韓艷霞，倪榮，張妍，張人久，李丹丹，張振

1.錦州醫(yī)科大學(xué)食品與健康學(xué)院（錦州 121000）；2.錦州醫(yī)科大學(xué)生物信息工程學(xué)院（錦州 121000）

隨著人們安全意識(shí)提高，目前可食性復(fù)合膜更趨向于天然綠色產(chǎn)品，殼聚糖已成為可食性復(fù)合膜與保鮮領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。殼聚糖是一種類(lèi)似纖維結(jié)構(gòu)的、可經(jīng)甲殼素脫乙?；玫降奶烊魂?yáng)離子多糖，是乳白色偏黃粉狀顆粒。只可溶于某些酸性介質(zhì)，易成膜[1]、有延緩氧化作用[2]，所成的膜透明度高、抗菌性強(qiáng)。但因殼聚糖所成的膜脆性大，國(guó)內(nèi)外的研究人員通過(guò)向其溶液中加入一種或多種物質(zhì)來(lái)改善，如蔡月等[3]用茶多酚@ZIF-8/殼聚糖/海藻酸鈉來(lái)制備活性包裝膜。

卡拉膠是一種親水的藻膠[4]，是良好的增稠劑、凝膠劑[5]，但是單一卡拉膠不易成膜[6]，需要加入其他物質(zhì)起增塑作用。胡燕等[7]通過(guò)添加丙三醇，制備并表征了復(fù)合可食性膜，通過(guò)Design-Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化其主要制備工藝參數(shù)。

近年來(lái)，可食性膜由于具有制作工藝簡(jiǎn)單、成本低、可食、使用方便、易降解以及對(duì)環(huán)境不產(chǎn)生污染等優(yōu)良特點(diǎn)成為研究熱點(diǎn)。利用殼聚糖（CS）和卡拉膠（CA）為成膜基質(zhì)的復(fù)合膜已有一些，但是對(duì)三明治型CA/CS/CA復(fù)合膜[8]的研究目前尚未發(fā)現(xiàn)。此次研究以卡拉膠（CA）和殼聚糖（CS）為主要原料，添加丙三醇為增塑劑，制備三明治型復(fù)合膜，并進(jìn)行性能優(yōu)化，以期研發(fā)一種性能優(yōu)良的三明治型復(fù)合膜應(yīng)用于食品保鮮與包裝中。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殼聚糖（食品級(jí)，脫乙酰度＞95%，黏度100~200 mPa·s，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；精純卡拉膠（肇慶海星生物科技有限公司）；丙三醇（分析純，天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑）。

1.2 儀器與設(shè)備

Varioskan型酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技公司）；TMS-PRO型質(zhì)構(gòu)儀（北京盈盛恒泰科技有限責(zé)任公司）；Mira3型電子掃描式電鏡（捷克TESCAN）；FTIR-850型傅里葉紅外光譜（天津港東科技股份有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 卡拉膠/殼聚糖/卡拉膠復(fù)合膜的制備方法

取15 mL卡拉膠膜液，采用流延法[9]傾倒在90 mm的塑料培養(yǎng)皿上，于55 ℃烘至微干，取等體積殼聚糖膜液傾倒在第一層上烘至微干；再取15 mL卡拉膠膜液傾倒在第二層上烘干揭膜，得到三明治型CA/CS/CA復(fù)合膜。

1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以膜的斷裂伸長(zhǎng)率（EB）、水蒸氣透過(guò)系數(shù)（WVP）為指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，單因素試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。固定水平為卡拉膠（CA）濃度0.28 g/100 mL、CS濃度1.40 g/100 mL、丙三醇添加量1.00 mL，所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次，取平均值。

表1 單因素試驗(yàn)因素與水平

1.3.3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取丙三醇添加量（A）、CA濃度（B）、CS濃度（C）為試驗(yàn)因素，以EB（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因子水平及編碼

