黎海彬 ，羅岸峰，劉勃，潘寧，黃永春，宋賢良

1.廣東雅和生物科技有限公司（清遠(yuǎn) 530000）；2.廣西滬桂食品集團(tuán)有限公司（柳州 545000）；3.廣西科技大學(xué)（柳州 545000）；4.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)（廣州 510642）

在食品加工工業(yè)中，食品中的主要營養(yǎng)成分有蛋白質(zhì)、多糖等大分子物質(zhì)，而蛋白質(zhì)、多糖中含有美拉德（Maillard）反應(yīng)需要的羰基與氨基，同時(shí)食品原料經(jīng)過熱處理過程，食品一般就會(huì)發(fā)生Maillard反應(yīng)，結(jié)果會(huì)給食品帶來良好的色澤與風(fēng)味。在食品工業(yè)領(lǐng)域，肉類調(diào)味基料就是采用蛋白質(zhì)及其肽類物質(zhì)進(jìn)行美拉德反應(yīng)制備。通過美拉德反應(yīng)獲得的蛋白肽對食品風(fēng)味及食品的生物活性有良好作用。對于大分子蛋白質(zhì)來說，不同肽鏈的長度、肽的氨基酸組成成分和氨基酸序列甚至肽鍵的水解度都會(huì)對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的風(fēng)味和生物活性產(chǎn)生特定的影響，而特殊風(fēng)味物質(zhì)的形成、對原材料風(fēng)味的改善都可以通過特有的Maillard反應(yīng)獲得[1-3]。

通過Maillard反應(yīng)改善食品原料風(fēng)味的不足，生成特殊風(fēng)味的物質(zhì)，該技術(shù)在食品調(diào)味料的制備以及食品風(fēng)味的改善中都有很多的研究。在食品香精香料的制造以及食品調(diào)味基料的制造過程中[4-7]，為增加食品的風(fēng)味，改良食品的品質(zhì)結(jié)構(gòu)，往往通過呈味的小分子肽類物質(zhì)參加反應(yīng)，從而形成很好的色、香、味的食品。作為廣西柳州特色小吃，螺螄湯料直接影響螺螄粉的風(fēng)味及營養(yǎng)，制備具有營養(yǎng)功能螺螄粉調(diào)味湯料的研究尚未見報(bào)道[8-10]。試驗(yàn)以螺螄為主要原料，通過生物技術(shù)手段制備的小分子鮮味肽具有呈味、抗氧化、提高免疫力等功能，可被廣泛應(yīng)用于保健品、食品等營養(yǎng)與健康產(chǎn)業(yè)，以鮮味肽為主要原料開發(fā)出的螺螄粉調(diào)味湯料，既增加產(chǎn)品風(fēng)味，又具有營養(yǎng)保健功能，對螺螄粉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展起到促進(jìn)作用[11-12]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

螺螄蛋白酶解液：螺螄洗干凈，測定螺肉的主要成分；生物酶解螺螄蛋白，料液比1︰2.5（g/mL），酶解pH 6.5，酶解溫度55 ℃，酶解時(shí)間6.5 h，采用復(fù)合蛋白酶（3 000 U/g）酶解，在93 ℃下滅酶，保持6 min，離心7 min（5 700 r/min），上清液為螺螄蛋白酶解液，備用。

螺螄蛋白酶解液美拉德（Maillard）反應(yīng)物（實(shí)驗(yàn)室制備）。

鹽酸、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、氯化亞鐵、乙醇（分析純，廣東廣試試劑科技有限公司）；水楊酸、過氧化氫（分析純，廣州天一實(shí)驗(yàn)材料有限公司）；菲啰嗪、DPPH（生化試劑，廣州天普生化醫(yī)藥有限公司）；葡萄糖、木糖、果糖（均為食品級(jí)，廣東煥發(fā)生物科技有限公司）。

DL03電子分析天平（上海贊維衡器有限公司）；001D pH計(jì)（上海一恒科技有限公司）；DG18-TS高速離心機(jī)（廣州吉迪儀器有限公司）；HRD-4電熱恒溫水浴鍋（上海雅程實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；Agilent7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜儀[安捷倫科技（中國）有限公司]；TU-3200紫外分光光度計(jì)（北京普析通用實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 螺螄蛋白酶解液Maillard反應(yīng)產(chǎn)物的制備

