紀(jì)偉 ，劉曉梅，蘇文英，任立凱，胡曙鋆，陳克龍

1.連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院（連云港 222000）；2.連云港市園藝蔬菜指導(dǎo)站（連云港 222000）；3.青海師范大學(xué)（西寧 810000）

靈芝在廣義上是靈芝屬（Ganoderma lingzhi）的總稱，是一種大型食藥用真菌[1]，有“仙草”“瑞草”等美稱，是馳名中外的珍稀中藥材之一[2]，在日本、巴基斯坦和其他一些國家及地區(qū)均有發(fā)現(xiàn)[3]，根據(jù)生物多樣性信息數(shù)據(jù)庫（Global Biodiversity Information Facility，GBIF）檢索及分析，在已上傳的8 179個數(shù)據(jù)中，除了南極洲，其他六大洲均有發(fā)現(xiàn)，歐洲上傳的靈芝樣本數(shù)據(jù)最多。

靈芝具有豐富的藥理成分，且無毒副作用，有效成分包括靈芝多糖[4]、多肽[5]、三萜類[6]及16種氨基酸[7]等。靈芝能降低中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性，有一定鎮(zhèn)痛作用[8]，有解毒[9]、降血糖[10]及抗輻射[11]等效應(yīng)，靈芝多糖更是能提高機體免疫力[12]，有一定治療哮喘[13]和抗腫瘤作用[14]。靈芝還擁有極高的文化觀賞價值[15]，自古被人視為吉祥、富貴之物，可將之培育成外形美觀的觀賞植物[16]。

花果山位于江蘇省連云港市南云臺山中麓[17]，是江蘇省諸山的最高峰[18]，是連云港市生物多樣性、豐富性和典型性代表區(qū)域之一，區(qū)域內(nèi)具有豐富的野生菌物資源，尤其以野生靈芝資源最為豐富。通過對連云港花果山采集的野生靈芝進行分離、ITS分子鑒定、靈芝菌株生物學(xué)特性及種子液發(fā)酵時間對出芝的影響研究，在加強野生靈芝資源研究和保護的基礎(chǔ)上，挖掘優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源，為靈芝在食品工業(yè)的產(chǎn)品開發(fā)提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

菌株來源：于2021年9月在連云港市花果山（北緯34°62′493′，東經(jīng)119°27′808′）采集獲得，標(biāo)本編號lynk2103。將采集的野生靈芝進行組織分離得到菌株，保存于連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌種質(zhì)資源庫。

馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基、酵母浸粉、磷酸二氫鉀、無水硫酸鎂、蔗糖、D（+）-麥芽糖、蛋白胨、瓊脂糖等。

YDS-10-80液氮罐（樂山市東亞機電工貿(mào)有限公司）；凝膠成像系統(tǒng)（上海培清科技有限公司）；PCR儀（德國Eppendorf公司）；CX43顯微鏡（日本Olympus公司）；超凈工作臺（德國Airtech）；MD-550離心機（德國Eppendorf公司）。

1.2 野生靈芝菌株分離及保存

記錄野生靈芝的生境及其形態(tài)特征，寄生的植被的位置，子實體的形狀、顏色、輪紋、菌蓋厚度和菌肉顏色等形態(tài)特征。采用組織分離法，選取幼嫩未散粉野生靈芝子實體，用含有75%酒精濃度的酒精棉球擦拭靈芝菌蓋表面，滅菌后的手術(shù)刀切除表層，再用滅菌后的鑷子夾取內(nèi)部組織，接種于PDA平板上，于25 ℃暗培養(yǎng)5 d，挑取萌發(fā)的菌絲，獲得純培養(yǎng)菌株，將菌絲接種于PDA試管斜面上，待斜面長滿置于4 ℃冰箱保存。

1.3 菌株的ITS分子鑒定

采用康維世紀(jì)真菌基因組DNA快速提取試劑盒提取DNA，提取的DNA進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進行PCR擴增，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。擴增條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物交由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，所測得ITS序列與GenBank數(shù)據(jù)庫進行Blast比對，采用軟件MEGA 7.0對所測ITS序列進行比對、近鄰相接法（neighbor-joining method，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[19]。

