劉曉雪，奚楚瑜，李文杰，張苒嬌，田洋, ，宋爽,

1.云南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院（昆明 650201）；2.國家辣木加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心（昆明 650201）；3.云南省生物大數(shù)據(jù)重點實驗室（昆明 650201）

牛肝菌多分布于云南，是牛肝菌科和松塔牛肝菌科等真菌的統(tǒng)稱，其滋味鮮美，營養(yǎng)豐富，具有一定的食用價值和藥用價值，同時也是一種世界性著名食用菌。由于其具有多種抗病的藥用保健價值，眾多學者逐漸由食用擴大轉(zhuǎn)入到藥用研究及藥用開發(fā)研究[8-9,11]。

益生元（prebiotics）作為一類膳食補充劑，種類繁多，生產(chǎn)商品化的主要是一些有雙歧因子功能的低聚糖[4]。同時其對雙歧桿菌等益生菌有促進作用，研究表明益生元功效包括：非消化性和低熱量；減輕便秘；調(diào)節(jié)腸內(nèi)微生物菌群的平衡，增強免疫促進有益菌群（雙歧桿菌等），抑制有害菌群（沙門菌等）[3]。

隨著生活水平的提高，人們更注重健康飲食，在食品或飲料中添加可以促進雙歧桿菌生長的低聚糖，刺激腸道內(nèi)原有雙歧桿菌和乳酸桿菌的生長繁殖，有助于增強自身免疫和機體健康[6]。該試驗采用熒光定量PCR技術(shù)對食用牛肝菌的小鼠菌群進行分析，研究其對動物腸道微生物的益生作用及對益生菌群的影響作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

昆明鼠（湖南斯萊克實驗動物有限公司）；益生元（合生元）；糞便DNA提取試劑盒（Solarbio公司）；實時熒光定量試劑盒（Takara，Code No.638319）；瓊脂糖凝膠電泳槽（BIO-RAD公司）；1 mL注射器（浙江康德萊醫(yī)療器械股份有限公司）；滅菌水；dd水（Solarbio公司）；引物（上海捷瑞生物工程有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

StepOnePlusTM實時熒光定量PCR儀（美國運用生物系統(tǒng)公司）；3K15高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；PowerPacTM Basic電泳儀（BIO-RAD）；BP121S電子天平（Stertorius公司）。

1.3 方法與步驟

1.3.1 試驗動物分組及處理

試驗小鼠隨機分成3組，分別為陽性對照組（灌胃益生元溶劑）、試驗組（灌胃牛肝菌粉末溶液），空白試驗組（灌胃生理鹽水）每組6只，試驗期間各組小鼠每日灌胃0.4 mL樣品，連續(xù)7 d，分別采取試驗動物第1天和第5天試驗動物的新鮮糞便于自封袋中，放于-80 ℃冰箱中保存。

1.3.2 糞便細菌DNA的提取

根據(jù)諾唯贊DNA Extraction Kit（Prepackaged）試劑盒說明書提取糞便細菌中的DNA。

1.3.3 DNA濃度及純度檢測

制膠：稱取1 g瓊脂糖置于錐形瓶中，加100 mL 1×TAE溶液，加熱至瓊脂糖全部融化。

加樣：將10 μL DNA樣品與2 μL的Loading buffer混合，取10 μL加入小槽內(nèi)，第一格用Marker作對照。

電泳：120 V 60 min，溴酚藍移動到距離膠板下緣1 cm處時，停止電泳。

觀察：在紫外燈下進行觀察，DNA存在則顯示出紅色熒光條帶，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

1.3.4 標準菌模板DNA的制備

收集培養(yǎng)好的標準菌新鮮菌體，使用DNA提取試劑盒提取DNA，且DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20 ℃，以防止DNA的降解。

1.3.5 PCR引物的設(shè)計

參考文獻設(shè)計引物序列[1,15]，如表1所示，Real-time PCR法采用的引物序列、退火溫度、擴增片段大小。

表1 引物序列名稱

1.3.6 SYBR Green實時熒光定量PCR的建立

將提取好的DNA按照SYBR Green實時熒光定量PCR試劑盒進行熒光定量PCR試驗[5]。

按照反應(yīng)體系將配好試劑的8排管按照設(shè)計好的順序平整放置于實時PCR儀中。根據(jù)程序完成PCR反應(yīng)，于2 h后觀察試驗結(jié)果。

1.3.7 標準曲線的制作

收集培養(yǎng)好的標準菌新鮮菌體，采用相同的方法試劑盒提取DNA，將得到的DNA樣品用無菌TE稀釋10倍，用紫外分光光度計測定A260nm，計算DNA濃度，并根據(jù)每種細菌基因組大小計算相應(yīng)模板數(shù)，以標準品模板數(shù)的對數(shù)為橫坐標，PCR反應(yīng)過程中出現(xiàn)熒光信號的初始循環(huán)數(shù)（Ct）為縱坐標即可做標準曲線。