1.3.4 復(fù)合膜的光學(xué)照片

1.3.5 卡拉膠/殼聚糖/卡拉膠復(fù)合膜性能測(cè)定

1.3.5.1 膜厚度測(cè)定

根據(jù)GB/T 1040.3—2006《塑料 拉伸性能的測(cè)定第3部分：薄塑和薄片的試驗(yàn)條件》的測(cè)試方法，對(duì)膜樣品均勻取8個(gè)點(diǎn)，用數(shù)顯測(cè)厚儀測(cè)定這8個(gè)點(diǎn)的厚度并取平均值（mm），便于計(jì)算薄膜的EB和WVP。

1.3.5.2 色差

參照肖力源等[10]的方法，用色差計(jì)按LAB模式進(jìn)行測(cè)定。用濾紙（L=75.10，a=-4.30，b=36.00）校正，將膜樣品平放在白色校正板上，測(cè)定L、a、b值。

1.3.5.3 EB測(cè)定

采用切紙機(jī)將被測(cè)樣品裁剪成20 mm×70 mm的長(zhǎng)條形狀，測(cè)量速率為120 mm/min，實(shí)際測(cè)量長(zhǎng)度為80 mm。EB按照式（1）計(jì)算。

式中：L前為試驗(yàn)前薄膜的長(zhǎng)度，mm；L后為試驗(yàn)斷裂時(shí)薄膜的長(zhǎng)度，mm。

1.3.5.4 WVP測(cè)定

根據(jù)GB/T 1037—2021《塑料薄膜與薄片水蒸氣透過(guò)性能測(cè)定 杯式增重與減重法》，測(cè)試面積為3.14 cm2，重復(fù)測(cè)量3次，計(jì)算平均值。

1.3.6 SEM分析

將膜樣品在50 ℃干燥4 h，用于觀(guān)察膜的斷面結(jié)構(gòu)。取2 cm×2 cm膜樣品，用導(dǎo)電膠固定于不銹鋼載物片上。真空噴金處理，加速電壓15 kV。取出樣品置于載物臺(tái)上，觀(guān)察樣品斷面的微觀(guān)形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.3.7 FT-IR分析

將膜樣品在45 ℃干燥24 h，剪碎研磨，采用KBr壓片，利用FT-IR儀進(jìn)行分析。選擇儀器分辨率4 cm-1，掃描32次數(shù)，掃描范圍500~4 000 cm-1。

1.3.8 抑菌性能分析

選擇大腸桿菌與金黃色葡萄球菌為代表菌株，取0.40 mL的107CFU/mL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液，傾倒在平板上制成含菌平板。將直徑為0.50 cm的無(wú)菌濾紙片逐層浸泡復(fù)合膜液中5 min，用無(wú)菌鑷子取出后貼于含菌平板上，平板倒置于37±1 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48±1 h后測(cè)量抑菌圈直徑[10]。

1.3.9 抗氧化性能分析

1.3.9.1 DPPH自由基清除率

吸取1∶1體積比的膜液與DPPH醇溶液于孔板中，記為Asample；吸取1∶1體積比的膜液與無(wú)水乙醇溶液于空白孔板中，記為Ablank；吸取1∶1體積比的DPPH醇溶液與去離子水于對(duì)照孔板中，記為Acontrol；振蕩均勻后在避光環(huán)境中自然反應(yīng)30 min，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各吸光度A。每組取三組平行，結(jié)果取平均值。根據(jù)式（2）計(jì)算復(fù)合膜對(duì) DPPH自由基清除率。

