劉嬌，李源，王佳瑤，張莉力，顧英，許云賀

錦州醫(yī)科大學(xué)食品與健康學(xué)院（錦州 121000）

酸漿法生產(chǎn)淀粉在我國已有數(shù)百年的歷史，酸漿是將豆類磨碎成淀粉乳后放置一段時間經(jīng)微生物自然發(fā)酵，形成的一種淡黃色酸性液體[1]。酸漿中微生物的絮凝作用致使淀粉顆粒迅速形成大的絮凝團，從而加快淀粉與蛋白質(zhì)、纖維素等雜質(zhì)的分離。用酸漿法生產(chǎn)的淀粉被認為比用離心等其他方法生產(chǎn)的淀粉更適合制作傳統(tǒng)的東方食品粉絲[2]。這種傳統(tǒng)的酸漿發(fā)酵方法仍在中國淀粉生產(chǎn)中占主導(dǎo)地位[3]。豌豆淀粉由于來源廣泛，價格便宜且成膠能力強、凝膠制品色澤好、持水性好等其他淀粉無法比擬的優(yōu)點，被用于制作粉絲、粉皮、涼粉等傳統(tǒng)食品[4]。酸漿中的微生物類群對有效提升酸漿法的生產(chǎn)效率起關(guān)鍵性作用。但是很多因素限制了酸漿法在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用，如環(huán)境因素會導(dǎo)致酸漿的酸度不易控制，酸漿中的腐敗雜菌也會致使不同批次淀粉產(chǎn)品的質(zhì)量各不相同。所以若將酸漿的生產(chǎn)由自然發(fā)酵改變?yōu)榧兎N發(fā)酵，將會解決眾多豌豆淀粉生產(chǎn)企業(yè)在酸漿發(fā)酵方面的技術(shù)問題。

絮凝作用菌的絮凝活性高低是其能否應(yīng)用到工業(yè)化生產(chǎn)中的重要評價指標之一[5]。因此，試驗利用平板分離法從豌豆酸漿中分離篩選出一株生長穩(wěn)定且具有高絮凝淀粉活性的菌株并對其絮凝性質(zhì)進行分析，從而改善淀粉生產(chǎn)廢液排放導(dǎo)致的環(huán)境污染問題，減少淀粉的生產(chǎn)時間和酸漿的使用量，為豌豆酸漿接種發(fā)酵提供備選菌種及純種發(fā)酵、穩(wěn)定生產(chǎn)豌豆淀粉并研發(fā)淀粉專用微生物絮凝劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

新鮮豌豆（川南特產(chǎn)城網(wǎng)絡(luò)商店）；豌豆淀粉（新良新鄉(xiāng)網(wǎng)絡(luò)商店）；綠豆酸漿（微生物課題組自然發(fā)酵獲得）；細菌基因組DNA提取試劑盒（沈陽立信生物技術(shù)有限公司）；PCR引物（派森諾生物公司）；葡萄糖、大豆蛋白胨、蔗糖、酵母浸粉、H2O2（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；溶菌酶（Sigma-Aldrich公司）；胃蛋白酶（雙匯實業(yè)集團有限公司）；胰蛋白酶（南寧龐博生物工程有限公司）；纖維素酶（山東隆科特酶制劑有限公司）；糖化酶（博立生物制品有限公司）。

豌豆汁制備方法：200 g新鮮豌豆加1 L蒸餾水加熱煮沸后，轉(zhuǎn)小火煮30 min，用0.125 mm孔徑（120目）篩子加8層紗布過濾，用蒸餾水定容至1 L備用。

基礎(chǔ)碗豆汁培養(yǎng)基：20 g葡萄糖、1 g大豆蛋白胨，碗豆汁1 L，調(diào)pH至6.5，于121 ℃滅菌30 min。

改良碗豆汁培養(yǎng)基：30 g蔗糖、0.5 g酵母浸粉，碗豆汁1 L，調(diào)pH至6.0，于121 ℃滅菌30 min。

UV-1600紫外可見分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）；T20MM立式高速冷凍離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司）；ABI-2720PCR儀（美國Applied Biosystems公司）；Mini Pro 300V Power Supply電泳儀（major science USA）；ABI 3730XL測序儀（美國Applied Biosystems公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 豌豆乳的制備

