劉艷苓，董紅霞，龍澤麗，韓陽，韓靜

1.沈陽藥科大學(xué)制藥工程學(xué)院（沈陽 110016）；2.沈陽藥科大學(xué)功能食品與葡萄酒學(xué)院（沈陽 110016）；3.沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院（沈陽 110016）

青花椒（Zanthoxylum schinifoliumSieb.et Zucc，Z.schinifolium）是蕓香科花椒屬植物中的一種[1]，是我國傳統(tǒng)的中藥[2]和調(diào)味劑[3]，是藥食同源的植物[4]。原產(chǎn)于中國南部、孟加拉國、不丹、印度北部等地[5]?！吨袊幍洹分杏涊d花椒是青椒的干燥成熟果皮，具有溫中止痛、殺蟲止癢的功效[6]?，F(xiàn)代藥理研究表明，青花椒及其提取物具有抗菌、抗氧化、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤和降血糖等藥理活性[7]。事實(shí)上，花椒作為一種藥用植物在亞洲已經(jīng)被使用數(shù)千年，在初級(jí)衛(wèi)生保健中發(fā)揮著重要作用[8]。

青花椒精油作為青花椒的主要活性成分，是一種復(fù)雜的有機(jī)化合物混合物，具有清爽和麻木的味道，是花椒香氣和特殊風(fēng)味的主要來源，也是判斷花椒品質(zhì)的重要依據(jù)，具有藥輔合一的作用[9]。近年來，從藥用植物或草藥中提取的天然產(chǎn)物已經(jīng)成為一種醫(yī)學(xué)界重要補(bǔ)充治療方法[10]?；ń肪妥鳛橐环N公認(rèn)的安全物質(zhì)[11]，含有許多易降解和高揮發(fā)性的生物活性物質(zhì)[12]。Rashed等[13]通過分離得出，青花椒精油中芳樟醇為主要成分，占57.54%。由此表明，芳樟醇是青花椒精油當(dāng)中含量最高的成分。但青花椒精油本身存在穩(wěn)定性差、生物利用度低等問題，因此充分利用青花椒精油促進(jìn)藥物經(jīng)皮滲透的優(yōu)點(diǎn)，將其開發(fā)成穩(wěn)定安全的經(jīng)皮給藥制劑具有重要意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器與設(shè)備

日立Primaide高效液相色譜儀（日本Hitachi公司）；Zetasizer Nano ZS激光粒度測(cè)量?jī)x（英國Malvern公司）；ATY124精密電子天平（日本Shimadzu公司）；SHA-BA水浴恒溫振蕩器（江蘇科析儀器有限公司）；Scientz-IID超聲波細(xì)胞破碎機(jī)（寧波新芝生物科技有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 材料與試劑

青花椒（云南泰瑞農(nóng)林發(fā)展有限公司）；芳樟醇對(duì)照品、氫化大豆卵磷脂、泊洛沙姆188（上海麥克林生化科技有限公司）；膽固醇（天津光復(fù)精細(xì)化工研究所）；1, 2-丙二醇（天津恒興化學(xué)試劑有限公司）；氯仿（天津利安隆博華醫(yī)藥化學(xué)有限公司）；甲醇（天津康科德科技有限公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 青花椒精油的提取

依據(jù)2020版《中國藥典》第四部中精油測(cè)定法（甲法）來提取青花椒精油：稱取50 g預(yù)處理過的青花椒粗粉加入到1 000 mL燒瓶中，加入數(shù)顆沸石，取10倍量超純水浸泡1 h后，加熱微沸4 h，靜置10 min，收集青花椒精油。

