孫琳琳,劉嘯塵,張宇飛,武占省,岳駿松

(西安工程大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院/西安市紡織化工助劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 西安 710048)

0 引 言

合成生物學(xué)作為“未來改變世界的十大新興技術(shù)”,在生物醫(yī)藥、材料、環(huán)境、能源等領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用[1-2]。合成生物學(xué)解決這些領(lǐng)域重大問題的思路是通過改造或重新構(gòu)建底盤細(xì)胞的代謝途徑賦予底盤細(xì)胞新功能,形成可持續(xù)的生物制造工藝[3-4]。如使用可再生原料開發(fā)化學(xué)品、燃料和營養(yǎng)保健品等高附加值物質(zhì)[4-5]。然而,新引入的代謝途徑會(huì)影響底盤細(xì)胞的內(nèi)源性代謝途徑的代謝流,這與確保細(xì)胞存活的需求相沖突。因此,如何平衡底盤細(xì)胞生長與新代謝途徑的代謝流是底盤細(xì)胞高效發(fā)揮功能的核心問題之一。釀酒酵母是食品工業(yè)中一類重要微生物[6],因其具有生長速度快、遺傳背景清晰、易于培養(yǎng)和安全性高的特性,被作為最常用的真核底盤細(xì)胞應(yīng)用于合成生物學(xué)領(lǐng)域[7]。釀酒酵母被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)高附加值生物化學(xué)物質(zhì)中,如人參皂苷[8]、青蒿素[9]、白藜蘆醇[10-11]以及木糖[12]等。而啟動(dòng)子作為合成生物學(xué)和代謝工程中控制和調(diào)控基因表達(dá)中至關(guān)重要的工具[13],不僅影響著外源基因的表達(dá),還與本源基因的調(diào)控密切相關(guān),研究啟動(dòng)子對(duì)于基因的恰當(dāng)表達(dá)以及遺傳構(gòu)建體的快速表型化具有重要意義[14]。

高強(qiáng)度的啟動(dòng)子并不意味著能夠產(chǎn)生更多的產(chǎn)物[15],這是由于這些基因的異常高轉(zhuǎn)錄會(huì)給宿主造成過多的代謝負(fù)荷,從而影響產(chǎn)物產(chǎn)量和品質(zhì)[14,16]。更換不同啟動(dòng)子[17]以及優(yōu)化啟動(dòng)子元件[18]為調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)代謝途徑中關(guān)鍵基因表達(dá)水平提供了解決思路。李榮生等應(yīng)用基因編輯技術(shù)將PERG20的啟動(dòng)子替換為環(huán)氧鯊烯環(huán)合酶啟動(dòng)子PERG1,研究啟動(dòng)子對(duì)于單萜化合物生產(chǎn)的影響,調(diào)控表達(dá)強(qiáng)度后,以看成牛尨牛兒基焦磷酸(GPP)為前體的芳樟醇產(chǎn)量提高42.5%,以橙花基焦磷酸(NPP)為前體的橙花醇產(chǎn)量提高1 436.4%[19]。孫玲等通過更換啟動(dòng)子構(gòu)建釀酒酵母工程菌,以期獲得高產(chǎn)番茄紅素的目的菌株,調(diào)控表達(dá)強(qiáng)度后的番茄紅素產(chǎn)量提高8.09倍[20]。為了尋找效果最佳的啟動(dòng)子,許多研究根據(jù)內(nèi)源性啟動(dòng)子在不同生長條件下的表達(dá)強(qiáng)度對(duì)其進(jìn)行了表征或構(gòu)建了啟動(dòng)子庫,啟動(dòng)子庫的構(gòu)建對(duì)釀酒酵母基礎(chǔ)研究提供更多的參考和實(shí)用工具[21-23]。在檢測啟動(dòng)子表達(dá)強(qiáng)度時(shí),報(bào)告基因是最常用的輔助工具。LIANG等使用酵母增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(yEGFP)作為報(bào)告基因,對(duì)釀酒酵母在壓力條件下和木糖存在下各種啟動(dòng)子的活性進(jìn)行了表征[24]。