稱取40 g豌豆洗凈，加入1 L自來水浸泡過夜（12~18 h），利用破壁機調(diào)節(jié)至4檔打漿10 s，使用0.125 mm孔徑（120目）篩子加8層紗布過濾后得到新鮮豌豆乳。

1.2.2 豌豆酸漿的制備

1.2.2.1 發(fā)酵豌豆酸漿的工藝

豌豆浸泡→打漿→新鮮豌豆乳→加老漿→靜置棄上清液→定容至1 L→密封培養(yǎng)（20~25 ℃）

1.2.2.2 酸漿的制備

新鮮豌豆乳中加入30%的綠豆發(fā)酵酸漿。棄2/3含有蛋白的上清液，用涼白開定容至1 L，置于室溫下發(fā)酵24 h。

1.2.2.3 酸漿的活化

將上述酸漿加入新制備的豌豆乳中。持續(xù)活化3個月，當酸漿pH 4~5且漿液呈青白色并有少量水沫時，結(jié)束發(fā)酵并檢測絮凝率，此時自然發(fā)酵的豌豆酸漿微生物區(qū)系趨于穩(wěn)定。

1.2.3 DNA的提取與高通量測序分析

取絮凝率最高時的豌豆酸漿，分為酸漿組（SQ1，SQ2和SQ3）和沉淀淀粉組（CD1，CD2和CD3），酸漿組是指豌豆全漿中的上清液，沉淀淀粉組是指豌豆全漿中的沉淀淀粉，對2組樣品進行DNA的提取。PCR擴增正向引物為520F，反向引物為802R。將合格的序列進行文庫的擴建并上機進行高通量測序[6]。

1.2.4 ASV聚類及物種組成分析

利用Uparse軟件做ASVs聚類，代表序列為出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列，利用分類數(shù)據(jù)庫在門和屬水平上統(tǒng)計樣品的物種組成。

1.2.5 菌株的分離與篩選

初篩。酸漿組和沉淀淀粉組分別用滅菌后的生理鹽水進行梯度稀釋，選取適宜稀釋度涂布于MRS固體培養(yǎng)基平板上，挑取不同形態(tài)的單個菌落進行活化，劃線接種于MRS斜面培養(yǎng)基上。以pH為指標，篩選出pH低于3.8的產(chǎn)酸菌株，對其斜面進行保存。

復(fù)篩。將產(chǎn)酸菌株接種至碗豆汁培養(yǎng)基中35 ℃培養(yǎng)24 h。以絮凝率為指標復(fù)篩出絮凝率大于45%的菌株。將菌株活化后再次梯度稀釋，重復(fù)劃線3次以上，直至鏡檢下菌落形態(tài)一致。

1.2.6 絮凝率（FR）測定

將5 g豌豆淀粉、100 mL蒸餾水和5 mL待測液依次加入100 mL量杯中，快速攪拌3 min后，靜置沉降3 min。在上清液面下10 mL處取樣。用紫外可見分光光度計測定其在550 nm波長處的吸光度，以空白豌豆汁培養(yǎng)基作對照試驗[7-8]，并用式（1）計算絮凝率。