2.2 青花椒精油納米柔性脂質(zhì)體的制備

采用薄膜-超聲法制備青花椒精油柔性納米脂質(zhì)體，用分析天平分別精密稱取一定量的氫化大豆卵磷脂、膽固醇置于10 mL茄形瓶中，加入適量氯仿和甲醇（2∶1，V/V），加熱至完全溶解，室溫條件下減壓蒸餾除去有機(jī)溶劑，至瓶壁上出現(xiàn)均勻的干燥脂質(zhì)薄膜，待有機(jī)溶劑完全除去，取下茄形瓶。另將1%（V/V）丙二醇與青花椒精油超聲互溶，加入水和表面活性劑，制備成青花椒精油混懸液。在一定溫度下，向類脂膜中逐滴加入青花椒精油混懸液，攪拌水化，取出后用超聲波細(xì)胞破碎儀冰水浴超聲，即得到青花椒精油柔性脂質(zhì)體。

2.3 精油中芳樟醇含量方法學(xué)的建立

2.3.1 色譜條件

色譜柱：日立Primaide高效液相色譜儀 ODS C18液相色譜柱（4.6×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（50︰50，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：205 nm，柱溫30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL[14]。

2.3.2 線性關(guān)系

精確稱取芳樟醇對(duì)照品，用乙腈稀釋成11.32，22.64，45.28，67.92，90.56，113.20和566.50 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)稀釋溶液。以芳樟醇濃度（X）對(duì)峰面積（Y）作線性回歸，得回歸方程Y=15 080X+268 299（R2=0.999 7）。結(jié)果表明在11.32~566.50 μg/mL內(nèi)的藥物質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好。

2.3.3 方法學(xué)考察

精密度結(jié)果顯示，同一份樣品平行檢測(cè)6次，峰面積的SRSD值為1.44%；穩(wěn)定性結(jié)果顯示，同一份樣品在0，2，4，6，8，10，12和24 h內(nèi)檢測(cè)的峰面積值SRSD為1.29%；加樣回收率結(jié)果顯示，高，中，低濃度的青花椒精油加到樣品中的加樣回收率分別為97.66%，95.47%和96.22%；上述結(jié)果表明儀器參數(shù)相對(duì)良好，均符合規(guī)定，表明該方法可準(zhǔn)確檢測(cè)青花椒精油含量。

2.4 包封率的測(cè)定方法

采用超濾-離心法測(cè)定青花椒精油柔性脂質(zhì)體的包封率。精密量取一定量的花椒精油柔性脂質(zhì)體，加入適量乙腈破乳并稀釋定容至5 mL，渦旋2 min，過0.22 μm微孔濾膜后，按2.3.1小節(jié)的色譜條件測(cè)定總芳樟醇的濃度。精密量取等量的柔性脂質(zhì)體于超濾管上層套管中，在925g條件下離心15 min。收集下管濾液，用乙腈稀釋定容至5 mL，過0.22 μm微孔濾膜后，按相同色譜條件測(cè)定游離芳樟醇的濃度。包封率EE（%）按式（1）計(jì)算。

式中：Ctota為脂質(zhì)體中總芳樟醇的質(zhì)量，mg；Cfree為脂質(zhì)體中游離芳樟醇的質(zhì)量，mg。

2.5 單因素考察

2.5.1 處方單因素

表面活性劑種類篩選結(jié)果（圖1）顯示：泊洛沙姆188和吐溫80制備的脂質(zhì)體粒徑與包封率相當(dāng)，考慮到吐溫80有一定的毒性，因此選擇泊洛沙姆188（F 68）作為表面活性劑；不同氫化大豆卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比和氫化大豆卵磷脂與F 68對(duì)脂質(zhì)體粒徑和包封率的響應(yīng)趨勢(shì)相似，即隨著質(zhì)量比增加，脂質(zhì)體粒徑呈下降趨勢(shì)，包封率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)氫化大豆卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比達(dá)到10∶1（或氫化大豆卵磷脂與泊洛沙姆188質(zhì)量比達(dá)到8∶1）時(shí)，脂質(zhì)體粒徑呈上升趨勢(shì)，包封率呈下降趨勢(shì)；不同藥物加入量結(jié)果顯示，加藥量的多少對(duì)包封率的影響小于對(duì)粒徑的影響，藥物加入量4 mg時(shí)粒徑最小，包封的藥物最多，更易于藥物的吸收。

