劉麗美 ，嚴馨，張雨迪，李楊，唐志國

1.綏化學院 食品與制藥工程學院（綏化 152061）；2.哈爾濱學院 食品工程學院（哈爾濱 150086）

微乳液因其特殊的低界面張力而在各個領域得到廣泛應用，被認為是穩(wěn)定性好、透明度高的熱力學穩(wěn)定體系[1]。微乳液體系在功能性油脂中的應用已有充足的理論支撐[2-5]。市面上的微乳液制品大多以植物油作為油相載體，而動物油脂因大多是長鏈脂肪酸，相對分子量較大，在制備動物油脂微乳液過程中會使用大量的表面活性劑，且適用于食品的表面活性劑在種類、用量等方面也有著嚴格的要求[6]，此外，微乳液不易稀釋，若加水量增大時會出現(xiàn)破乳現(xiàn)象[7]，使得在食品中的應用受到限制而較少研究。

動物油脂在人類膳食中占有重要的地位。豬油可通過甘油解反應得到主要成分甘油二酯（Diacylglycerol，DAG），含量可高達58%[8]。同時DAG也是食用油的天然成分[9]，人體脂肪代謝的內源中間產物，含量甚微，一般不到10%[10]，美國FDA認定其為“一般公認安全”物質[11]。DAG極性比甘油三酯強，易被乳化而利于消化，近年來發(fā)現(xiàn)DAG作為一種多功能食品添加劑，不僅在口感、外觀等方面與植物油有相似的性狀，而且DAG具有減少內臟脂肪含量、抑制體重增加、降低血脂含量的作用[12]。此試驗采取反相微乳液法制備含甘油二酯的微乳液，使豬油得到充分的利用，探尋動物油微乳液的適宜形式，為解決生物活性易氧化、穩(wěn)定性差問題做出嘗試。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬油（實驗室自制）；Lipozyme RM IM脂肪酶[丹麥諾維信（Novozymes）]；脂肪酶RM IM（北京諾維信生物技術有限公司）；吐溫80（分析純）、次甲基蘭（天津市瑞金特化學品有限公司）；吐溫20、葡萄糖、丙三醇、異丙醇（均為分析純，天津市濱?？频匣瘜W試劑有限公司）；酪蛋白酸鈉、大豆卵磷脂、果糖、山梨醇、磷酸氫二鈉（均為分析純，天津市光復精細化工研究所）；正己烷（分析純，天津市致遠化學試劑有限公司）。

1.2 儀器與設備

KQ-200VDE雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DDS-12A數(shù)字電導率儀（上海鵬順科學儀器有限公司）；XH-C漩渦混合器（金壇市白塔新寶儀器廠）；THZ-82A水浴恒溫振蕩器（常州潤華電器有限公司）；80-2B臺式低速離心機（湖南星科科學儀器有限公司）；PHS-25酸度計（上海雷磁儀器廠）；ZS90 Zeta電位及納米粒度分析儀（英國馬爾文公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 豬油甘油二酯的制備

豬背部脂肪在100~120 ℃的溫度下加熱析出豬油。參考Diao等[13]的方法，將豬油與甘油按1∶1摩爾比混合，在真空度-50 kPa、溫度82 ℃條件下旋轉蒸發(fā)30 min。而后取出混合物，加入豬油質量14%的脂肪酶Lipozyme RM IM，在磁力攪拌速度500 r/min，65 ℃反應2 h后，將溫度調到45 ℃反應8 h，得到豬油甘油二酯。

1.3.2 豬油甘油二酯W/O微乳體系的構建

1.3.2.1 乳化劑種類的選擇

豬油甘油二酯與乳化劑按質量比2∶1配制一系列的乳化液母液，量取一定去離子水，與復配表面活性劑的油相磁力攪拌分散0.5 h，得到微乳液。選取乳化劑大豆卵磷脂、吐溫20、吐溫80、酪蛋白酸鈉，記錄最大增容水量和外觀。

1.3.2.2 乳化劑添加量的選擇

固定油相和乳化劑的質量之和，按質量比3∶7，4∶6，5∶5，6∶4和7∶3分別稱取油與表面活性劑，用磁力攪拌器混勻每組混合物，記錄最大增容水量。

1.3.2.3 助乳劑的選擇

在微乳液的形成過程中添加一些小分子的醇、糖等助表面活性劑，可以使形成的微乳液穩(wěn)定性更好，同時也會促進乳化劑的乳化效果，能使油和水更好地混溶。固定油相和乳化劑的最佳配比，添加助乳劑（果糖、蔗糖、山梨醇、丙三醇和葡萄糖）制備微乳液，乳化劑與助乳劑質量比為1∶1，記錄最大增容水量和外觀。

