 mg/mL，顯著高于其他樣品的IC50值。其他樣品的IC50值僅為16.11~40.04 mg/mL。蜂蜜對DPPH自由基的清除能力與Beretta等[25]報道的IC50值基本一致。

2.8 超氧陰離子自由基清除活性

分析結果顯示不同蜂蜜的超氧陰離子自由基清除活性存在顯著差異。所分析蜂蜜的超氧陰離子自由基清除活性范圍為187.48~1 621.24 mg/mL，平均值為469.88 mg/mL。市售蜂蜜IC50較低，為190.54~192.20 mg/mL，天然蜂蜜IC50較高，為187.48~1 621.24 mg/mL。因此，商品蜂蜜的抗氧化能力高于天然蜂蜜，這與其他報道中天然蜂蜜抗氧化能力更高的說法不一致。因此，必須采用新方法評價天然蜂蜜和商品蜂蜜的質量。

2.9 相關性分析

為進一步明確蜂蜜不同品質特性指標之間的關系，采用相關性分析探索不同蜂蜜中15個品質指標的關系，揭示各指標之間的相互作用（具體表格未顯示）。結果發(fā)現10個樣品理化性質之間的相關系數。結果顯示，脯氨酸與水分（r=0.851）、淀粉酶值（r=0.834）、總酚含量（r=0.526）、總黃酮含量（r=0.914）、酸度（r=0.816）、HMF（r=-0.924）、果糖（r=-0.937）顯著相關。淀粉酶值與總酚含量（r=0.637）和總黃酮含量（r=0.804）呈正相關?？偡雍颗c總黃酮含量呈正相關（r=0.646）。蜂蜜各成分之間的相互關系與Yücel等[28]的研究結果相似。脯氨酸是蜂蜜最重要的特性之一，與抗氧化活性有顯著關系。脯氨酸和總抗氧化性能呈負相關（r=-0.413），這與其他報道相反[28]。

2.10 主成分分析（PCA）

通過相關性分析結果發(fā)現，不同蜂蜜的理化特性和抗氧化能力具有顯著的相關關系，但很難確定不同蜂蜜整體的品質質量。主成分分析是基于原有蜂蜜品質特性指標，通過降維的方式，將蜂蜜品質指標間建立相關關系模型，可以分析不同蜂蜜品質特性之間的關系。通過主成分分析將蜂蜜中的15個品質指標構建成4個主成分，4個主要成分對樣品的理化和抗氧化性能的總變異性有顯著影響，第1主成分解釋了總變異的58.76%，前2個主成分解釋了總變異的72.59%，前3個主成分解釋了總變異的82.07%，前4個主成分解釋了總變異的88.83%。前4個主成分的特征值大于其余主成分的特征值。這一發(fā)現符合PCA的標準。在PCA模型中，第1個成分解釋了58.76%的變異（圖1 A），其中水分、淀粉酶值、總黃酮含量、脯氨酸、酸度和總酚含量提供較高的正載荷值。果糖和羥甲基糠醛表現出較高的負載荷值。第2個成分解釋了13.84%的變異（圖1 B），由2個變量（a*，總抗氧化能力）定義，均具有較高的正載荷值。第3個成分解釋了9.48%的變異（圖1 C），其中葡萄糖、總酚含量、DPPH自由基清除活性和超氧陰離子自由基清除活性具有較高的載荷值。第4個成分解釋了6.76%的變異（圖1 D），其中的超氧陰離子自由基清除活性具有較高的正載荷值，DPPH自由基清除活性具有負載荷值。PC1和PC2的得分圖（圖2）將天然蜂蜜和商品蜂蜜分為2個不同的組。結果與各樣品的PCA總分一致（表2）。

圖1 PCA模型中前4個主成分的載荷值

圖2 PC1得分與PC2得分值對不同來源樣品分類的影響

表2 不同蜂蜜主成分得分

圖2右側的樣品（PC1中較高的正得分值包括淀粉酶值、總黃酮含量、脯氨酸等）對應的是天然蜂蜜樣品。圖2左側的樣品（PC1中酸度、果糖和HMF得分為負值）對應的是市售樣品。因此，天然蜂蜜的淀粉酶值、總黃酮含量和脯氨酸含量較高，其PC1軸為正方向。商品蜂蜜具有較高的酸度，果糖和HMF，符合PC1軸負方向。即天然蜂蜜具有較高的淀粉酶值、總黃酮含量和脯氨酸含量，商品蜂蜜具有較高的酸度、果糖和羥甲基糠醛。PC1-PC2使得樣本可以根據它們的來源100%的聚類，沒有異常值。通過表2結果可以看出，綜合主成分得分排在前7位的為天然蜂蜜樣品，后3位的為商品蜂蜜，研究結果顯示聚類分析結果與主成分分析結果一致。

3 結論

通過相關性分析和主成分分析天然蜂蜜和市售蜂蜜品質特性的差異及特點。相關性分析結果發(fā)現，不同蜂蜜品質指標之間具有顯著差異，同時也具有一定相關關系，如市售蜂蜜比天然蜂蜜具有較好的抗氧化性，但很難判斷不同蜂蜜的品質特性優(yōu)良，也無法通過哪些指標判斷不同來源的蜂蜜。而PCA可通過降維、建模，進一步判斷不同品質特性對蜂蜜整體品質特性的影響。通過PCA建模得出，果糖、淀粉酶值、總黃酮含量、羥甲基糠醛、脯氨酸等品質特性可將不同蜂蜜樣品區(qū)分開來?？偪寡趸芰?、DPPH自由基清除活性和超氧陰離子自由基清除活性在PCA模型建立和蜂蜜品質評分上具有簡化評價的作用。脯氨酸和羥甲基糠醛是這2類樣品的主要區(qū)別指標。