圖1 處方單因素考察結(jié)果

2.5.2 工藝單因素

不同超聲時(shí)間結(jié)果（圖2）顯示：當(dāng)超聲時(shí)間增加從5 min至10 min時(shí)，脂質(zhì)體粒徑下降而后隨著時(shí)間延長(zhǎng)，仍明顯地降低脂質(zhì)體粒徑，說明適當(dāng)延長(zhǎng)超聲時(shí)間能夠有效地控制脂質(zhì)體粒徑；不同超聲功率結(jié)果顯示，超聲功率對(duì)粒徑的影響較大，可能是由于超聲探頭發(fā)出的能量受到粒子影響，在容器中分布不均勻，需要達(dá)到一定的超聲功率，才能顯著地降低脂質(zhì)體的粒徑，提高粒子的均勻度；不同水合時(shí)間和溫度對(duì)脂質(zhì)體粒徑和包封率的響應(yīng)趨勢(shì)相似，觀察脂質(zhì)體包封率變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著水合溫度上升，脂質(zhì)體包封率增大，但水合溫度過高，使磷脂膜結(jié)構(gòu)變得松散，降低脂質(zhì)體穩(wěn)定性，導(dǎo)致藥物滲漏。

圖2 工藝單因素考察結(jié)果

圖3 自變量A，B，C與因變量等高線圖

2.6 Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)

2.6.1 Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)，選擇對(duì)青花椒精油柔性納米脂質(zhì)體影響較大的3個(gè)因素，即氫化大豆卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比（A）、氫化大豆卵磷脂與泊洛沙姆188的質(zhì)量比（B）和超聲功率（C），每個(gè)因素取3個(gè)水平，設(shè)計(jì)三因素三水平Box-Behnken試驗(yàn)（見表1），以粒徑（Y1）和包封率（Y2）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化精油脂質(zhì)體工藝條件。采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，獲得Y1與Y2值對(duì)自變量A，B，C的二次多項(xiàng)式回歸方程：

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

表2 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果

Y1=115.82+0.44A-0.062B-5.00C-0.48AB-0.25AC-1.20BC+5.88A2+5.93B2+9.70C2

Y2=91.27+0.62A+0.76B+2.3C+0.41AB+0.30AC-0.51BC-2.42A2-3.02B2-5.82C2

根據(jù)回歸模型方差分析結(jié)果表3可知，各模型的P值均＜0.000 1，說明各回歸模型極為顯著。各模型的失擬項(xiàng)P值均＞0.05，表示異常因素對(duì)方程擬合的影響很小，可預(yù)測(cè)各因素對(duì)響應(yīng)值的影響。相關(guān)系數(shù)R2分別為0.993 6和0.976 2，均＞0.9，說明各模型擬合程度較良好，模型的預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值相近，具有良好的相關(guān)性，可用于對(duì)柔性脂質(zhì)體的預(yù)測(cè)和分析。進(jìn)一步分析方程中的各項(xiàng)可知：C，BC，A2，B2，C2是Y1模型的顯著性影響因素；C，A2，B2，C2是Y2模型的顯著性影響因素。

表3 青花椒精油柔性脂質(zhì)體方差分析結(jié)果

2.6.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)預(yù)測(cè)，當(dāng)包封率最大，粒徑最小時(shí)，最優(yōu)工藝條件為氫化大豆卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比10.2∶1、氫化大豆卵磷脂與泊洛沙姆188的質(zhì)量比8.16∶1和超聲功率為351.5 W，預(yù)測(cè)的包封率和粒徑分別為91.57%和115.21 nm。根據(jù)實(shí)際工藝調(diào)整最優(yōu)工藝條件：氫化大豆卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比10∶1、氫化大豆卵磷脂與泊洛沙姆188的質(zhì)量比8∶1和超聲功率352 W，表4中所得柔性脂質(zhì)體包封率和粒徑與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差＜5%，SRSD＜2%，說明該試驗(yàn)設(shè)計(jì)具有良好的參考性和準(zhǔn)確性。

表4 最優(yōu)處方的驗(yàn)證試驗(yàn)

2.7 青花椒精油柔性納米脂質(zhì)體的質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.7.1 柔性脂質(zhì)體外觀