1.3.9.2 ABTS自由基清除率

參照閆林林等[11]的方法，稍作修改后進(jìn)行ABTS自由基清除試驗(yàn)。首先制備ABTS溶液（取等體積的7.40 mmol/L的ABTS溶液與2.60 mmol/L的過(guò)硫酸鉀溶液混合，在室溫黑暗條件下反應(yīng)12 h），在試驗(yàn)之前，用無(wú)水乙醇將ABTS溶液的吸光度稀釋至0.70±0.02，記為A0。取等體積的膜液與等體積稀釋后的ABTS溶液混合，避光靜置6 min后，測(cè)量其在波長(zhǎng)734 nm處的吸光度，記為A1，將無(wú)水乙醇溶液設(shè)為空白對(duì)照校零液。ABTS自由基清除率按式（3）計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)結(jié)果均平行測(cè)定3次，以“χ±SD”表示測(cè)定結(jié)果。使用Design-Expert 8.0.6.1、SPSS 26.0、Origin 2018軟件處理數(shù)據(jù)，ANOVA法進(jìn)行方差分析，LSD和S-N-K多重比較法檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

復(fù)合膜的EB[12]高有利于復(fù)合膜的成型且可保護(hù)食品免受外界壓力的損傷，WVP較低，表明該復(fù)合膜具有較好的阻隔性能，可防止食品吸潮減少微生物污染，因此試驗(yàn)中需要綜合多個(gè)指標(biāo)對(duì)復(fù)合膜進(jìn)行評(píng)價(jià)[13-14]。

2.1.1 丙三醇添加量對(duì)復(fù)合膜性能的影響

由圖1可知，富含多羥基親水基團(tuán)、具有較強(qiáng)的親水性的丙三醇可以與殼聚糖分子結(jié)合形成鏈間氫鍵，兩者結(jié)合減少了殼聚糖分子間內(nèi)部作用力，柔化殼聚糖的剛性結(jié)構(gòu)，使復(fù)合膜變得更加柔韌，所以EB逐漸增大[6]。隨著丙三醇添加量的增加，WVP逐漸增加，這可能是因?yàn)楸嫉募尤?，膜的結(jié)構(gòu)變松散且油性分子在基質(zhì)中不易揮發(fā)，膜的極性增加，透水能力隨之變大[15]。當(dāng)丙三醇添加量高于1.00 mL時(shí)，復(fù)合膜開(kāi)始變得十分軟黏，揭膜較難。綜合考慮，選取甘油添加量1.00 mL為宜。

圖1 不同丙三醇添加量對(duì)復(fù)合膜性能的影響

2.1.2 卡拉膠濃度對(duì)復(fù)合膜性能的影響

根據(jù)圖2可知，復(fù)合膜的EB隨著卡拉膠含量的増加先增加后降低，WVP先降低后升高。這可能是因?yàn)镃A含有豐富的陰離子硫酸鹽線(xiàn)性多糖[7]，這些極性分子可以作為CA與CS結(jié)合的偶聯(lián)劑[16]，使得CS和丙三醇均勻地分布，因此EB逐漸增大，在CA濃度為0.28 g/100 mL時(shí)，復(fù)合膜的EB達(dá)到最大值，為29.01%。但CA濃度＞0.28 g/100 mL時(shí)，會(huì)發(fā)生自身凝聚現(xiàn)象，導(dǎo)致EB下降[4]。由于CA微粒分散滲入復(fù)合膜的間隙里，改變了氣體分子的擴(kuò)散路徑，延緩了其運(yùn)動(dòng)速率[17]，此外CA分子的加入增強(qiáng)了與丙三醇之間化學(xué)鍵鍵能，增加致密性，可以阻止水蒸氣進(jìn)出，從而降低WVP[7]。當(dāng)CA濃度為0.28 g/100 mL時(shí)，復(fù)合膜的WVP最小，為0.71×10-8g·mm/（h·cm2·Pa）。

圖2 不同卡拉膠濃度對(duì)復(fù)合膜性能的影響

2.1.3 殼聚糖濃度對(duì)復(fù)合膜性能的影響

如圖3所示，隨著CS濃度的增加，EB呈先增加后減小的趨勢(shì)，WVP呈先減小后增大的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)镃S是一種天然陽(yáng)離子多糖，可與陰離子CA通過(guò)靜電作用交聯(lián)和氫鍵相互反應(yīng)，使得復(fù)合膜的結(jié)構(gòu)更加緊密，但過(guò)量的CS可使復(fù)合膜黏稠度增加，剛性大[18]。當(dāng)CS濃度為1.40 g/100 mL時(shí)，膜的EB達(dá)到頂峰，為30.35%，WVP最小，為1.87×10-8g·mm/（cm2·h·Pa）。