1.3.2.4 助乳劑添加量的選擇

固定油相、乳化劑和助乳劑的質量之和4.0 g，油相與乳化劑按上述最佳比例混合后與助乳劑以質量比3∶7，4∶6，5∶5，6∶4和7∶3再混合，記錄最大增容水量。

1.3.2.5 不同制備溫度的影響

其他條件最優(yōu)時，在制備溫度30，40，50，60和70 ℃條件下觀察微乳液形成的狀態(tài)和最大增容水量。

1.3.2.6 制備方法的影響

制備方法不同，作用效果不同，觀察漩渦振蕩、磁力攪拌、超聲波和水浴振蕩四種方法對微乳液形成的影響。

1.3.3 微乳液類型的測定

采用染色法和電導率法鑒別微乳液的類型[14]。

1) 染色法：微乳液可利用次甲基蘭、蘇丹Ⅲ進行染色，取染色均勻的一滴于40×10倍的電子顯微鏡下觀察。次甲基蘭易溶于水，為水溶性染料，可利用其在水中分布的特點，根據微乳液中藍色的分布和擴散速度來判斷微乳液類型。

2) 電導率法：采用電導率儀測定最大增容水量，以確定水相最大添加量及乳化劑的使用情況。向甘油二酯混合液中加入一定蒸餾水，在磁力攪拌器作用下變澄清透明，測定該微乳液的電導率，重復以上操作，直至測到微乳液的電導率發(fā)生變化，微乳液由澄清變?yōu)闇啙?，此時的添加水量即該乳化液的最大增容水量。

1.3.4 微乳液粒徑大小與分布

采用Zeta電位及納米粒度分析儀對微乳液的液滴尺寸和分散性進行評價。

1.3.5 穩(wěn)定性的測定

1.3.5.1 離心穩(wěn)定性

準確稱取5份4.0 g豬油甘油二酯微乳液，分別在3 000，4 000，5 000和6 000 r/min轉速下離心30 min，在550 nm波長下測透光率，并描述其外觀變化情況。

1.3.5.2 鹽度穩(wěn)定性

在制備豬油甘油二酯微乳液時，分別用0.1，0.15和0.2 mol/L的NaCl、KCl和CaCl2水溶液代替去離子水，用4 000 r/min的離心機離心5 min，觀察是否出現(xiàn)凝固分層現(xiàn)象，及550 nm波長下的透光率。

1.3.5.3 pH穩(wěn)定性

用磷酸氫二鈉和檸檬酸配制pH為3，4，5，6和7的緩沖液，用緩沖液代替去離子水進行微乳液的制備，在550 nm波長下分別測微乳液的透光率并進行外觀變化的描述。

1.3.6 統(tǒng)計分析

每個試驗重復3次，結果用均值±標準偏差表示。數(shù)據之間的差異顯著性（P＜0.05）分析采用Statistix 8.1軟件進行，作圖采用Excel 2010軟件。

2 結果與分析

2.1 豬油甘油二酯W/O微乳體系的構建結果

2.1.1 乳化劑種類的選擇

乳化劑的種類與結構對微乳液的形成和性質具有很大的影響[15]，通過觀察最大增容水量可以看出微乳液和水混溶的程度，從而看出微乳液的穩(wěn)定性，不同乳化劑對微乳液最大增容水量的影響見圖1。

圖1 不同乳化劑對微乳液最大增容水量的影響

由圖1可知，微乳液最大增容水量的順序為吐溫80＞吐溫20＞酪蛋白酸鈉＞大豆卵磷脂。外觀方面，與吐溫20、大豆卵磷脂及酪蛋白酸鈉相比，吐溫80形成的微乳液較為清亮透明，流動性較好，穩(wěn)定性強，不容易凝固分層，最大增容水量為1.4 mL，乳化效果最好。

2.1.2 乳化劑添加量的選擇

由圖2可知，乳化劑的添加量對形成的微乳液的穩(wěn)定性影響較大，最大增容水量的順序為3∶7＞4∶6＞5∶5＞6∶4＞7∶3，當油相與乳化劑質量比為3∶7時，微乳液的穩(wěn)定性好，外觀表現(xiàn)為澄清透亮，流動性強，最大增容水量為1.4 mL。高含量的表面活性劑可提高由表面活性劑形成的界面膜的彈性和流動性，從而更有利于微乳的形成[16]。劉欣[17]研究表明，表面活性劑與玫瑰精油的質量比為6∶1時，形成的微乳液粒徑較小，較為穩(wěn)定。