絮凝率（FR）=（A-B）/A×100% （1）式中：A為對照組在550 nm波長處的吸光度；B為試驗組在550 nm波長處的吸光度。

1.2.7 菌種鑒定

1.2.7.1 形態(tài)特征觀察

對絮凝率最高的菌株LJ5平板上的菌落形態(tài)進行觀察并進行革蘭氏染色試驗，使用光學(xué)顯微鏡對其個體形態(tài)進行觀察。

1.2.7.2 菌種生理生化試驗

對篩選出的絮凝優(yōu)勢菌LJ5進行生理生化試驗，以鑒定細菌種屬。

1.2.7.3 16S rDNA的基因序列測定以及系統(tǒng)發(fā)育分析

細菌基因組PCR擴增，擴增正向引物為P1（27F）和反向引物為P2（1492R）。測序結(jié)果在GenBank中進行BLAST比對，使用MEGA 10.0構(gòu)建絮凝優(yōu)勢菌的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.8 生長曲線繪制及培養(yǎng)時間確定

將S.harbinensisLJ5接種于改良碗豆汁培養(yǎng)基中，擴大培養(yǎng)至第3代時，間隔2 h取樣。用紫外可見分光光度計測定在600 nm波長處的吸光度，繪制生長曲線并確定最佳生長時間。采用平板計數(shù)法測定最佳生長時間的活菌數(shù)。

1.2.9 S.harbinensisLJ5絮凝性質(zhì)分析

1.2.9.1 S.harbinensisLJ5絮凝活性分布

為確定S.harbinensisLJ5起絮凝作用的是菌體分泌物還是菌體細胞本身，利用光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察加入改良碗豆汁發(fā)酵液前后豌豆淀粉顆粒的分布狀態(tài)。對S.harbinensisLJ5發(fā)酵液、上清液、未洗滌菌懸液和洗滌菌懸液的絮凝率進行測定。發(fā)酵液為S.harbinensisLJ5在35 ℃培養(yǎng)36 h的碗豆汁發(fā)酵液；上清液為碗豆汁發(fā)酵液在10 000 r/min條件下離心10 min后的上清液；未洗滌菌懸液為碗豆汁發(fā)酵液離心后的菌體細胞加入等體積的無菌蒸餾水；洗滌菌懸液為碗豆汁發(fā)酵液離心后洗滌菌體細胞2次，再次加入等體積的無菌蒸餾水。

1.2.9.2 S.harbinensisLJ5絮凝活性的熱穩(wěn)定性分析

分別測定30，40，50，60和70 ℃條件下水浴30 min后的S.harbinensisLJ5發(fā)酵液對豌豆淀粉懸濁液的絮凝率。

1.2.9.3 酶處理對S.harbinensisLJ5發(fā)酵液絮凝活性的影響

發(fā)酵液在4 ℃條件下以8 000 r/min離心20 min，收集菌體，用pH 7.0的磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L NaH2PO4與0.2 mol/L Na2HPO4一定比例混合）離心洗滌菌體數(shù)次，至菌體呈潔凈白色為止，收集菌體備用[9]。準確稱取1.0 g菌體，用磷酸鹽緩沖液懸浮菌體，分別加入0.3%酶質(zhì)量濃度1 mg/L的溶菌酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、纖維素酶和糖化酶，酶解pH分別為7.8，8.0，2.5，4.8和4.5，酶解溫度分別為52，37，37，50和60℃，放在200 r/min的搖床上酶解2 h[10]。以未處理的發(fā)酵液為對照組，分別測定各試驗組的絮凝率。

1.2.9.4 金屬離子對S.harbinensisLJ5發(fā)酵液絮凝活性的影響

淀粉懸濁液本身帶負電性，所以選擇陽離子進行絮凝試驗。配制1%濃度的各鹽溶液：KCl、NaCl、CaCl2和MgCl2。將發(fā)酵液與1 mL各鹽溶液一起加入100 mL的豌豆淀粉懸濁液，分別測定各試驗組的絮凝率[11]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 26.0、MEGA 10.0和Origin 2021a軟件進行數(shù)據(jù)分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 豌豆酸漿樣品中細菌群落的稀疏曲線