1.4 液體培養(yǎng)基碳氮源篩選

以20 g/L的葡萄糖、蔗糖、淀粉、麥芽糖和甘露醇為液體培養(yǎng)基的唯一碳源，以10 g/L的蛋白胨、硝酸鉀、硝酸銨、硝酸鈉和硫酸銨為液體培養(yǎng)基的唯一氮源，在pH 6.8~7.0、25 ℃，160 r/min條件下避光培養(yǎng)，分別探究不同碳氮源對靈芝菌株液體發(fā)酵產(chǎn)生的生物量（菌絲體干重）的影響。

液體發(fā)酵菌絲體干重的測定方法：量取50 mL靈芝發(fā)酵液倒入離心管中，以10 000 r/min離心5 min，將離心后獲得的菌絲體轉(zhuǎn)移到恒重的稱量瓶中，于80℃烘干，稱定，計算其菌絲體干重，每個試驗設(shè)定2個重復(fù)。

1.5 液體發(fā)酵條件單因素試驗

將發(fā)酵液分別放置于轉(zhuǎn)速為50，100，150，200和250 r/min的恒溫振蕩器中培養(yǎng)，考察轉(zhuǎn)速對靈芝菌株液體發(fā)酵產(chǎn)生的生物量（菌絲體干重）的影響；將發(fā)酵液分別放置于溫度為15，20，25，30和35 ℃的恒溫振蕩器中培養(yǎng)，考察溫度對靈芝菌株液體發(fā)酵產(chǎn)生的生物量（菌絲體干重）的影響；在500 mL搖瓶中將發(fā)酵液裝液量分別設(shè)定為50，100，15，200和250 mL，考察搖瓶裝液量對靈芝菌株液體發(fā)酵產(chǎn)生的生物量（菌絲體干重）的影響；將發(fā)酵液接種量分別設(shè)置為2%，4%，6%，8%和10%，考察接種量對靈芝菌株液體發(fā)酵產(chǎn)生的生物量（菌絲體干重）的影響，每個試驗設(shè)定2個重復(fù)。

1.6 液體培養(yǎng)基配方不同因素和水平正交試驗

培養(yǎng)溫度25 ℃，初始pH自然，接種量5%、接種菌齡5 d，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，無水硫酸鎂與磷酸二氫鉀含量均為1 g/L，選定常規(guī)和適于規(guī)?；a(chǎn)的碳源、氮源和無機鹽，進行3個因素4個水平[L16(43)]正交試驗設(shè)計考察，具體設(shè)計見表1。統(tǒng)計發(fā)酵液中菌絲體干重，以此為考察指標(biāo)，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，找出最優(yōu)配方。

表1 液體培養(yǎng)基的L16(43)正交試驗設(shè)計 單位：g/L

1.7 液體發(fā)酵過程曲線

以篩選出的最優(yōu)碳源、氮源、最佳發(fā)酵條件和最優(yōu)培養(yǎng)基配方來探究靈芝菌株液體發(fā)酵過程中生物量（菌絲體干重）、pH和胞外多糖含量變化規(guī)律，每10 h取1次發(fā)酵液進行測定，取樣16次，每個試驗設(shè)定2個重復(fù)。

液體發(fā)酵液pH測定方法：在超凈臺中，無菌操作取樣發(fā)酵液15 mL于50 mL燒杯中，使用pH計進行測定，測定前pH計需要校準(zhǔn)。

液體發(fā)酵胞外多糖測定：使用100 mL離心管取樣發(fā)酵液25 mL，每個試驗設(shè)定2個重復(fù)，向裝有發(fā)酵液的每個離心管中加入無水乙醇75 mL，震蕩后靜置12 h，使用離心機以10 000 r/min離心5 min，倒掉上清液，收集沉淀，使用70 ℃烘干，稱定，計算其胞外多糖含量[20]。

