張豪 ，肖盼盼，古敏晴，李飛飛，何益峰，李文保

1.深圳市華大海洋生物醫(yī)藥技術(shù)研究院（深圳 518000）；2.深圳華大海洋科技有限公司（深圳 518000）

生活節(jié)奏的加快和生活壓力的變大，導(dǎo)致生活規(guī)律和飲食結(jié)構(gòu)的改變，一方面高糖、高蛋白、高熱量食物攝取過(guò)多，另一方面膳食纖維等促進(jìn)腸道蠕動(dòng)的食物攝入量減少，導(dǎo)致便秘在日常生活中較為頻繁地出現(xiàn)。其臨床的表現(xiàn)為大便干結(jié)、排便艱難、排便時(shí)間延長(zhǎng)等主要癥狀[1]。長(zhǎng)期服用藥物治療便秘會(huì)產(chǎn)生一定的依賴(lài)性和副作用，便秘人群也對(duì)藥物的治療方法心存擔(dān)憂(yōu)[2]。因此研發(fā)出具有潤(rùn)腸通便功能的創(chuàng)新型功能性食品越來(lái)越受到關(guān)注。

人體內(nèi)有多種自由基，尤以氧自由基最多，自由基與人類(lèi)的衰老和許多疾病相關(guān)[3]，近年來(lái)越來(lái)越多的學(xué)者將目光投入海洋天然抗氧化活性物質(zhì)的研究中，相關(guān)研究報(bào)道較多，結(jié)果也證實(shí)多種海洋生物中提取的多肽物質(zhì)具有體內(nèi)外抗氧化活性[4-9]，并顯示較好應(yīng)用前景。

探究不同因素對(duì)復(fù)合水果酵素感官的影響，優(yōu)化復(fù)合水果酵素工藝配方，并檢測(cè)其體外抗氧化活性和體內(nèi)對(duì)便秘小鼠的便秘改善情況，旨在研發(fā)一款安全性高，抗氧化性較強(qiáng)，同時(shí)能夠有效緩解便秘的復(fù)合水果酵素飲料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

復(fù)合水果酵素[晶葉（青島）生物科技有限公司]；鹽酸洛哌丁胺（規(guī)格2 mg×6粒，西安楊森制藥有限公司）；阿拉伯樹(shù)膠粉、活性炭粉（北京寶瑞杰科技有限公司）；市售酵素競(jìng)品1和2（購(gòu)自于網(wǎng)絡(luò)購(gòu)物平臺(tái)）。

1.2 儀器與設(shè)備

AUW120D型電子天平[島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司]；DHG-914A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；Varioskan LUX全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)賽默飛世爾科技）；DHS-16A電子水分測(cè)定儀（寧波市鄞州華豐電子儀器廠(chǎng)）。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性ICR小鼠120只（18.0~22.0 g，遼寧長(zhǎng)生生物科技股份有限公司）。SPF級(jí)動(dòng)物房，溫度25±2 ℃，濕度40%~70%。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 工藝流程

原料預(yù)處理→水果酵素原液稀釋→加入適量糖醇→加入適量魚(yú)皮膠原肽粉→混勻→殺菌→灌裝→成品1.4.2 優(yōu)化試驗(yàn)

1.4.2.1 單因素試驗(yàn)

以水果酵素添加量（50%，60%，70%，80%和90%）、糖醇添加量（11.5%，15.0%，18.5%，22.0%和25.5%）、魚(yú)皮膠原蛋白肽粉添加量（0.5%，1.0%，1.5%，2.0%和2.5%）為主要影響因素，探究其對(duì)產(chǎn)品感官品質(zhì)得分的影響。

1.4.2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以水果酵素添加量、糖醇添加量、魚(yú)皮膠原蛋白肽粉添加量為自變量，以感官評(píng)分為指標(biāo)，進(jìn)行配方優(yōu)化，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，確定最佳工藝配方。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表 單位：%

1.4.2.3 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

參考劉旺等[10]的方法對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行感官評(píng)定，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)表