1.3.8 待測糞便樣品

將糞便樣品中提取的DNA分別進行2種細菌的DNA熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系和條件與標準曲線制備時完全相同。反應(yīng)完畢后根據(jù)熔解曲線分析PCR產(chǎn)物的特異性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個試驗重復(fù)3次，試驗結(jié)果用均數(shù)±標準差表示。數(shù)據(jù)結(jié)果采用Excel 2007軟件進行分析，帶入Graphpad prism5軟件進行繪制柱形圖和分析顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線

其拷貝數(shù)=（6.023×1023×DNA濃度）/（660×堿基對數(shù)），計算出每微升的拷貝（見表2、表3），稀釋為5個濃度梯度其拷貝數(shù)的對數(shù)值作為橫坐標，PCR反應(yīng)過程中出現(xiàn)熒光信號的初始循環(huán)數(shù)（Ct）的平均值為縱坐標即可做標準曲線。

表2 雙歧桿菌標準曲線數(shù)據(jù)

表3 乳酸桿菌標準曲線數(shù)據(jù)

雙歧桿菌、乳桿菌的標準曲線如圖1和圖2所示。結(jié)果顯示：雙歧桿菌標準曲線方程為y=-2.59x+43.996，相關(guān)系數(shù)R2=0.988 1；乳桿菌的標準曲線方程為y=-3.1x+39.048，相關(guān)系數(shù)R2=0.978 6。

圖1 雙歧桿菌標準曲線

圖2 乳酸桿菌標準曲線

2.2 引物特異性檢測

擴增曲線是PCR動態(tài)過程中的曲線，呈S型。其中，對數(shù)期是熒光信號指數(shù)擴增的階段，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系。其用于表示不同拷貝數(shù)的模板循環(huán)數(shù)與熒光強度的關(guān)系，分為基線期、對數(shù)期及平臺期3個階段。通過實時熒光定量進行實時監(jiān)測可得到標準品DNA擴增圖和樣品熔解曲線見圖3~圖6。

圖3 雙歧桿菌DNA樣品定量PCR擴增圖

圖4 雙歧桿菌DNA樣品定量PCR擴增熔解曲線

圖5 乳桿菌DNA樣品定量PCR擴增圖

圖6 乳酸桿菌DNA樣品定量PCR擴增熔解曲線

從PCR擴增熔解曲線中可以看出，乳酸桿菌只有1個峰值說明其引物的特異性良好，而雙歧桿菌出現(xiàn)2個峰值說明其特異性不是很好，存在原因可能是引物濃度太大[12]。從擴增圖可看出，DNA模板隨著循環(huán)數(shù)增加，其熒光強度不斷增，在PCR擴增圖中找到相對應(yīng)的樣品的Ct值并取三者的平均數(shù)，如表4和表5所示。

表4 引物乳酸桿菌未知樣品Ct值

表5 引物雙歧桿菌未知樣品Ct值

通過將未知樣品的Ct值帶入到相應(yīng)標準曲線中對未知樣品進行比對，如表6和表7所示。陽性對照組（益生元試驗組）的對數(shù)轉(zhuǎn)換后的拷貝數(shù)高于試驗組及空白對照組，且第5天的樣品的拷貝數(shù)高于第1天樣品的拷貝數(shù)，就試驗組的拷貝數(shù)而言，其第5天的數(shù)據(jù)同樣高于第1天樣品的拷貝數(shù)，說明小白鼠在灌胃前后腸道內(nèi)的微生物發(fā)生一定變化，通過連續(xù)灌胃牛肝菌使得體內(nèi)乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量增多，通過與空白試驗組進行對照，進一步說明牛肝菌的益生作用，其對動物腸道內(nèi)的有益微生物具有一定促進作用。

表6 乳酸桿菌的拷貝數(shù)

表7 雙歧桿菌的拷貝數(shù)

3 結(jié)論與討論

牛肝菌由于其食味香甜可口，營養(yǎng)豐富，是一種世界性著名食用菌。牛肝菌越來越受到重視，其具有極高的經(jīng)濟效益和社會效益，而試驗結(jié)果也為野生菌開發(fā)研究提供一定參考。

實時熒光定量PCR檢測是一種能夠和特異性的雙鏈DNA結(jié)合的熒光染料，在反應(yīng)過程中，隨著PCR產(chǎn)物增加，PCR產(chǎn)物與SYBR Green結(jié)合的量也隨之增大[13]，二者結(jié)合后形成的熒光信號可被儀器檢測到，通過對已知拷貝數(shù)的不同稀釋倍數(shù)的陽性模板做熒光定量PCR，可做標準曲線，未知樣品通過與標準曲線比較即可得出定性及定量結(jié)果。

為驗證配制體系的試劑是否污染可以設(shè)定一個無模板的陰性對照做進一步驗證。所以在試驗前應(yīng)進行大量預(yù)試驗確定最佳參數(shù)和工藝。