圖2 乳化劑添加量對微乳液最大增容水量的影響

2.1.3 助乳劑的選擇

由圖3可知，不同助乳化劑對微乳液外觀的作用效果有很大的差異，丙三醇作為助乳化劑時乳化效果最好，形成的微乳液澄清透亮，流動性好，穩(wěn)定性好，不易發(fā)生凝固和分層等現(xiàn)象，最大增容水量為2.2 mL。丙三醇作為助乳化劑作用于乳化劑的分子之間，使乳化劑的界面張力下降[17]，使微乳液的流動性增加。而其他助乳化劑果糖、葡萄糖、山梨醇、蔗糖形成的微乳液澄清透亮，黏稠，流動性差，穩(wěn)定性差，放置易發(fā)生分層凝固等現(xiàn)象，不能較好地形成微乳液。

圖3 不同助乳化劑對微乳液最大增容水量的影響

2.1.4 助乳劑添加量的選擇

由圖4可知，油相/乳化劑混合物與助乳劑的質量比為6∶4時，形成的微乳液穩(wěn)定性好，此時的外觀表現(xiàn)為微乳液澄清透亮，流動性強，穩(wěn)定性好，最大增容水量為1.8 mL。

圖4 助乳劑添加量對微乳液最大增容水量的影響

2.1.5 不同制備溫度的影響

行業(yè)雖然面臨諸多的挑戰(zhàn)，但有利因素同樣很多。從國內因素看，過去一年，國內經濟實現(xiàn)了增速回升，經濟運行質量也好于預期。從國外因素來看，2017年，全球經濟呈現(xiàn)所有地區(qū)“高度同步”的增長，積極因素越來越多，全球經濟將進入新一輪復蘇和增長周期。因此，我們有理由對宏觀經濟環(huán)境和我國磷復肥行業(yè)的發(fā)展充滿信心。

一般情況下，溫度可以影響表面活性劑的極性，影響形成界面張力的能力，影響其形成微乳液的能力[17]，在不同的溫度下，乳化劑、油相和水相的滲透作用不同，通常隨著溫度的升高，相互之間的滲透作用會增強，有利于微乳液的形成，同時油水之間的表面張力降低，油溶性增大，所以油溶能力增大。不同制備溫度對微乳液最大增容水量的影響見圖5。

圖5 制備溫度對微乳液最大增容水量的影響

由圖5可知，形成穩(wěn)定微乳液的適合溫度為60 ℃，此時外觀表現(xiàn)為流動性好，澄清透明，穩(wěn)定性好，最大增容水量為3.0 mL。溫度過高或過低都會對微乳液的穩(wěn)定性產生影響，溫度對表面活性劑的溶解能力影響較大[18]。

2.1.6 制備方法對微乳液形成的影響

由圖6可知，制備方法為磁力攪拌時，形成的微乳液穩(wěn)定性好，同時該方式結合適當?shù)臏囟?，制備得到的微乳液外觀流動性好，澄清透亮，最大增容水量為2.4 mL。

圖6 不同制備方法對微乳液最大增容水量的影響

2.1.7 正交試驗結果

以最大增容水量和外觀為指標，考察不同的乳化劑、助乳劑和溫度交互作用對微乳液形成的影響，正交試驗見表1。

表1 微乳液正交試驗結果

如表1所示，根據極差值R看出RC＞RA＞RB，即溫度對微乳液的形成影響最大，其次是乳化劑，相比之下影響最小的為助乳劑。對正交試驗結果進行分析，得出制備微乳液的最優(yōu)組合A2B2C2，即油相與乳化劑的質量比3∶7，油相/乳化劑混合物與助乳劑的質量比6∶4，溫度60 ℃。在此條件下，得到的微乳液穩(wěn)定性最好。

為檢測正交試驗優(yōu)化結果的可靠性，取油、乳化劑和助乳劑共4.0 g，采取最優(yōu)條件，即油相與乳化劑質量比3∶7，油相/乳化劑混合物與助乳劑質量比6∶4，溫度60 ℃，采用磁力攪拌方式制備微乳液，3次平行試驗得到微乳液的最大增容水量為2.6 mL，外觀表現(xiàn)為澄清透亮，流動性及穩(wěn)定性好，說明在此條件下能夠形成比較穩(wěn)定的微乳液。