因此本文基于這種思路,以釀酒酵母細(xì)胞INVSc1為宿主菌株,篩選得到6段啟動(dòng)子序列,以pRS41H為出發(fā)質(zhì)粒,利用綠色熒光蛋白基因表達(dá),成功構(gòu)建6個(gè)重組質(zhì)粒。通過流式細(xì)胞儀對(duì)6株工程菌株的熒光表達(dá)強(qiáng)度測定,分析啟動(dòng)子的表達(dá)EGFP強(qiáng)度,并探究啟動(dòng)子隨著釀酒酵母生長過程中的活性以及強(qiáng)度變化,豐富和構(gòu)建釀酒酵母啟動(dòng)子文庫,為獲得高質(zhì)量合成生物學(xué)啟動(dòng)子元件提供參考價(jià)值。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

釀酒酵母S.cerevisiae INVSc1菌株作為啟動(dòng)子克隆的模板。E.coli DH5α用于重組質(zhì)粒的驗(yàn)證和鑒定。質(zhì)粒pRS41H為釀酒酵母表達(dá)載體,大小為5 388 bp。上述菌株和質(zhì)粒保存于本實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

胰蛋白胨與酵母提取物(英國OXOID公司,試劑級(jí)別為GR);葡萄糖和氯化鈉(西隴化工有限公司,試劑級(jí)別為AR);甘油、無水乙醇、冰醋酸和Na2HPO4(北京化學(xué)試劑公司,試劑級(jí)別為AR);Tris飽和酚、D-山梨醇和EDTA(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司);DNA Marker(根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選自北京博邁德公司,貨號(hào)為BM 2000,由6條DNA條帶組成,分別為100 bp(50 ng/5 μL)、250 bp(50 ng/5 μL)、500 bp(50 ng/5 μL)、750 bp(75 ng/5 μL)、1 000 bp(50 ng/5 μL)和2 000 bp(100 ng/5 μL));實(shí)驗(yàn)中用到的凝膠電泳DNA分子量對(duì)照均為BM 2000。Taq DNA聚合酶(生工生物工程(上海)有限公司);dNTP Mixture和rTaq DNA聚合酶(寶生物工程(大連)有限公司);限制性內(nèi)切酶BamHI、EcoRI、Sal I(美國Fermentas公司);DNA提取試劑盒(上海碧云天生物技術(shù))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與啟動(dòng)子的克隆

過夜培養(yǎng)釀酒酵母,使用DNA提取試劑盒提取釀酒酵母基因組 DNA,于-20 ℃保存?zhèn)溆?。從NCBI數(shù)據(jù)庫查詢釀酒酵母全基因組,分析數(shù)據(jù)并篩選啟動(dòng)子。使用SnapGene軟件根據(jù)啟動(dòng)子堿基序列設(shè)計(jì)引物。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成,用于啟動(dòng)子的克隆。啟動(dòng)子篩選及引物設(shè)計(jì)如表1所示。

表 1 引物設(shè)計(jì)

表1中下劃線對(duì)應(yīng)限制性內(nèi)切酶EcoR I、BamH I、Sal I的酶切位點(diǎn)。以釀酒酵母基因組為模板進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)以得到目的基因片段。將得到的啟動(dòng)子片段通過凝膠回收的方法純化,用于后續(xù)載體的構(gòu)建。

1.2.2 pRS41H-Promoter-EGFP載體的構(gòu)建

將克隆得到的啟動(dòng)子與增強(qiáng)綠色熒光蛋白EGFP基因通過OE-PCR的方法連接,構(gòu)建Promoter-EGFP片段。含有EGFP的報(bào)告基因便于后續(xù)觀察啟動(dòng)子的表達(dá)強(qiáng)弱。選用限制性內(nèi)切酶BamH I/EcoR I與Sal I,將Promoter-EGFP片段與pRS41H質(zhì)粒酶切后連接,從而得到pRS41H-Promoter-EGFP載體,質(zhì)粒構(gòu)建如圖1所示。

圖 1 重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖Fig.1 Schematic diagram of recombinant plasmid construction