圖3 不同殼聚糖濃度對(duì)復(fù)合膜性能的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 模型建立與數(shù)據(jù)分析

利用Design-Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行多元回歸擬合，得回歸方程Y=37.65+3.01A+0.69B+0.83C+0.92AB-0.70AC-0.72BC-6.67A2-4.32B2-3.44C2（R2=0.994 2，變異系數(shù)=1.96＜10）。

從表3和表4可看出，此次試驗(yàn)的設(shè)計(jì)模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.129 7＞0.05），說(shuō)明該回歸模型能夠很好地?cái)M合試驗(yàn)結(jié)果。該模型的校正決定系數(shù)Radj2=0.986 7，R2=0.930 3，說(shuō)明該模型能夠解釋 98.67% 的響應(yīng)值變化。由回歸模型可看出，A、B、C、AB對(duì)斷裂伸長(zhǎng)率為正效應(yīng)，AC、BC、A2、B2、C2對(duì)斷裂伸長(zhǎng)率為負(fù)效應(yīng)。其中，A、C、A2、B2、C2對(duì)斷裂伸長(zhǎng)率的影響是極顯著的（P＜0.01），BC、AB、B對(duì)斷裂伸長(zhǎng)率的影響是顯著的（P＜0.05），AC對(duì)斷裂伸長(zhǎng)率的影響是不顯著的（P＞0.05）。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4 回歸模型方差分析（斷裂伸長(zhǎng)率EB）

2.2.2 各因素之間的交互作用

從響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)所呈現(xiàn)的3D圖和平面圖可以直觀(guān)地看出：圖4-a1曲面陡峭，b1等高線(xiàn)為橢圓形，說(shuō)明卡拉膠和丙三醇的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響顯著（P＜0.05）；圖5-b2等高線(xiàn)稀疏近圓形，說(shuō)明丙三醇和殼聚糖的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響不顯著（P＞0.05）；圖6-a3曲面陡峭，b3等高線(xiàn)為橢圓形，說(shuō)明卡拉膠和殼聚糖的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響顯著（P＜0.05）。

圖4 丙三醇與卡拉膠交互作用對(duì)斷裂伸長(zhǎng)率影響的響應(yīng)面與等高線(xiàn)

圖5 丙三醇與殼聚糖交互作用對(duì)斷裂伸長(zhǎng)率影響的響應(yīng)面與等高線(xiàn)

圖6 卡拉膠與殼聚糖交互作用對(duì)斷裂伸長(zhǎng)率影響的響應(yīng)面與等高線(xiàn)

通過(guò)響應(yīng)面確定最佳成膜配比：CA濃度0.28 g/100 mL，丙三醇添加量1.00 mL，CS濃度1.40 g/100 mL。

2.3 復(fù)合膜的光學(xué)照片與色差分析

結(jié)合復(fù)合膜的光學(xué)照片（圖7）表明：三明治型CA/CS/CA復(fù)合膜的顏色為白色透明狀，可以嗅到冰乙酸的酸味，外觀(guān)光滑良好。色差結(jié)果（表5）也進(jìn)一步驗(yàn)證膜的透明度良好，呈黃綠色。

圖7 三明治型CA/CS/CA復(fù)合膜的光學(xué)照片

表5 CA/CS/CA復(fù)合膜的色差值（χ±SD）

2.4 復(fù)合膜的物理性能分析

表6表示三明治型CA/CS/CA復(fù)合膜在最優(yōu)配比條件下的物理性能的測(cè)定結(jié)果。厚度為0.09 mm，EB為37.64%，WVP為2.34×10-8g·mm/（cm2·h·Pa）。