根據(jù)影響Maillard反應(yīng)的幾個(gè)因素，在螺螄蛋白酶解液中加入相關(guān)的反應(yīng)物，用保鮮膜、牛皮紙包好密封后放入熱反應(yīng)容器中，按照設(shè)定的條件完成Maillard反應(yīng)，反應(yīng)完成后，冷卻保存。

1.2.2 Maillard反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性的研究

1.2.2.1 測定清除羥自由基的能力[13]

將2.0 mL 4.5 mmol/L乙醇-水楊酸溶液和2.0 mL 4.5 mmol/L FeSO4溶液在試管中混勻，加入2.0 mL樣品和2.0 mL 5 mmol/L H2O2溶液混勻，在38 ℃水浴25 min，蒸餾水作為對照，在520 nm波長處測定吸光度。羥自由基清除率按式（1）計(jì)算。

式中：P為羥自由基清除率，%；A0為加入蒸餾水時(shí)的吸光度；Ax為加入測試樣品后的吸光度；Ax0為未加入顯色劑時(shí)的吸光度。

1.2.2.2 分析研究Fe3+螯合的能力

測定Maillard反應(yīng)產(chǎn)物對Fe3+螯合的能力[14]。將0.2 mL 5 mmol/L菲啰嗪、0.1 mL 2 mmol/L FeCl3及3.5 mL蒸餾水與1.0 mL稀釋10倍的樣品混勻，在35 ℃水浴15 min后，在550 nm波長處測定吸光度AS。待測樣品的吸光度記為AC，1.0 mL蒸餾水作為空白對照，記為ASB。Fe3+螯合能力按式（2）計(jì)算。

式中：ASB為對照物的吸光度；AC為加入待測樣品后的吸光度；AS為加入標(biāo)準(zhǔn)樣品后的吸光度。

1.2.2.3 酶解液中DPPH自由基清除能力的分析研究

測定螺螄蛋白酶解液在Maillard反應(yīng)后產(chǎn)物對DPPH自由基清除能力[15]。將3.8 mL 0.1 mmol/L DPPH 95%乙醇溶液中加入0.2 mL樣品，混勻后35 min，在530 nm波長處測定吸光度。DPPH自由基清除率按式（3）計(jì)算。

式中：A0為空白試樣DPPH 95%乙醇溶液的吸光度；Ai為樣品與DPPH 95%乙醇溶液混合后的吸光度。

1.2.2.4 Maillard反應(yīng)產(chǎn)物的總抗氧化活性測定

測定螺螄蛋白酶解液在Maillard反應(yīng)后產(chǎn)物的總抗氧化活性[16]。在2.5 mL 1% FeCl3溶液、2.5 mL 0.02 mmol/L pH 6.6 PBS溶液中加入1.0 mL樣品，混勻，于55℃水浴15 min，加入2.5 mL 10%的三氯乙酸（TCA），混勻，從中取2.5 mL加入0.5 mL 1% FeCl3溶液與2.5 mL蒸餾水，在25 ℃下反應(yīng)15 min，在710 nm波長處測定吸光度。

1.2.3 螺螄蛋白酶解液Maillard反應(yīng)后產(chǎn)物中主要風(fēng)味物質(zhì)的分析研究

對螺螄蛋白酶解液在Maillard反應(yīng)后產(chǎn)物中主要風(fēng)味物質(zhì)采用氣質(zhì)聯(lián)用分析技術(shù)（GC-MS）[17-18]，分析測定其Maillard反應(yīng)前后的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 GC-MS分析

螺螄蛋白酶解液Maillard反應(yīng)前后，溶于醚類的揮發(fā)性物質(zhì)組分及其相對含量的試驗(yàn)結(jié)果見表1與表2。結(jié)果表明，在螺螄肉蛋白酶解中檢出29種物質(zhì)，分別是6種烷烴類物質(zhì)、3種物質(zhì)、1種物質(zhì)、4種醇類物質(zhì)、5種物質(zhì)、2種物質(zhì)和8種酸類物質(zhì)；分析試驗(yàn)結(jié)果還可以看出，螺螄蛋白酶解液在Maillard反應(yīng)后產(chǎn)物中先后檢出35種化合物，分別是3種烷烴類物質(zhì)、2種酰胺類物質(zhì)、3種吡嗪類物質(zhì)、2種酚類物質(zhì)、3種醇類物質(zhì)、5種酸類物質(zhì)、8種酮類物質(zhì)、2種酯類物質(zhì)和7種醛類物質(zhì)（見表2）。結(jié)果表明，試樣的揮發(fā)性組分大幅增加的主要原因是進(jìn)行Maillard反應(yīng)。

