朱耀磊，鄭玉茹，張昕昕，孟婷，和朝軍，馬永杰

洛陽師范學(xué)院食品與藥品學(xué)院（洛陽 471934）

嗜水氣單胞菌屬是一種常見的條件性致病菌，經(jīng)常分離于各種水體、水產(chǎn)品及其制品中[1-2]。近年來有關(guān)嗜水氣單胞菌屬的研究，多側(cè)重在其對食品的致腐特性和機(jī)理等方面，作為水產(chǎn)品優(yōu)勢腐敗菌，能夠表達(dá)多種腐敗特性，如水解蛋白質(zhì)、在多種介質(zhì)表面形成生物膜、運(yùn)動性、產(chǎn)生生物胺等[3-4]，且不同來源菌株的致腐特性各有差異。

NaCl能夠改變環(huán)境滲透壓，對分離自淡水黃河鯉魚的嗜水氣單胞菌產(chǎn)生脅迫。群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）系統(tǒng)在微生物抵抗外界環(huán)境變化中起著重要作用，同時也是食品腐敗微生物的重要致腐調(diào)控系統(tǒng)[5]。研究表明QS系統(tǒng)對微生物的腐敗特性如生物膜、泳動性、生物胺、TVB-N產(chǎn)生、胞外蛋白酶等具有顯著的調(diào)控作用[6]。Zhu等[7]和Li等[8]的報道顯示，腐敗菌的QS系統(tǒng)會受培養(yǎng)條件及環(huán)境脅迫的影響而發(fā)生變化，進(jìn)而對細(xì)菌的腐敗特性產(chǎn)生影響，因此研究鹽度對腐敗菌QS系統(tǒng)及腐敗性狀的影響對食品加工條件的選擇及其品質(zhì)控制具有重要意義。

隨著我國對黃河流域生態(tài)環(huán)境的保護(hù)和改善，野生及養(yǎng)殖黃河鯉魚產(chǎn)量將會面臨急速增長，以分離自黃河鯉魚的一株嗜水氣單胞菌A.hydrophilaYCR17為研究對象，探究不同NaCl濃度作用下該菌腐敗特性的變化，為黃河鯉魚腐敗機(jī)理和防腐保鮮研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)菌株A.hydrophilaYCR17（分離自腐敗黃河鯉魚）；紫色桿菌CV026（C.violaceum026，由大連工業(yè)大學(xué)侯紅漫教授惠贈）；酵母浸粉、胰蛋白胨、蛋白胨（北京奧博星生物技術(shù)有限公司）；結(jié)晶紫染液（上海生工生物有限公司）；無水甲醇、無水乙醇、冰醋酸（均購自天津大茂試劑有限公司）；偶氮酪蛋白（上海麥克林生化科技有限公司）；三氯乙酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；PE Victor Nivo酶標(biāo)儀（美國珀金埃爾默公司）；Sigma 3-18KS高速冷凍離心機(jī)（德國Sigma公司）；UV-2600紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）。

1.3 方法

1.3.1 鹽度對A.hydrophilaYCR17 AHLs產(chǎn)生的影響

采用報告平板法[9]對嗜水氣單胞菌AHLs產(chǎn)生進(jìn)行測定。分別將嗜水氣單胞菌接種到不同NaCl濃度（0，0.5%，1%，2%和3%）的LB培養(yǎng)基中，于30 ℃培養(yǎng)至細(xì)菌穩(wěn)定期。取100 mL菌液，用乙酸乙酯萃取法提取AHLs。配制LB固體培養(yǎng)基，當(dāng)其冷卻至50 ℃左右時，按照1︰10的比例加入過夜培養(yǎng)的CV026菌液，混勻后移取20 mL傾注平板。待平板冷卻后，在平板中央打孔，加入60 μL的AHLs提取液，置于28 ℃下靜置培養(yǎng)24 h。

1.3.2 A.hydrophilaYCR17胞外蛋白酶活性的測定

采用脫脂奶平板法[10]，分別配制15%的脫脂奶粉溶液和1.5%瓊脂溶液，于115 ℃滅菌30 min，冷卻至60 ℃后將脫脂奶瓊脂溶液以1︰1的比例混合制備脫脂乳固體平板，凝固后在平板中央打孔備用。分別取1 mL在0，0.5%，1%，2%和3% NaCl條件下培養(yǎng)至穩(wěn)定期的A.hydrophilaYCR17菌液，按8 000 r/min離心10 min，收集上清液，用孔徑0.22 μm的過濾器進(jìn)行過濾，吸取100 μL添加到脫脂乳固體平板中央小孔中，在30 ℃下培養(yǎng)。觀察平板中央的透明酶解區(qū)域大小，并測量直徑。