稀疏曲線可以判斷測序數(shù)量能否反映樣本中物種的組成以及測序深度和物種的豐富度程度[12-13]。隨著測序數(shù)量不斷增加，曲線呈快速上升趨勢，表明還有大量物種未被發(fā)現(xiàn)，而曲線平穩(wěn)時表明測序深度已經(jīng)飽和且基本覆蓋到樣本中所有的物種及絕大部分的微生物信息[14-15]。如圖1所示，測序數(shù)量超過20 000時，2個樣本顯示出趨于平坦的稀疏曲線，表明隨著測序深度不斷增加幾乎不會有新的物種產(chǎn)生，因此試驗的測序量合理[16-17]。

圖1 細菌群落稀疏曲線分析

2.2 豌豆酸漿樣品中細菌多樣性分析

由圖2可知，韋恩圖結(jié)果共得到1 088個ASVs，酸漿組中含637個ASVs，沉淀淀粉組中含451個ASVs，其中2組共有的ASVs數(shù)為88個，2組特有的ASVs分別為549和363個，表明酸漿組中微生物群落較沉淀淀粉組豐富。2組樣品多樣性指數(shù)分析見表1。酸漿組和沉淀淀粉組的細菌區(qū)系，分別獲得168 902和125 097條有效序列。Chao1指數(shù)可估計樣本群落中包含的物種總數(shù)，物種總數(shù)越多值越大[18]。因此，酸漿組中的物種總數(shù)較沉淀淀粉組的物種總數(shù)多。酸漿組的Shannon、Simpson指數(shù)顯著（P＜0.05）高于沉淀淀粉組。結(jié)果表明，酸漿組的細菌豐富度及多樣性更高。

表1 2種樣品中細菌Alpha多樣性指數(shù)

圖2 2種樣品的ASVs聚類

2.3 豌豆酸漿樣品中細菌群落結(jié)構(gòu)差異分析

2.3.1 門水平下豌豆酸漿樣品中細菌群落結(jié)構(gòu)分析

由圖3可知，在門水平下，酸漿組與沉淀淀粉組共鑒定出8個門類細菌。酸漿組中變形菌門（Pro-teobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria），所占比例依次為56.92%，38.35%，3.80%和0.91%；沉淀淀粉組中厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）和藍藻菌門（Cyanobacteria），所占比例依次為55.84%，41.03%，1.76%和0.98%。酸漿組中的優(yōu)勢菌門為變形菌門，沉淀淀粉組中的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門。

圖3 基于門水平的細菌結(jié)構(gòu)

2.3.2 屬水平下豌豆酸漿樣品中細菌群落結(jié)構(gòu)分析

由圖4可知，在屬水平下，酸漿組與沉淀淀粉組的細菌隸屬于8個屬，酸漿組中醋酸桿菌屬（Acetobacter）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和乳球菌屬（Lactococcus）所占比例依次為55.70%，25.12%和10.13%；沉淀淀粉組中乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和醋酸桿菌屬（Acetobacter）所占比例依次為55.60%，41.03%和1.52%。酸漿組中的優(yōu)勢菌屬為醋酸桿菌屬，沉淀淀粉組中的優(yōu)勢菌屬為乳酸桿菌屬。

圖4 基于屬水平的細菌結(jié)構(gòu)

2.4 菌株的分離與篩選

以pH為指標從自然發(fā)酵豌豆酸漿樣品中初篩共分離出36株pH低于3.8的菌株，以絮凝率為指標復(fù)篩出6株絮凝率大于45%的菌株，結(jié)果見表2。選擇絮凝率最高達71.2%±2.0%的菌株LJ5作為后續(xù)試驗的研究對象。

表2 由豌豆酸漿分離出的6株菌對淀粉的絮凝率

2.5 菌種鑒定

對絮凝活性較高的菌株LJ5進行菌種鑒定。菌株LJ5的菌落形態(tài)見圖5（A），光學(xué)顯微鏡下形態(tài)見圖5（B）。

圖5 菌株LJ5菌落形態(tài)及其革蘭氏染色菌體形態(tài)