1.8 液體菌種不同發(fā)酵時間菌絲吃料速度及對出芝影響

選取不同發(fā)酵時間的種子液，時間為90~160 h，每10 h作為1個試驗組，分別接種至固體培養(yǎng)基中，測定菌絲吃料速度和滿袋時間，每個試驗設(shè)定2個重復(fù)，并記錄最后靈芝子實體出芝情況。

1.9 統(tǒng)計方法

采用SPSS和Excel軟件對數(shù)據(jù)處理分析，采用Duncan新復(fù)極差法對組間差異顯著性進行分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，采用Photoshop軟件處理圖片，利用Origin 9.1軟件對所得數(shù)據(jù)作圖，采用MEGA 7.0對ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生靈芝分離及保存

由圖1（A）可知，野生靈芝菌株生境植被主要為麻櫟、板栗等闊葉樹種。由圖1（B和C）可知，幼嫩靈芝子實體近半圓形，成熟靈芝子實體近圓形，菌蓋較厚，輪紋明顯，半徑3.6~6.4 cm；菌柄紅褐色，側(cè)生，長度4.5~10.7 cm，幼嫩子實體菌蓋邊緣淡黃色，邊緣肥厚。由圖1（D）可知，在PDA培養(yǎng)基中菌落近圓形，菌落中心菌絲有凸起輪紋、菌落周邊菌絲表面平整，菌絲色澤為白色，菌絲平伏、濃密、均勻，無白色氣生菌絲。由圖1（E）可知，通過奧林巴斯顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)菌絲粗壯，分枝密度不高，有隔膜，可見鎖狀聯(lián)合，無雜菌。分離獲得的菌株使用試管斜面（見圖1 F），菌株命名為lynk2103，保存于4 ℃冰箱。

圖1 野生靈芝子實體及菌落形態(tài)

2.2 菌株lynk2103的ITS分子鑒定

經(jīng)PCR擴增和凝膠電泳檢測，獲得 ITS序列片段612 bp，如圖2所示。由電泳圖結(jié)果中可以看到條帶介于500~750 bp之間，與ITS測序結(jié)果一致，測序數(shù)據(jù)已上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫中，GenBank登錄號為OP784796。測序結(jié)果在GenBank中進行Blast比對，可以判定菌株lynk2103為Ganoderma lingzhi。使用鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。從進化樹可以看出，根據(jù)分支信息lynk2103與已報道靈芝近交程度較低。

圖2 靈芝ITS序列DNA電泳圖和系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 液體培養(yǎng)基碳氮源篩選

由圖3可知，在不同碳源（葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇和淀粉）的培養(yǎng)下，菌株lynk2103的液體發(fā)酵產(chǎn)生的生物量（菌絲體干重）呈先增加后平穩(wěn)趨勢，碳源為葡萄糖時，液體發(fā)酵產(chǎn)生生物量最多（菌絲體干重），達到12.34 g/L，培養(yǎng)5 d的發(fā)酵液開始進入平穩(wěn)期；麥芽糖和蔗糖作為碳源時，液體發(fā)酵產(chǎn)生生物量次之；隨后依次為淀粉和甘露醇。故選擇葡萄糖作為碳源。

圖3 碳源和氮源對菌株lynk2103發(fā)酵的影響

在不同氮源（蛋白胨、硝酸鉀、硝酸鈉、硝酸銨和硫酸銨）的培養(yǎng)下，菌株lynk2103的液體發(fā)酵產(chǎn)生的生物量（菌絲體干重）呈先增加后平穩(wěn)趨勢，氮源為蛋白胨時，液體發(fā)酵產(chǎn)生生物量最多（菌絲體干重），達到11.94 g/L，培養(yǎng)6 d的發(fā)酵液開始進入平穩(wěn)期；硝酸銨作為氮源時，液體發(fā)酵產(chǎn)生生物量次之；隨后依次為硝酸鉀和硝酸鈉；硫酸銨作為氮源時液體發(fā)酵產(chǎn)生生物量最少。故選擇蛋白胨作為氮源。