表1 螺螄蛋白酶解液中揮發(fā)性物質(zhì)的分析

表2 螺螺蛋白酶解液在Maillard反應(yīng)后產(chǎn)物中風(fēng)味物質(zhì)的分析

酸類化合物中苯甲酸在螺肉蛋白酶解液Maillard反應(yīng)產(chǎn)物中有較高的相對含量。有文獻(xiàn)報(bào)道，苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、纈氨酸等必需氨基酸可以經(jīng)過生物代謝產(chǎn)生芳香化合物[18-20]；苯丙氨酸的微生物降解及氧化苯甲醛都能產(chǎn)生苯甲酸。苯甲酸有相關(guān)的抗菌活性，如對各種細(xì)菌、酵母及霉菌具有明顯抗菌功能，對保質(zhì)期的延長有很大作用。閾值相對高的酸類物質(zhì)對風(fēng)味的產(chǎn)生影響不大，可是有相當(dāng)?shù)妮o助作用。吡嗪類化合物因有較低閾值，在Maillard反應(yīng)過程中，不同的還原糖及不同的pH可能影響到吡嗪類化合物的產(chǎn)生，呈現(xiàn)出螺螄特有氣味與香氣，對螺螄蛋白酶解液Maillard反應(yīng)有很大的增強(qiáng)香氣的作用。對于閾值低的醛類化合物，在螺螄蛋白酶解液Maillard反應(yīng)后，醛類化合物的含量增加，從0提高到8.15%，使酶解液產(chǎn)生很好的風(fēng)味和氣味。3-辛醇是屬于揮發(fā)性的醇類，稍帶瓜味[20]，有高含量。酯類物質(zhì)是醇類物質(zhì)與羧酸類物質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng)的產(chǎn)物，能夠?qū)β菸嚨鞍酌附庖旱南阄逗蜌馕镀鸬礁倪M(jìn)和增強(qiáng)作用，因此，能帶給食品多種香味[18]。

2.2 螺螄蛋白酶解液Maillard反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性的研究

功能性調(diào)味料是具有抗氧化活性的食品風(fēng)味配料。主要研究螺螄蛋白酶解液Maillard反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化功能活性，通過以螺螄蛋白酶解液原液與質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.56%的葡萄糖溶液作為對照物進(jìn)行研究。

2.2.1 DPPH自由基清除率的研究

波長517 nm時(shí)，DPPH自由基醇溶液有強(qiáng)的吸收，使用紫外分光光度法測定吸光度以反映褪色程度，其化學(xué)原理就是當(dāng)能清除自由基的物質(zhì)存在于溶液中時(shí)，溶液的顏色會(huì)慢慢褪去，可以反映出DPPH自由基的清除能力。圖1是螺螄蛋白酶解液在Maillard反應(yīng)前、螺螄蛋白酶解液在Maillard反應(yīng)后及1.56%的葡萄糖溶液經(jīng)過幾種倍數(shù)的稀釋對DPPH自由基清除能力的結(jié)果。從圖1可以看出，這幾種試樣對DPPH自由基清除率會(huì)隨著螺螄蛋白酶解液原液稀釋倍數(shù)的提高而慢慢減少，螺螄蛋白酶解液在Maillard反應(yīng)前對DPPH自由基清除能力較小，其清除率為37.50%，而1.56%的葡萄糖溶液對DPPH自由基清除能力比前者大，其清除率為50.50%，但是螺螄蛋白酶解Maillard反應(yīng)液的最大DPPH自由基清除率是81.50%。試驗(yàn)結(jié)果說明，螺螄蛋白酶解液經(jīng)Maillard反應(yīng)后，可對DPPH自由基有較大清除能力。