表6 三明治型CA/CS/CA復(fù)合膜的物理性能（χ±SD）

2.5 SEM分析結(jié)果

由圖8可知，復(fù)合膜具有較明顯的三層結(jié)構(gòu)，CA/CS/CA復(fù)合膜斷面較粗糙，清晰完整，均未出現(xiàn)氣孔、斷痕和聚集，存在少量的空隙。這可能是由于卡拉膠和殼聚糖之間相互作用力較弱，導(dǎo)致復(fù)合膜在脫水過(guò)程中出現(xiàn)斷裂[19]。

圖8 三明治型CA/CS/CA復(fù)合膜的斷面圖

2.6 FT-IR分析結(jié)果

紅外光譜是研究氫鍵和相容性非常有效的工具，從紅外光譜圖可以觀(guān)察到氫鍵作用的強(qiáng)度以及氫鍵的歸屬。一般而言，對(duì)于水溶性高分子，共混涉及的是氫鍵的類(lèi)型與大小變化，表現(xiàn)在非共價(jià)鍵或一些次級(jí)鍵的變化[20]。由圖9可知，3 500~3 300 cm-1處的寬吸收峰是—OH和—NH 的伸縮振動(dòng)吸收峰。2 939 cm-1和2 798 cm-1處的吸收峰是甲基和次甲基的C—H不對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰。1 610 cm-1處的吸收峰是由C==O的伸縮振動(dòng)造成的[21]。圖9-b因課題組使用的殼聚糖黏度大且精純，可能導(dǎo)致殼聚糖的紅外光譜只在1 635.35 cm-1處有波長(zhǎng)。圖9-a中原料卡拉膠和三明治型CA/CS/CA復(fù)合膜峰形相似，說(shuō)明CA/CS/CA復(fù)合膜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)以卡拉膠為主，殼聚糖與卡拉膠相容后在1 635.35 cm-1處分子作用力減弱，峰值降低，因其加入使得三明治型CA/CS/CA復(fù)合膜在3 486.7 cm-1處的分子作用力加強(qiáng)。

圖9 CA/CS/CA復(fù)合膜及其原料傅里葉紅外光譜圖

2.7 抑菌性能分析結(jié)果

通常用抑菌圈直徑來(lái)表征抑菌能力。由表7可知，三明治型CA/CS/CA復(fù)合膜對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑菌效果，且抑菌圈直徑d金黃色葡萄球菌＞d大腸桿菌，分別為0.77和1.20 cm。

表7 CA/CS/CA復(fù)合膜的抑菌性能

2.8 抗氧化性能分析結(jié)果

由圖10可知，三明治型CA/CS/CA復(fù)合膜對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基均具有清除能力，分別為74.72%和54.00%。自由基清除能力越強(qiáng)，抗氧化能力就越強(qiáng)。

圖10 三明治型CA/CS/CA復(fù)合膜對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基清除率圖

3 結(jié)論

選取EB為考察指標(biāo)，以CA濃度、丙三醇添加量、CS濃度為主要影響因素，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)確定最佳成膜配比：CA濃度0.28 g/100 mL，丙三醇添加量1.00 mL，CS濃度1.40 g/100 mL。該配比條件下制得的CA/CS/CA可食性膜，WVP較低，為2.34×10-8g·mm/（cm2·h·Pa），EB較高，為37.64%，厚度為0.09 mm。SEM和FT-IR結(jié)果顯示，所制備的復(fù)合膜具有三層結(jié)構(gòu)，且各組分間相容性好。其具有抑菌和抗氧化性能等特點(diǎn)。該研究結(jié)果在生產(chǎn)上具有較高的實(shí)用價(jià)值，可以為擴(kuò)大三明治型復(fù)合膜的應(yīng)用范圍及后續(xù)對(duì)食品的保鮮提供參考。