2.4 液體發(fā)酵條件單因素試驗

由圖4可知：靈芝液體發(fā)酵的最佳轉(zhuǎn)速為150 r/min，對應(yīng)菌絲體干重達10.50 g/L，較轉(zhuǎn)速200和250 r/min對應(yīng)菌絲體干重分別提高1.89%和8.76%，差異不顯著，但顯著高于轉(zhuǎn)速100和50 r/min對應(yīng)菌絲體干重（P＜0.05）；靈芝液體發(fā)酵的最佳接種量為10%，對應(yīng)菌絲體干重達10.55 g/L，顯著高于其他4種接種量對應(yīng)的菌絲體干重（P＜0.05），較菌絲體干重第二高的8%接種量提高10.70%；靈芝液體發(fā)酵的500 mL搖瓶的最佳裝液量為100 mL，對應(yīng)菌絲體干重達10.45 g/L，較菌絲體干重第二高的裝液量150 mL提高3.36%，差異不顯著，但顯著高于其他3種裝液量對應(yīng)菌絲體干重（P＜0.05）；靈芝液體發(fā)酵的最佳溫度為30 ℃，對應(yīng)菌絲體干重達11.18 g/L，顯著高于其他4種發(fā)酵溫度對應(yīng)的菌絲體干重（P＜0.05），較菌絲體干重第二高的25 ℃發(fā)酵溫度提高12.88%。

圖4 靈芝菌株lynk2103的液體發(fā)酵菌條件優(yōu)化

2.5 靈芝菌株lynk2103的液體培養(yǎng)基配方不同因素和水平正交試驗

由表2可知：因素A（葡萄糖）極差R值最大為3.31，其次是因素C（蛋白胨）極差R值為3.23，因素B（酵母浸粉）極差R值最小為0.78，說明培養(yǎng)基成分對靈芝液體發(fā)酵產(chǎn)生生物量（菌絲體干重）的影響大小順序為葡萄糖含量＞蛋白胨含量＞酵母浸粉含量；因素A（葡萄糖）4水平數(shù)據(jù)的綜合平均最高為10.83，因素B（酵母浸粉）2水平數(shù)據(jù)的綜合平均最高為9.44，因素C（蛋白胨）3水平數(shù)據(jù)的綜合平均最高為10.42，說明最優(yōu)水平為A4B2C3，即葡萄糖40 g/L、酵母浸粉10 g/L、蛋白胨15 g/L加上固定的磷酸二氫鉀1 g/L、無水硫酸鎂1 g/L，為該正交試驗最優(yōu)發(fā)酵配方。

表2 L16(43)正交試驗結(jié)果

2.6 優(yōu)化后靈芝菌株lynk2103的液體發(fā)酵菌過程曲線

經(jīng)160 h的發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果如圖5所示。根據(jù)菌絲體干重變化曲線可知，0~50 h為遲緩期，50~130 h為對數(shù)生長期，130~150 h為平穩(wěn)期，而從150 h開始進入衰亡期。在150 h靈芝生物量（菌絲體干重）達到最高為18.19 g/L；根據(jù)發(fā)酵液pH和胞外多糖變化曲線可知，發(fā)酵液pH隨著發(fā)酵時間的延長而降低，與菌絲體干重變化存在一定的負相關(guān)，pH從150 h開始趨于穩(wěn)定。根據(jù)菌絲體干重和pH發(fā)酵過程曲線的規(guī)律，可作為調(diào)控發(fā)酵的依據(jù)。

圖5 靈芝菌株lynk2103的原種液體發(fā)酵過程曲線

2.7 液體菌種不同發(fā)酵時間菌絲吃料速度及對出芝影響

選取不同發(fā)酵時間的種子液分別接種至固體培養(yǎng)基中，測定菌絲吃料速度和滿袋時間，如圖6所示，因液體菌種不同的發(fā)酵時間菌絲濃度不同，對菌絲吃料速度和菌袋長滿時間產(chǎn)生影響。液體發(fā)酵時間120 h時，菌絲吃料速度最高，吃料速度為0.56 cm/d，其次是110 h，液體發(fā)酵時間90 h對應(yīng)的吃料速度最低為0.40 cm/d，其中液體菌種發(fā)酵時間110和120 h對應(yīng)的吃料速顯著高于發(fā)酵時間90 h對應(yīng)的吃料速度（P＜0.05）。對菌袋長滿時間進行統(tǒng)計，液體菌種發(fā)酵時間90 h長滿菌袋時間最長為35 d，顯著長于其他組別（P＜0.05），菌袋長滿時間與前期菌絲吃料速度有一定的對應(yīng)關(guān)系，但不完全一致。