1.4.3 體外抗氧化活性測(cè)定

參考張瑞剛等[11]、曹明原等[12]的方法檢測(cè)復(fù)合水果酵素的體外抗氧化活性。

1.4.4 動(dòng)物飼養(yǎng)與分組

將試驗(yàn)雄性ICR小鼠飼養(yǎng)在安靜、清潔、通風(fēng)的環(huán)境（溫度25±2 ℃；濕度40%~70%）中，確保小鼠自由飲水、進(jìn)食和正?；顒?dòng)及睡眠。將小鼠按其質(zhì)量隨機(jī)分為5組（空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組），每組10只。劑量組分為低劑量組、中劑量組和高劑量組，綜合復(fù)合水果酵素每天按8.3，16.6和25.0 mL/kg，模型對(duì)照組和空白對(duì)照組給與蒸餾水，連續(xù)灌胃15 d后，觀(guān)察小鼠的體重變化、小腸推進(jìn)試驗(yàn)和排便試驗(yàn)。

1.4.5 小鼠小腸推進(jìn)試驗(yàn)

配制墨汁[13]：準(zhǔn)確稱(chēng)取100 g阿拉伯樹(shù)膠，加800 mL水，煮沸至溶液透明，稱(chēng)取50 g活性碳（粉狀）至上述溶液中煮沸3次，待溶液冷卻后加水定容至1 000 mL，于4 ℃冰箱保存，用前搖勻。

小鼠經(jīng)過(guò)按不同劑量連續(xù)灌胃15 d后，將小鼠禁食不限制水飼喂16 h，各組經(jīng)口灌胃5 mg/（kg·bw）鹽酸洛哌丁胺，建模0.5 h后將5組試驗(yàn)小鼠分別灌胃2 mL/（kg·bw）墨汁，25 min后脫頸椎處死小鼠，打開(kāi)腹腔分離腸系膜，剪取上端自幽門(mén)、下端至回盲部的腸管，置于托盤(pán)上，輕輕將小腸拉成直線(xiàn)，測(cè)量腸管長(zhǎng)度為“小腸總長(zhǎng)度”，從幽門(mén)至墨汁前沿為“墨汁推進(jìn)長(zhǎng)度”。按式（1）計(jì)算墨汁推進(jìn)率。

1.4.6 小鼠排便試驗(yàn)

同1.4.5中構(gòu)建小鼠便秘模型、同等灌胃劑量。5組小鼠經(jīng)墨汁灌胃后，正常飲水，記錄每只小鼠首次排出黑便時(shí)間和每組小鼠在5 h內(nèi)黑便排出粒數(shù)和質(zhì)量。

1.4.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用雙尾t-檢驗(yàn)，其中P＜0.05代表有顯著性差異，P＜0.01和P＜0.001代表有極顯著性差異。選用Graphpad Prism 6軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 水果酵素添加量對(duì)感官評(píng)分的影響

水果酵素作為最主要的原料之一，其對(duì)飲料感官評(píng)分的影響如圖1所示。隨著添加量的增加，感官評(píng)分呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，其最適添加量為80%。

圖1 水果酵素添加量對(duì)感官評(píng)分的影響

2.1.2 糖醇添加量對(duì)感官評(píng)分的影響

糖醇被越來(lái)越廣泛用于食品中[14]。水果酵素本身具有一定的甜度，因此糖醇對(duì)產(chǎn)品的感官評(píng)分有較大影響，甜度影響尤為明顯。圖2表明，糖醇添加量18.5%時(shí)，口感最好，因此其最適添加量為18.5%。