1.2.3 pRS41H-Promoter-EGFP的導(dǎo)入與驗(yàn)證

將pRS41H-Promoter-EGFP導(dǎo)入到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,涂布于Amp抗性的LB固體培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)過夜至長出單菌落。挑取單菌落,菌落PCR驗(yàn)證其是否為陽性克隆,進(jìn)一步將陽性克隆過夜培養(yǎng),提取質(zhì)粒,質(zhì)粒PCR驗(yàn)證是否含有目的基因片段。驗(yàn)證通過后即可用于后續(xù)的釀酒酵母的轉(zhuǎn)化。

1.2.4 釀酒酵母的轉(zhuǎn)化

提取驗(yàn)證后的pRS41H-Promoter-EGFP質(zhì)粒,按照1∶10的比例將轉(zhuǎn)化樣品與感受態(tài)釀酒酵母細(xì)胞混合,轉(zhuǎn)入預(yù)冷的電擊杯中,冰浴5 min;轉(zhuǎn)化條件為電容25 μF,電壓1.5 kV,電阻200 Ω,電擊時(shí)間5 ms。電擊后立刻加入1 mL YPD 培養(yǎng)基,30 ℃孵育1 h,5 000 r/min 離心5 min,去上清。加入100 μL 1 mol/L的山梨醇重懸細(xì)胞,將其全部涂布于含有抗生素的YPD固體培養(yǎng)基上,30 ℃培養(yǎng),觀察菌落的生長情況。

1.2.5 檢測熒光強(qiáng)度

挑取含有EGFP基因的釀酒酵母單菌落至YPD液體培養(yǎng)基中30 ℃,170 r/min條件下培養(yǎng)36 h,將2 mL菌液按比例1∶50接種于新鮮的YPD液體培養(yǎng)基中30 ℃,170 r/min培養(yǎng),每12 h取樣1次。將樣品12 000 r/min離心2 min,棄上清,用PBS緩沖液重懸,再離心,棄上清,用 PBS 緩沖液將菌體稀釋OD600至0.6時(shí),取1 mL稀釋后的樣品加入到流式小管中,使用流式細(xì)胞儀測定釀酒酵母細(xì)胞中EGFP的熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 啟動(dòng)子與EGFP基因的克隆與純化

以提取出的釀酒酵母DNA為模板,使用Taq-DNA聚合酶對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行溫度梯度PCR實(shí)驗(yàn)?？寺〕鰪腘CBI數(shù)據(jù)庫上篩選出的6個(gè)啟動(dòng)子:PCBFI、PRTFI、PPOLI、PPOLII、PPOLII、PPAFI,啟動(dòng)子長度與表1查找到的數(shù)據(jù)相符,得到的PCR產(chǎn)物如圖2(a)所示。其中A泳道為克隆得到的PCBFI,長度為515 bp;B泳道為克隆得到的PRTFI,長度為 348 bp;C泳道為克隆得到的PPOLI,長度為357 bp;D泳道為克隆得到的PPOLII,長度為371 bp;E泳道為克隆得到的PPOLIII,長度為290 bp;F泳道為克隆得到的PPAFI,長度為384 bp。對(duì)上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化,以去除雜帶DNA為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干擾,相同字母泳道代表同種啟動(dòng)子,純化后的PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖譜如圖2(b)所示。用同樣的方法對(duì)EGFP基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增,再將擴(kuò)增得到的EGFP基因純化,純化后的凝膠電泳圖如圖2(c)所示,G泳道為凝膠純化得到的EGFP報(bào)告基因,長度為798 bp。凝膠電泳顯示所有目的基因均在對(duì)應(yīng)的位置出現(xiàn)明顯DNA條帶,即證明得到目的基因。