2.5.1 形態(tài)特征觀察

通過光學(xué)顯微鏡觀察絮凝優(yōu)勢菌LJ5在MRS培養(yǎng)基中的形態(tài)和菌落特征。菌株LJ5的菌體大小為0.5 μm×2.5 μm，桿狀，鏈狀排布方式、革蘭氏陽性、無芽孢、不運動。菌株LJ5的菌落大小為1~3 mm，菌落形態(tài)為灰白色圓形、不透明、低凸隆起有光澤、邊緣不整齊、表面不光滑。

2.5.2 生理生化試驗

試驗結(jié)果見表3，初步判斷絮凝優(yōu)勢菌LJ5為乳酸桿菌屬。

表3 菌株LJ5生理生化試驗結(jié)果

2.5.3 16 S rDNA序列分析結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

6株絮凝菌純化后的16S rDNA的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖6所示。使用測序儀ABI 3730XL進行DNA測序。用NCBI中的BLAST程序?qū)⑵唇雍蟮男蛄形募cNCBI中16S rDNA數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行比對，選擇相似度最大的序列作為物種鑒定的結(jié)果[19]。

圖6 菌株LJ5的16S rDNA電泳圖譜

經(jīng)16S rDNA鑒定，菌株LJ5的16S rDNA序列全長為1 451 bp，經(jīng)GenBank比對，與Schleiferilactobacillus harbinensis相似性達到100%。利用MEGA 10.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株LJ5與Schleiferilactobacillus harbinensisOK271739.1親緣關(guān)系最近，結(jié)果如圖7所示。結(jié)合其群體、個體形態(tài)特征、生理生化試驗及16S rDNA序列比對，確定菌株LJ5為哈爾濱施萊弗乳桿菌，命名為Schleiferilactobacillus harbinensisLJ5。

圖7 菌株LJ5基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.6 生長曲線的測定

生長曲線如圖8所示。接種0~4 h為延滯期，4~24 h為對數(shù)生長期，24~58 h為穩(wěn)定期，之后為衰亡期。結(jié)合S.harbinensisLJ5實際用途是用于豌豆酸漿的純種發(fā)酵，為獲得高絮凝淀粉活性的豌豆酸漿，對于菌株種子液的活菌數(shù)和活力均要求較高，所以選擇對數(shù)期末期、穩(wěn)定期前期為發(fā)酵終點，最佳發(fā)酵時間為24 h。發(fā)酵24 h時菌液的活菌數(shù)為8.31±0.03 lg CFU/mL。

圖8 S.harbinensis LJ5生長曲線

2.7 S.harbinensis LJ5絮凝性質(zhì)分析

2.7.1 S.harbinensisLJ5絮凝活性物質(zhì)分布

普遍認為微生物絮凝劑分為兩類：一類微生物分泌的胞外產(chǎn)物具有絮凝作用，如發(fā)酵乳桿菌的分泌物，其胞外產(chǎn)物具有絮凝作用，而菌體本身沒有絮凝作用[20]；另一類是菌體本身具有絮凝作用，如副干酪乳桿菌副干酪亞種[21]。光學(xué)顯微鏡下觀察到加入發(fā)酵液前后豌豆淀粉顆粒的分布狀態(tài)如圖9（A和B）所示。加入發(fā)酵液前，淀粉顆粒在顯微鏡下均勻分布，加入發(fā)酵液后，眾多淀粉顆粒凝聚成大的絮凝體。如圖9（C和D）所示，通過掃描電子顯微鏡可以觀察到加入發(fā)酵液前后淀粉顆粒的變化，菌粘附在淀粉顆粒表面并且使淀粉顆粒粘結(jié)在一起，所以在絮凝淀粉過程中使淀粉顆粒凝集成大的絮凝體，正是淀粉顆粒粘結(jié)體積變大后重力的增加，從而加速淀粉的沉降。發(fā)酵液絮凝位置分析圖如圖9（E）所示。絮凝率大小順序為發(fā)酵液＞未洗滌菌懸液＞洗滌菌懸液＞上清液。其中，未洗滌菌懸液和洗滌菌懸液與發(fā)酵液的絮凝率差異較小，都具有很強的絮凝活性，可能是由于離心分離過程損失一部分的菌體細胞，使菌體細胞數(shù)量減少，導(dǎo)致絮凝活性的稍有下降。而上清液與發(fā)酵液的絮凝率差異較大，去細胞后的上清液基本不具有絮凝活性，表明S.harbinensisLJ5的絮凝活性物質(zhì)主要存在于菌體細胞本身，而不是分泌到胞外的代謝產(chǎn)物。結(jié)合光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡下S.harbinensisLJ5粘附淀粉顆粒的特性與絮凝活性物質(zhì)存在于菌體細胞本身，表明絮凝因子可能在菌體細胞的表面。