以偶氮酪蛋白為底物測定A.hydrophilaYCR17胞外蛋白酶活性[11]，分別取150 μL上述無菌濾液添加到250 μL 1%偶氮酪蛋白溶液，在30 ℃下水浴1 h，加入1.2 mL 10%三氯乙酸，混勻后，室溫靜置30 min；按8 000 r/min離心5 min，吸取500 μL上清液添加到500 μL 1 mol/L NaOH溶液中混勻，測定其吸光度A440nm，以每小時A440nm增加0.001定義為1個酶活力單位（U），每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 鹽度對A.hydrophilaYCR17生物膜形成的影響

將過夜培養(yǎng)至穩(wěn)定期的A.hydrophilaYCR17菌液分別用含有0，0.5%，1.0%，2.0%和3.0% NaCl的LB培養(yǎng)基1︰100稀釋，取200 μL加入到96孔板中，于30 ℃靜置培養(yǎng)48 h。按照Ye等[12]的方法測定生物膜的含量。

A.hydrophilaYCR17在玻璃表面生物膜形成的測定[9]。將過夜培養(yǎng)的菌液按1∶100比例分別接種到含有0，0.5%，1.0%，2.0%和3.0% NaCl的LB培養(yǎng)基中，分別取2 mL加入玻璃試管（1 cm×10 cm）中，于30℃靜置培養(yǎng)48 h；培養(yǎng)結(jié)束后棄去菌液，用10 mmol/L的PBS洗滌3次，加入2.5 mL無水甲醇固定15 min，棄去管中溶液，在60 ℃下干燥15 min。隨后加入2.5 mL 0.1%結(jié)晶紫溶液染色15 min，結(jié)束后用去離子水洗滌3次，于60 ℃干燥。觀察管壁A.hydrophilaYCR17生物膜的形成情況。

1.3.4 NaCl對嗜水氣單胞菌YCR17泳動性的影響

分別配制NaCl終濃度為0，0.5%，1.0%，2.0%和3.0%的泳動性培養(yǎng)基，滅菌后量取20 mL傾注平板，待平板冷卻凝固后，吸取3 μL培養(yǎng)至穩(wěn)定期的菌液，加到泳動性平板中央，小心移至30 ℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)[13]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，使用SPSS Statistics 25軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用Office Excel 2019和Origin 9軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl濃度對A.hydrophila YCR17 AHLs產(chǎn)生的影響

由圖1可知，紫色桿菌在AHLs的誘導(dǎo)下可以產(chǎn)生紫色素使其周圍呈現(xiàn)紫色區(qū)域，紫色素蔓延的范圍大小代表AHLs量的多少。圖1顯示，NaCl濃度為0.5%和1.0%時對AHLs的產(chǎn)生有促進(jìn)作用，而在高濃度NaCl（2.0%和3.0%）作用時，紫色圈直徑減小，AHLs產(chǎn)生受到抑制。

圖1 不同濃度NaCl對A.hydrophila YCR17 AHLs產(chǎn)生的影響

2.2 NaCl濃度對A.hydrophila YCR17生物膜的影響

由圖2可知，在NaCl濃度為0時，A.hydrophilaYCR17生成的生物膜較0.5%和1%時明顯降低（P＜0.05），而當(dāng)濃度增加到2.0%和3.0%時，生物膜的形成顯著性減少（P＜0.05）。由圖3可觀察到試管底部區(qū)域形成紫色圓環(huán)，是A.hydrophilaYCR17菌株在試管底部區(qū)域形成的生物膜被結(jié)晶紫染液染成紫色。表明該菌能夠在玻璃介質(zhì)表面形成生物膜，在低濃度NaCl作用下，生物膜形成的紫色較深，區(qū)域較大，隨著NaCl濃度的增高，紫色區(qū)域逐漸減少，顏色變淺，表明生物膜的形成受到抑制，結(jié)果顯示A.hydrophilaYCR17生物膜的形成對高濃度NaCl較為敏感。