2.1.3 魚(yú)皮膠原蛋白肽粉添加量對(duì)感官評(píng)分的影響

魚(yú)皮膠原蛋白肽，因其分子量小，溶解性好，易被人體腸道吸收，被廣泛用于保健食品中[15-16]。圖3顯示，魚(yú)皮膠原蛋白肽粉最適添加量為1.0%。

圖3 魚(yú)皮膠原蛋白肽粉添加量對(duì)感官評(píng)分的影響

2.2 配方優(yōu)化

2.2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以水果酵素添加量、糖醇添加量和魚(yú)皮膠原蛋白肽粉添加量3個(gè)因素進(jìn)行L9(33)正交優(yōu)化試驗(yàn)，以感官評(píng)分為主要測(cè)試指標(biāo)，確定復(fù)合水果酵素最佳配方工藝。由表3的試驗(yàn)結(jié)果可知，3個(gè)因素對(duì)感官評(píng)分影響的主次順序?yàn)锳＞C＞B，即水果酵素添加量＞魚(yú)皮膠原蛋白肽粉添加量＞糖醇添加量。此外，初步判斷試驗(yàn)最優(yōu)組合為A2B1C2，即水果酵素添加量80%、糖醇添加量18.5%、魚(yú)皮膠原蛋白肽粉添加量1.0%。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.3 復(fù)合水果酵素體外抗氧化試驗(yàn)

將酵素原液計(jì)為100 mg/mL對(duì)其進(jìn)行體外抗氧化活性檢測(cè)。

2.3.1 清除DPPH自由基試驗(yàn)結(jié)果

DPPH是一類(lèi)非常穩(wěn)定存在的自由基，在517 nm時(shí)有最大吸收，且濃度與吸光度呈線(xiàn)性相關(guān)?？寡趸瘎?duì)自由基的清除能力以IC50評(píng)價(jià)，IC50值越小，清除力越強(qiáng)[17]。如圖4所示，其與復(fù)合水果酵素濃度能很好地反映線(xiàn)性關(guān)系，由此，得出復(fù)合水果酵素清除DPPH自由基的公式：Y=663.98X+28.368，其中R2=0.993。經(jīng)擬合計(jì)算，復(fù)合水果酵素50%自由基清除率對(duì)應(yīng)的稀釋比例（IC50）為1/3 030.3。

圖4 復(fù)合水果酵素清除DPPH自由基結(jié)果

2.3.2 清除ABTS自由基試驗(yàn)結(jié)果

ABTS自由基是一種穩(wěn)定存在的自由基，其清除能力是評(píng)價(jià)親水性和親脂性物質(zhì)的抗氧化能力的指標(biāo)之一[18]。如圖5所示，其與復(fù)合水果酵素濃度都能很好地反映線(xiàn)性關(guān)系，由此，得出復(fù)合水果酵素清除ABTS自由基的公式：Y=224.51X+3.151，其中R2=0.997。經(jīng)擬合計(jì)算，復(fù)合水果酵素50%自由基清除率對(duì)應(yīng)的稀釋比例（IC50）為1/476.2。

圖5 復(fù)合水果酵素清除ABTS自由基結(jié)果

2.3.3 清除超氧化陰離子自由基試驗(yàn)結(jié)果

超氧陰離子自由基是活性氧自由基的一種，而且是單線(xiàn)態(tài)氧還原的第一個(gè)產(chǎn)物，可以促進(jìn)多種氧自由基的形成，可以誘導(dǎo)脂類(lèi)、蛋白質(zhì)、核酸等的氧化損傷[19]。如圖6所示，雖然隨著酵素濃度的不斷增大，超氧化陰離子自由基清除率也逐漸增大，但是兩者并沒(méi)有呈現(xiàn)線(xiàn)性關(guān)系。經(jīng)計(jì)算，復(fù)合水果酵素50%自由基清除率對(duì)應(yīng)的稀釋比例（IC50）為1/28.90。

圖6 復(fù)合水果酵素清除超氧化陰離子自由基結(jié)果

2.4 體內(nèi)小鼠試驗(yàn)

2.4.1 小鼠墨汁推進(jìn)率試驗(yàn)中體重的變化

為確定服用復(fù)合水果酵素飲料的安全性，測(cè)定其對(duì)小鼠體重的影響。小鼠小腸墨汁推進(jìn)率試驗(yàn)過(guò)程中體重的變化如表4所示。各組間小鼠體重變化無(wú)顯著差異（P＞0.05），整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中小鼠飲食飲水正常，活動(dòng)良好，無(wú)嘔吐、腹瀉、嗜睡等不良反應(yīng)，體重出現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)，說(shuō)明復(fù)合水果酵素飲料對(duì)小鼠體重?zé)o明顯影響。