圖1 DPPH自由基清除率與稀釋倍數(shù)的關(guān)系

2.2.2 Fe3+螯合能力的分析研究

一般情況下，有金屬螯合能力的物質(zhì)會(huì)有某些特定的抗氧化活性，主要因?yàn)樗鼈冇蠪enton反應(yīng)的產(chǎn)生，而在金屬離子被螯合時(shí)會(huì)對產(chǎn)生自由基的反應(yīng)有一定限制。化學(xué)反應(yīng)的原理是：絡(luò)合反應(yīng)會(huì)在Fe3+與菲洛嗪試劑中產(chǎn)生，該反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生有色物質(zhì)而幫助分析物質(zhì)的變化情況，化合物只要和Fe3+螯合完全，溶液的吸光度就發(fā)生改變，要反映待測物質(zhì)與Fe3+螯合能力的程度，可使用紫外分光光度法測定溶液的吸光度，采用吸光度的數(shù)據(jù)測定Fe3+螯合能力的大小。螺螄蛋白酶解液在Maillard反應(yīng)前、螺螄蛋白酶解液在Maillard反應(yīng)后及1.56%的葡萄糖溶液經(jīng)過幾種倍數(shù)的稀釋對Fe3+螯合能力的大小結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，螺螄蛋白酶解原液和螺螄蛋白美拉德反應(yīng)液對Fe3+螯合能力的大小隨著稀釋倍數(shù)的增加而不斷減小，螺螄蛋白酶解液在Maillard反應(yīng)前對Fe3+螯合能力較小，其峰值是20.02%，螺螄蛋白酶解液在Maillard反應(yīng)后對Fe3+螯合能力較大，其峰值是45.03%。這說明對金屬的螯合能力，可通過設(shè)計(jì)特定的Maillard反應(yīng)來提高其對金屬的螯合能力，同時(shí)也使其抗氧化功能活性提高。

圖2 Fe3+離子螯合能力與倍數(shù)稀釋的關(guān)系

2.2.3 總抗氧化活性的分析研究

評(píng)價(jià)溶液中抗氧化能力，主要是考察其總抗氧化活性，包括系統(tǒng)中的酶類和非酶類物質(zhì)的抗氧化功能的疊加[19-20]。圖3是螺螄蛋白酶解液在Maillard反應(yīng)前、螺螄蛋白酶解液在Maillard反應(yīng)后及1.56%的葡萄糖溶液經(jīng)過幾種倍數(shù)的稀釋總抗氧化功能活性的分析研究結(jié)果。結(jié)果表明，螺螄蛋白酶解液在Maillard反應(yīng)前、螺螄蛋白酶解液在Maillard反應(yīng)后及1.56%的葡萄糖溶液經(jīng)過幾種倍數(shù)的稀釋這幾種溶液都擁有某些特定的功能活性，螺螄蛋白酶解液在Maillard反應(yīng)后的抗氧化功能活性峰值是0.751，可能是含硫、氮之類的物質(zhì)在一定的溫度下形成的緣故。

2.2.4 對羥自由基清除能力的分析研究

能夠生成穩(wěn)定的化合物同時(shí)停止其自身的氧化反應(yīng)的是一些擁有清除羥自由基能力的化合物[20]。圖4是螺螄蛋白酶解液在Maillard反應(yīng)前、螺螄蛋白酶解液在Maillard反應(yīng)后及1.56%的葡萄糖溶液經(jīng)過幾種倍數(shù)的稀釋對羥自由基清除率的分析研究結(jié)果。結(jié)果表明，螺螄蛋白Maillard反應(yīng)液對羥自由基清除率的峰值是76.01%，螺螄蛋白酶解原液及1.56%葡萄糖溶液對羥自由基的清除率的峰值分別是29.01%和54.50%，這可能與能提供氫質(zhì)子的物質(zhì)在螺螄蛋白酶解液中的數(shù)量極少有一定關(guān)系。

圖4 羥自由基清除率與稀釋倍數(shù)的關(guān)系

3 結(jié)論

使用GC-MS對Maillard反應(yīng)產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析和研究，結(jié)果表明，具有揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的酶解液，其主要成分和含量在Maillard反應(yīng)前后會(huì)有很大不同。特別是產(chǎn)生多種對風(fēng)味有很大影響的有機(jī)化合物，如醛類、吡嗪、酮類及酯類化合物，分析檢測出35種化合物是通過螺肉蛋白Maillard反應(yīng)產(chǎn)生的。

螺螄蛋白Maillard反應(yīng)液具有一定抗氧化功能活性，選用最佳工藝條件下制得的Maillard反應(yīng)液作為研究對象，結(jié)果表明：螺螄蛋白酶解液在Maillard反應(yīng)后的產(chǎn)物對羥自由基的清除率的峰值是76.01%，對DPPH自由基清除率的峰值是81.50%，對Fe3+的螯合能力的峰值是50.01%，說明擁有強(qiáng)抗氧化功能活性的是螺螄蛋白酶解液在Maillard反應(yīng)后的產(chǎn)物，Maillard反應(yīng)后的產(chǎn)物總抗氧化功能活性最強(qiáng)，反應(yīng)產(chǎn)物吸光度的峰值是0.751，顯著超過對照組。