2.2 微乳液類型研究

通過激光粒度儀測定所得微乳液的粒徑分布，如圖7所示，其中出現(xiàn)粒徑為82.32 nm的微乳液。

圖7 微乳液粒徑分布圖

2.2.2 電導率法判斷微乳液的形成

利用電導率儀測定微乳液在60 ℃時電導率隨水相含量的變化，試驗測定結果如圖8所示。

圖8 不同水相含量下微乳液的電導率

由圖8可知，微乳液樣品（表面活性劑與甘解豬油質量比為3∶7）在60 ℃下隨水相含量變化的電導率曲線，在較低的水相含量下，油相和表面活性劑相之間的電導率相對較低，但隨著水相含量逐漸增加到一定比例后，體系發(fā)生滲濾作用，開始由澄清透明變渾濁，使其由最初的W/O階段逐漸轉變?yōu)殡p連續(xù)相[19]。在最大電導率和水相含量（85 μS/cm，33.3%）的峰值后，繼續(xù)加入水相出現(xiàn)了電導率下降后基本保持不變，這表明微乳液的類型已從W/O型轉變?yōu)殡p連續(xù)型[20]。

2.2.3 微乳液的表征

采用染色法鑒別乳液類型，根據染色法鑒別乳液類型，結果顯示水相被包裹在內部，液滴的外側呈現(xiàn)紅色的油相，且在乳液中外側的橙黃色透明油狀物質的擴散速率高于內側水溶性的藍紫色亞甲基藍，證明所制備的乳液為油包水（W/O）型。

2.3 微乳液穩(wěn)定性的測定

2.3.1 離心穩(wěn)定性

利用離心法考察微乳體系的穩(wěn)定性，離心后測定樣品的透光率并且描述外觀變化，結果如表2所示。

表2 不同離心速率下的微乳液穩(wěn)定性

從表2可以看出，甘油解豬油微乳液在不同轉速下離心，均未出現(xiàn)分層或凝固現(xiàn)象，且依然保持澄清透明，微乳液為金黃色，說明微乳液在離心過程中體系中的內含物聚集度很低，不易出現(xiàn)分層現(xiàn)象，透光率均在75%以上，劉欣[17]在對玫瑰精油離心穩(wěn)定性的研究中，得出微乳液在3 000~8 000 r/min的離心速率下均保持較好的穩(wěn)定性，沒有出現(xiàn)分層現(xiàn)象的結論。

2.3.2 鹽度穩(wěn)定性

為探究微乳液的鹽度穩(wěn)定性，利用不同濃度的鹽溶液代替去離子水進行稀釋微乳液，離心后測得的微乳液的透光率結果如表3所示。

表3 不同濃度的鹽溶液對微乳液的透光率影響

從表3可以得出，甘油解豬油微乳液不受食品體系中常見電解質的影響，穩(wěn)定性良好，外觀均澄清透亮，體系無混濁和分層現(xiàn)象，微乳液的透光率均保持在50%以上，從表3中還可以看出濃度為0.15 mol/L的鹽溶液的透光率最佳。

2.3.3 pH穩(wěn)定性

用磷酸氫二鈉和檸檬酸配制的緩沖溶液代替去離子水制備微乳液，在550 nm下測透光率，結果如圖9所示。

圖9 不同pH下的透光率變化

由圖9可知，被不同pH的緩沖液稀釋后，微乳液均未出現(xiàn)混濁分層現(xiàn)象，依舊保持澄清透亮，而且透光率的變化幅度較小，pH大于5。總體上微乳液的pH穩(wěn)定性較好，在常見的中性或酸性體系中，微乳液都有較好的穩(wěn)定性，不受環(huán)境的影響，能夠很好地保持微乳液中的物質。

3 結論

以豬油甘油二酯為研究對象，以最大增容水量和外觀為考察指標，研究不同的乳化劑及其添加量、助乳劑及其添加量、制備方法等因素對微乳液形成的影響，結論如下：

1) 對表面活性劑的篩選試驗結果表明，在配制以動物油脂等長鏈大分子為油相的微乳液時，采用流體狀的表面活性劑的增溶效果較好。

2) 加入助表面活性劑可以降低各相界面表面張力，增加相界面膜的流動性及促進微乳液的形成。食品中常見的助表面活性劑有無水乙醇、甘油、山梨醇、丙二醇和一些糖類物質等，在食品工業(yè)中乙醇和丙二醇主要作為加工助劑使用，有著相關使用限量。因此，選擇丙三醇、山梨醇和蔗糖等一些天然助表面活性劑物質來研究，更具有安全性。從單因素結果看，丙三醇在天然乳化劑中助乳化的效果更為明顯。

3) 豬油甘油二酯微乳液體系的構建：以吐溫80為表面活性劑，丙三醇為助表面活性劑，油相與乳化劑的質量比為3∶7，油相/乳化劑混合物與助乳劑的質量比為6∶4，能夠形成穩(wěn)定的微乳液。微乳液穩(wěn)定性研究表明，在60 ℃下，利用磁力攪拌方式，形成的微乳液最為穩(wěn)定。以最佳配比制得甘油解豬油微乳液，澄清透亮無分層粒徑為82.32 nm，微乳液為W/O型。