表4 小鼠小腸運(yùn)動(dòng)中體重變化

2.4.2 小鼠排便試驗(yàn)中小鼠體重變化

小鼠糞便試驗(yàn)中體重變化如表5所示。各組間小鼠體重變化無(wú)顯著差異（P＞0.05），整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中小鼠飲食飲水正常，活動(dòng)良好，無(wú)嘔吐、腹瀉、嗜睡等不良反應(yīng)，體重出現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)，說(shuō)明復(fù)合水果酵素飲料對(duì)小鼠體重?zé)o明顯影響。2.4.3 小鼠墨汁推進(jìn)率試驗(yàn)結(jié)果

表5 小鼠排便試驗(yàn)中體重變化

為探究復(fù)合水果酵素飲料潤(rùn)腸通便功效，通過(guò)測(cè)定小鼠服用不同劑量酵素后小腸內(nèi)墨汁推進(jìn)率，結(jié)果如表6所示。模型對(duì)照組的墨汁推進(jìn)率為34.82%，顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.001），說(shuō)明構(gòu)建小鼠便秘模型成功[20]。

表6 小鼠墨汁推進(jìn)率試驗(yàn)結(jié)果

小鼠墨汁推進(jìn)率試驗(yàn)結(jié)果表明：低劑量組、中劑量組和高劑量組對(duì)比模型對(duì)照組，墨汁推進(jìn)率均有所提升，服用劑量越高，墨汁推進(jìn)率越高，服用高劑量的小鼠墨汁推進(jìn)率達(dá)71.95%，顯著（P＜0.001）縮短糞便在腸道內(nèi)滯留時(shí)間。分析其發(fā)揮作用的主要功效因子可能是飲品中含有低聚糖和水溶性膳食纖維，低聚糖被有益菌發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸如丁酸等，降低腸道pH，促進(jìn)腸道蠕動(dòng)[21]，同時(shí)水溶性膳食纖維可縮短內(nèi)容物（糞便）通過(guò)腸道的時(shí)間，降低結(jié)腸的壓力，減少腸內(nèi)有害物質(zhì)和腸壁接觸的時(shí)間，促進(jìn)腸道運(yùn)動(dòng)[22]。

2.4.4 小鼠排便試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)小鼠墨汁灌胃試驗(yàn)，通過(guò)測(cè)定首粒黑便排出時(shí)間和5 h內(nèi)排便粒數(shù)來(lái)探究小鼠服用復(fù)合水果酵素飲料的潤(rùn)腸通便作用，試驗(yàn)結(jié)果如表7所示。小鼠首粒黑便排出時(shí)間和5 h內(nèi)排黑便粒數(shù)的空白對(duì)照組和模型對(duì)照組存在顯著差異（P＜0.05），小鼠便秘試驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆?gòu)建成功。

表7 小鼠排便試驗(yàn)結(jié)果

小鼠排便試驗(yàn)結(jié)果顯示：低劑量組與模型對(duì)照組相比，首粒排黑便時(shí)間明顯縮短（P＜0.05），黑便粒數(shù)顯著增多（P＜0.01），黑便質(zhì)量明顯增加（P＜0.01），表明該飲料在給予低劑量時(shí)就能明顯縮短首粒排黑便時(shí)間，并增加黑便粒數(shù)及黑便質(zhì)量，具有促排便作用。中劑量組、高劑量組與模型對(duì)照組比較，首粒排黑便時(shí)間、糞便粒數(shù)及糞便質(zhì)量結(jié)果無(wú)顯著差異性，可能由于其服用劑量過(guò)大，超出小鼠的適宜服用量，造成小鼠有飽腹感，胃腸道蠕動(dòng)減弱，導(dǎo)致代謝減緩[23]。