圖9 豌豆淀粉顆粒分布及絮凝位置分析圖

2.7.2 S.harbinensisLJ5絮凝活性的熱穩(wěn)定性分析

從圖10可以看出，溫度對S.harbinensisLJ5的絮凝活性影響很大，在30~40 ℃范圍內(nèi)，發(fā)酵液的絮凝活性從71.5%降至68.5%，而溫度大于50 ℃時，發(fā)酵液基本不具有絮凝活性，表明S.harbinensisLJ5發(fā)酵液的絮凝因子不具有熱穩(wěn)定性，對溫度較為敏感。

圖10 發(fā)酵液絮凝活性的熱穩(wěn)定性分析圖

2.7.3 酶處理對S.harbinensisLJ5發(fā)酵液絮凝活性的影響

由圖11可知，空白組的絮凝率最高，為71.1%。溶菌酶、胰蛋白酶與胃蛋白酶3種酶對發(fā)酵液的絮凝活性都有不同程度的抑制作用，其中胰蛋白酶和胃蛋白酶的抑制作用較大，而用纖維素酶和糖化酶作用后的絮凝率基本沒有變化，表明S.harbinensisLJ5絮凝因子可能是蛋白類物質(zhì)。結(jié)合上述試驗結(jié)果推測絮凝因子可能為菌體細胞表面的蛋白類物質(zhì)。

圖11 酶處理對發(fā)酵液絮凝活性的影響

2.7.4 金屬離子對S.harbinensisLJ5發(fā)酵液絮凝活性的影響

膠體理論表明陽離子可以和帶負電性膠體微粒的表面電荷結(jié)合，從而克服靜電排斥力使膠體顆粒脫穩(wěn)形成細小的凝聚體并與微生物絮凝劑反應(yīng)形成大絮凝團快速下沉。不同金屬陽離子對發(fā)酵液絮凝活性的影響如圖12所示。Na+、K+對發(fā)酵液的絮凝活性均有增強作用，Ca2+、Mg2+對絮凝活性也有不同程度的促進作用。其中，Na+的促進作用最強，所以可選Na+作為助凝劑。

圖12 金屬離子對發(fā)酵液絮凝活性的影響

3 結(jié)論

通過高通量測序技術(shù)分析酸漿組和沉淀淀粉組中的微生物多樣性，從中分離篩選出一株在碗豆汁培養(yǎng)基中生長穩(wěn)定且具有高絮凝淀粉活性的S.harbinensisLJ5，為豌豆酸漿接種發(fā)酵提供備選菌種。通過絮凝活性位置分析確定絮凝活性物質(zhì)主要存在于菌體細胞本身。菌株發(fā)酵液的絮凝活性受溫度影響顯著，絮凝活性在30 ℃時最高，而溫度在50 ℃以上時，發(fā)酵液就基本不具有絮凝活性，絮凝因子對溫度比較敏感。胰蛋白酶和胃蛋白酶對發(fā)酵液的抑制作用較強，說明絮凝活性物質(zhì)可能是蛋白類的物質(zhì)。Na+對發(fā)酵液的絮凝活性促進作用最強，可選Na+作為助凝劑。