圖6 液體菌種不同發(fā)酵時間菌絲吃料速度和滿袋時間

不同發(fā)酵時間種子液因菌絲濃度的影響，菌絲吃料速度和固體培養(yǎng)基滿袋時間存在著差異，但后期對子實體的形成影響并不大，如圖7所示，不同發(fā)酵時間的種子液對應(yīng)的出芝情況，均可以正常形成靈芝子實體，從經(jīng)濟角度考慮種子液發(fā)酵時間應(yīng)選擇菌絲生長速度快和滿袋時間最快的參數(shù)，菌株lynk2103對應(yīng)最佳發(fā)酵時間為120 h。

圖7 液體菌種不同發(fā)酵時間靈芝子實體出芝情況

3 討論

通過對采集的野生標(biāo)本進行形態(tài)學(xué)鑒定及分離后的菌株進行ITS分子鑒定，確定菌株lynk2103為靈芝屬真菌。從進化樹可以看出，根據(jù)分支信息lynk2103與已報道靈芝近交程度較低，說明該菌株具有較好的遺傳多樣性，測序數(shù)據(jù)已上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫中，GenBank登錄號為OP784796，菌絲具有鎖狀聯(lián)合，說明為雙核菌絲，具備子實體形成條件。在碳源對靈芝液體發(fā)酵產(chǎn)生生物量影響的研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖是該菌株最優(yōu)碳源，這與邢源月等[21]研究結(jié)果存在一定差異，這可能因為不同菌株在不同碳源利用效率方面存在一定差異所致，葡萄糖是一種單糖，是傳統(tǒng)的速效碳源，采購方便，價格低廉，更有利于生產(chǎn)推廣。氮源對靈芝液體發(fā)酵產(chǎn)生生物量影響研究發(fā)現(xiàn)有機氮源和無機氮源均可以被該菌株利用，蛋白胨是該菌株最優(yōu)氮源，有機氮源效果更佳，這可能與有機氮源中還含有一定的微量元素和其他營養(yǎng)成分有關(guān)。

液體發(fā)酵條件單因素試驗研究發(fā)現(xiàn)：靈芝液體發(fā)酵的最佳轉(zhuǎn)速為150 r/min，最佳接種量為10%，這與多數(shù)食藥用真菌要求一致；最佳裝液量為100 mL，對應(yīng)菌絲體干重達10.45 g/L，較菌絲體干重第二高的裝液量150 mL提高3.36%，差異不顯著，但顯著高于其他3種裝液量對應(yīng)菌絲體干重（P＜0.05），如果從生產(chǎn)效率角度考慮，可采用150 mL的裝液量，同時也說明靈芝發(fā)酵過程耗氧量較高，在工業(yè)化發(fā)酵罐發(fā)酵靈芝液體菌種時需要提高發(fā)酵的通氣比；靈芝液體發(fā)酵的最佳溫度為30 ℃，相較于其他食用菌最佳發(fā)酵溫度25 ℃要高，這與野生靈芝在夏季高溫季山林中最為豐富剛好對應(yīng)，另外劉月琴等[22]發(fā)現(xiàn)靈芝在發(fā)酵溫度32℃時可以提高靈芝活性成分黃酮的含量與本試驗結(jié)果類似。

靈芝菌株液體發(fā)酵配方正交試驗研究中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基成分對靈芝液體發(fā)酵產(chǎn)生生物量的影響順序為葡萄糖含量＞蛋白胨含量＞酵母浸粉含量，說明碳源是首要影響因素，同時發(fā)現(xiàn)過高或過低的氮源均不利于靈芝菌絲體的合成，這可能是因為氮源過低時候很快被消耗，而氮源過高時一方面改變了培養(yǎng)基碳氮比，另一方面濃度過高影響滲透壓，而不利于靈芝發(fā)酵液生物量的積累，通過正交試驗科學(xué)的確定菌株lynk2103的最佳配方。