2.4.5 復(fù)合水果酵素飲料與市售競(jìng)品對(duì)比小鼠墨汁推進(jìn)率試驗(yàn)結(jié)果

表8顯示新型復(fù)合水果酵素與目前在售的酵素產(chǎn)品在潤(rùn)腸通便功效作用的對(duì)比。與對(duì)照組相比，模型組墨汁推進(jìn)率顯著降低（P＜0.001），說(shuō)明小鼠便秘模型構(gòu)建成功。與模型對(duì)照組相比，復(fù)合水果酵素飲料組、競(jìng)品酵素1組、競(jìng)品酵素2組小鼠的墨汁推進(jìn)率均高于模型組（分別是P＜0.001，P＜0.01和P＜0.05）。說(shuō)明3組產(chǎn)品均可發(fā)揮潤(rùn)腸通便作用，同時(shí)復(fù)合水果酵素組小鼠的墨汁推進(jìn)率顯著高于競(jìng)品酵素1組和競(jìng)品酵素2組小鼠（分別是P＜0.05和P＜0.01）。結(jié)果表明新型復(fù)合水果酵素產(chǎn)品的促小腸蠕動(dòng)效果顯著好于其他2款市售競(jìng)品酵素。

表8 與市售酵素競(jìng)品對(duì)比小鼠墨汁推進(jìn)率試驗(yàn)結(jié)果

2.4.6 復(fù)合水果酵素飲料與市售競(jìng)品對(duì)比小鼠排便試驗(yàn)結(jié)果

從表9試驗(yàn)結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，模型組首粒黑便時(shí)間顯著上升（P＜0.001），黑便粒數(shù)和黑便質(zhì)量顯著降低（分別是P＜0.05和P＜0.01），說(shuō)明使用小鼠便秘模型構(gòu)建成功。與模型對(duì)照組相比，復(fù)合水果酵素組、競(jìng)品酵素1組、競(jìng)品酵素2組小鼠的首粒黑便時(shí)間均低于模型組（分別是P＜0.001，P＜0.05和P＜0.05）。并且復(fù)合水果酵素組小鼠的首粒黑便時(shí)間顯著低于競(jìng)品酵素1組和競(jìng)品酵素2組小鼠（均為P＜0.05）；與模型組相比，復(fù)合水果酵素組的黑便粒數(shù)高于模型組（P＜0.05）。復(fù)合水果酵素組小鼠的黑便粒數(shù)顯著高于競(jìng)品酵素2組小鼠（P＜0.05）。在黑便質(zhì)量指標(biāo)上，復(fù)合水果酵素組小鼠的黑便質(zhì)量顯著高于競(jìng)品酵素1組和競(jìng)品酵素2組（分別是P＜0.05和P＜0.05）。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明復(fù)合水果酵素產(chǎn)品的促排便效果顯著好于其他2款市售競(jìng)品酵素。

表9 與市售酵素競(jìng)品對(duì)比小鼠排便試驗(yàn)結(jié)果

2.5 產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)及質(zhì)量檢測(cè)

對(duì)研發(fā)的復(fù)合水果酵素飲料進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)及質(zhì)量檢測(cè)，結(jié)果顯示（表10），各項(xiàng)營(yíng)養(yǎng)測(cè)試及理化參數(shù)指標(biāo)均符合國(guó)家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求，是一款價(jià)值較高的安全產(chǎn)品。

表10 產(chǎn)品檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

試驗(yàn)以水果酵素、魚(yú)皮膠原蛋白肽等為主要原料，研制一款復(fù)合水果酵素飲料，通過(guò)單因素影響及正交試驗(yàn)確定最佳配方：水果酵素添加量80.0%、糖醇添加量18.5%、魚(yú)皮膠原蛋白肽粉添加量1%。以該比例調(diào)制的復(fù)合水果酵素飲料顏色均勻、有光澤，酸甜適口，無(wú)澀味，無(wú)任何雜質(zhì)和沉淀、懸浮物，且各項(xiàng)指標(biāo)均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的保健食品?；钚栽囼?yàn)表明，該飲料具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性，且對(duì)便秘小鼠具有潤(rùn)腸通便的功效，并且其活性?xún)?yōu)于目前在售的2款同類(lèi)酵素產(chǎn)品，具有廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景。