圖2 不同濃度NaCl下A.hydrophila YCR17生物膜的形成

圖3 不同濃度NaCl下A.hydrophila YCR17生物膜的形成

2.3 NaCl濃度對A.hydrophila YCR17胞外蛋白酶產(chǎn)生的影響

脫脂乳平板檢測結(jié)果顯示，0，0.5%和1% NaCl的作用下，胞外蛋白酶的酶解蛋白區(qū)域直徑未發(fā)生明顯變化，隨著NaCl濃度的增高，水解透明區(qū)域逐漸變小，表明該菌的胞外蛋白酶活性受到NaCl顯著抑制作用。

由圖4可知，偶氮酪蛋白法的檢測結(jié)果與脫脂乳平板法的測定結(jié)果基本呈現(xiàn)相同趨勢，結(jié)果顯示A.hydrophilaYCR17的胞外蛋白酶活性在0和0.5% NaCl作用下未發(fā)生明顯的變化，NaCl濃度升高到1%時，蛋白酶活性開始下降（P＜0.05），2.0%和3.0%時蛋白酶水解活性明顯降低。

圖4 不同濃度NaCl作用下A.hydrophila YCR17胞外蛋白酶的活性

2.4 NaCl濃度對A.hydrophila YCR17泳動性的影響

由圖5可知，在NaCl作用下，A.hydrophilaYCR17在泳動性培養(yǎng)基表面的擴(kuò)散區(qū)域發(fā)生明顯變化，低濃度NaCl下該菌的泳動性較強(qiáng)，隨著NaCl濃度的增高該菌的泳動性半徑減少，區(qū)域變小，表明該菌的泳動性受到高濃度NaCl的抑制作用。

圖5 不同NaCl作用下A.hydrophila YCR17的泳動性

3 討論

A.hydrophilaYCR17是一株分離自腐敗黃河鯉魚的主要致腐菌，該菌能夠產(chǎn)生胞外蛋白酶，形成強(qiáng)生物膜，泳動性等腐敗特性，含有群體感應(yīng)AI-1型腐敗調(diào)控系統(tǒng)[14]。在NaCl的作用下，A.hydrophilaYCR17菌株的上述腐敗特性受到明顯的抑制作用，與Jahid等[3]和趙丹丹等[15]的研究結(jié)果一致。研究表明，嗜水氣單胞菌的QS系統(tǒng)對腐敗特性具有顯著的調(diào)控作用，這種調(diào)控作用是以AHLs為媒介實(shí)現(xiàn)[16]。AHLs的產(chǎn)生受luxR/I系統(tǒng)調(diào)控，AHLs的產(chǎn)生隨NaCl濃度的增加呈現(xiàn)逐漸減少表明luxR/I調(diào)控系統(tǒng)也受到抑制，使得生物膜、泳動性和胞外蛋白酶活性等腐敗特性的表達(dá)降低[15,17]。并且，NaCl濃度會改變A.hydrophilaYCR17菌株生長環(huán)境的滲透壓，可能導(dǎo)致AHLs、胞外多糖及胞外蛋白酶的分泌和釋放受到抑制，進(jìn)而影響到各腐敗性狀的表達(dá)[18-19]。同時，NaCl濃度的增加使得微生物的生存環(huán)境受到影響，可能導(dǎo)致細(xì)菌為了抵抗外界環(huán)境而降低新陳代謝、減少代謝產(chǎn)物的分泌[20]。試驗(yàn)結(jié)果表明，NaCl脅迫下A.hydrophilaYCR17的AHLs產(chǎn)生受到抑制，影響到該菌的QS系統(tǒng)，進(jìn)而減少對生物膜、胞外蛋白酶產(chǎn)生、泳動性等腐敗特性的調(diào)控，造成各腐敗特性的變化。

4 結(jié)論

在NaCl脅迫下，分離自腐敗黃河鯉魚的優(yōu)勢腐敗菌A.hydrophilaYCR17的致腐相關(guān)特性、胞外蛋白酶、生物膜、泳動性及群體感應(yīng)AHLs等均受到明顯抑制作用，初步探究了A.hydrophilaYCR17的致腐機(jī)理，在黃河鯉魚的加工和貯藏保鮮的研究中有著重要作用。