在優(yōu)化后的條件下，通過對菌株lynk2103的液體發(fā)酵過程進行跟蹤，根據(jù)發(fā)酵液生物量變化曲線發(fā)現(xiàn)在150 h靈芝生物量（菌絲體干重）達到最高為18.19 g/L，高于何偉等[23]研究結(jié)果；根據(jù)發(fā)酵液pH變化曲線可知，發(fā)酵液pH隨著發(fā)酵時間的延長而降低，與菌絲體干重變化存在一定的負相關(guān)，根據(jù)菌絲體干重和pH過程曲線的規(guī)律，可作為發(fā)酵終點的綜合判定和發(fā)酵過程調(diào)控的依據(jù)[24]，另外菌絲體在培養(yǎng)過程由于新陳代謝產(chǎn)生的有機酸積累，對菌絲體的生長起到一定的抑制作用，因此菌絲體發(fā)酵起始pH要適當(dāng)調(diào)高，已報道對發(fā)酵初始pH的研究主要在酸性及中性條件下，唐晨旻等[25]探究靈芝在初始pH 2~11較廣范圍內(nèi)的發(fā)酵情況，通過試驗發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后菌絲體干重最高在初始pH為10，賀新生等[26]報道樹舌靈芝菌絲體發(fā)酵的最適宜pH為8.5，這些現(xiàn)象均與此次研究的試驗現(xiàn)象相吻合。

不同發(fā)酵時間種子液因菌絲濃度不同影響菌絲在固體培養(yǎng)基中的生長速度，但并不是菌絲濃度越高，菌絲在固體培養(yǎng)基中速度越快[27]，所以在菌種發(fā)酵時間選擇上，一方面需要參照液體菌種發(fā)酵曲線，另一方面還要考慮菌絲在固體中吃料速度，菌絲濃度過高或者過低都對菌絲生長速度有影響，菌絲量過低，菌絲在固體培養(yǎng)基中的生長點過少，菌絲量過高，老化菌絲較多，菌種活力不夠[28]，試驗中靈芝菌株對應(yīng)的最佳發(fā)酵時間為120 h，不僅吃料速度快，而且滿袋時間最短。另外，試驗發(fā)現(xiàn)不同發(fā)酵時間的種子液對出芝情況影響較小，但對后期代謝產(chǎn)物含量、子實體生物量和產(chǎn)孢量仍需進一步研究。

4 結(jié)論

此次研究采集分離獲得的菌株lynk2103通過形態(tài)學(xué)和ITS基因序列分析，確定菌株為靈芝屬真菌，測序數(shù)據(jù)上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫中，GenBank登錄號為OP784796，從進化樹可以看出，lynk2103與已報道靈芝近交程度較低，說明該菌株具有較好的遺傳多樣性，菌絲具有鎖狀聯(lián)合，說明為雙核菌絲，具備子實體形成條件；液體培養(yǎng)基最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為蛋白胨；液體發(fā)酵的最佳轉(zhuǎn)速150 r/min，最佳接種量10%，最佳裝液量100 mL和最佳發(fā)酵溫度30 ℃，最佳培養(yǎng)基配方為葡萄糖40 g/L、酵母浸粉10 g/L、蛋白胨15 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L和無水硫酸鎂1 g/L；原種發(fā)酵曲線0~50 h為遲緩期，50~130 h為對數(shù)生長期，130~150 h為穩(wěn)定期，150 h開始進入衰亡期，發(fā)酵液pH與菌絲體干重變化呈負相關(guān)；靈芝菌株液體發(fā)酵最佳時間為120 h，不僅吃料速度快，而且滿袋時間最短，不同發(fā)酵時間的種子液對菌絲吃料速度和固體培養(yǎng)基滿袋時間存在著差異，但對出芝情況影響較小。