此研究制得的青花椒精油柔性脂質(zhì)體外觀如圖4所示。通過肉眼觀察，新鮮的柔性脂質(zhì)體樣品均為澄清，泛藍(lán)光的溶液，用激光筆照射可以明顯看到一條光亮的通路，證明所制備制劑為均勻的納米制劑。

圖4 青花椒精油柔性脂質(zhì)體的外觀

2.7.2 粒徑和Zeta電位

采用Zetasizer Nano ZS納米粒度電位儀測(cè)定脂質(zhì)體樣品的粒徑、多分散系數(shù)（PDI）及Zeta電位。結(jié)果表明，青花椒納米柔性脂質(zhì)體的粒徑為115.81±2.11 nm（n=3），多分散系數(shù)PDI為0.236±0.110（n=3），Zeta電位為-50.21±2.35 mV（n=3）。此研究制得的青花椒油納米柔性脂質(zhì)體粒徑分布均勻且穩(wěn)定性良好，粒徑分布及Zeta電位分布見圖5。

圖5 青花椒精油柔性納米脂質(zhì)體粒徑（A）和電位（B）

2.8 體外經(jīng)皮滲透

2.8.1 在離體皮膚制備

在小鼠腹部涂抹脫毛膏進(jìn)行脫毛處理后，用生理鹽水洗凈，正常飲水飲食，飼養(yǎng)24 h后處死，用鑷子剝離無毛的腹部皮膚，去除多余皮下脂肪，用生理鹽水洗凈，濾紙吸干，冷藏備用。

2.8.2 體外透皮吸收試驗(yàn)

采用改良的Franz擴(kuò)散池測(cè)定青花椒精油柔性脂質(zhì)體的滲透吸收規(guī)律。將備用的鼠皮從冰箱冷藏室中取出，恢復(fù)至室溫，用濾紙盡可能將水分吸干。把鼠皮小心放于擴(kuò)散池的供給池和接收池中間，角質(zhì)層在供給池一側(cè)，用夾子固定供給池和接收池，接收池內(nèi)裝滿含20%（V/V）乙醇的生理鹽水。取1.0 mL優(yōu)化的柔性脂質(zhì)體及相同質(zhì)量濃度的原料藥置于鼠皮上。在37±0.5 ℃恒溫水浴中，調(diào)整轉(zhuǎn)速為300 r/min進(jìn)行透皮試驗(yàn)。于0，1，2，4，6，8，10，12，24和48 h取樣0.2 mL，隨即補(bǔ)等量37 ℃的20%（V/V）乙醇的生理鹽水。取得的樣品均用0.22 μm濾膜過濾，HPLC進(jìn)樣。從釋放曲線（圖6）看出，原料藥在8 h時(shí)釋放完全，柔性脂質(zhì)體與原料藥相比有明顯促進(jìn)藥物吸收和緩釋釋放作用，48 h后納米粒積累滲透量149.24 μg/cm2，是原料的1.77倍。

圖6 青花椒精油柔性脂質(zhì)體和原料藥的體外滲透曲線

3 結(jié)論

添加表面活性劑制備的柔性納米脂質(zhì)體擁有比游離藥物更好的釋放特性，測(cè)得的粒徑為115.81±2.11 nm（n=3），多分散系數(shù)為0.236±0.110（n=3），Zeta電位為-50.21±2.35 mV（n=3）。透皮試驗(yàn)結(jié)果顯示，青花椒精油的累積釋放量提高約1.77倍。同時(shí)有研究表明，納米脂質(zhì)體的Zeta電位絕對(duì)值越大，制劑越穩(wěn)定[16]，進(jìn)一步說明表面活性劑的添加還能提高青花椒精油柔性納米脂質(zhì)體的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性。以納米封裝技術(shù)為基礎(chǔ)的頭透皮給藥系統(tǒng)，不僅能夠保護(hù)中藥活性成分藥物免受破壞，提高關(guān)鍵藥物的穩(wěn)定性，而且有利于對(duì)藥物的攝取，提高中藥活性成分藥物吸收。