2.2 啟動(dòng)子與EGFP報(bào)告基因載體構(gòu)建

通過報(bào)告基因來驗(yàn)證啟動(dòng)子的強(qiáng)弱是一種常用的方法,尤其是EGFP[25-26]。利用EGFP作為報(bào)告基因,具有檢測方便、無毒害、易于構(gòu)建載體和活細(xì)胞定時(shí)定位觀察的優(yōu)點(diǎn)。將純化后的EGFP報(bào)告基因通過OE-PCR技術(shù)與啟動(dòng)子基因序列連接,得到Promoter-EGFP基因片段。選用BamH I/EcoR I與Sal I限制性內(nèi)切酶,對(duì)凝膠純化后的高純度的Promoter-EGFP基因片段以及質(zhì)粒pRS41H酶切,并使用T4連接酶連接切后的2個(gè)基因片段,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌后,進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。大腸桿菌菌落PCR如圖3所示,其中圖3(a)～(f)分別為重組質(zhì)粒:pRS41H-PCBFI-EGFP、 pRS41H-PPAFI-EGFP、pRS41H-PPOLI-EGFP、pRS41H-PPOLII-EGFP、pRS41H-PPOLIII-EGFP和pRS41H-PRTFI-EGFP的大腸桿菌菌落PCR凝膠電泳圖譜,篩選PCR反應(yīng)中的陽性克隆,由圖3可知6株重組釀酒酵母中重組質(zhì)粒均轉(zhuǎn)化成功。測序后,6組重組質(zhì)粒均可用于后續(xù)釀酒酵母的轉(zhuǎn)化。

2.3 載體轉(zhuǎn)化及啟動(dòng)子表征

將驗(yàn)證過的pRS41H-Promoter-EGFP載體通過凝膠純化,使用電轉(zhuǎn)化法將上述連接得到的6個(gè)pRS41H-Promoter-EGFP載體轉(zhuǎn)入釀酒酵母后做菌落PCR確定目的基因已成功轉(zhuǎn)入。通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)入后的釀酒酵母,鏡檢結(jié)果如圖4所示?？梢钥闯?6個(gè)重組酵母細(xì)胞均能觀察到明顯的熒光,這說明6株重組酵母菌株中的綠色熒光蛋白基因表達(dá)。

(a) pRS41H-PCBFI-EGFP (b) pRS41H-PPAFI-EGFP

為定量分析啟動(dòng)子強(qiáng)度,使用流式細(xì)胞儀對(duì)釀酒酵母細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析,測量結(jié)果如圖5所示。

圖 5 重組酵母熒光強(qiáng)度Fig.5 Fluorescence intensity of recombinant S.cerevisiae

可以看出,啟動(dòng)子對(duì)報(bào)告基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄強(qiáng)弱依次為PPOLI>PPAFI>PPOLIII>PPOLII>PRTFI>PCBFI,且PPOLI相較于其他5個(gè)啟動(dòng)子具有顯著性差異。根據(jù)啟動(dòng)子相對(duì)轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度的顯著性,可以將這6個(gè)啟動(dòng)子劃分為不同強(qiáng)度類型的啟動(dòng)子:PPOLI為強(qiáng)啟動(dòng)子,PPAFI、PPOLIII、PPOLII為中等強(qiáng)度啟動(dòng)子,PRTFI、PCBFI為弱啟動(dòng)子。不同強(qiáng)度啟動(dòng)子在調(diào)控代謝途徑,平衡代謝流中的均具有潛在應(yīng)用價(jià)值。如,SHEN等通過使用不同表達(dá)強(qiáng)弱的啟動(dòng)子優(yōu)化了釀酒酵母甲羥戊酸途徑,以平衡甲羥戊酸途徑中頂部和底部基因的表達(dá),進(jìn)一步提高了番茄紅素的產(chǎn)量[27]。但是強(qiáng)啟動(dòng)子可以通過提高其下游調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄水平,進(jìn)而調(diào)控下游基因高表達(dá)的能力,是上調(diào)代謝途徑中關(guān)鍵酶基因表達(dá)水平的重要調(diào)控元件[28]。所以,在代謝工程和合成生物學(xué)中對(duì)于要增加某一代謝途徑的代謝流時(shí),強(qiáng)啟動(dòng)子顯示出更重要的作用,具有更大的應(yīng)用價(jià)值。這也表示PPOLI作為釀酒酵母中的調(diào)控元件,相較于其余啟動(dòng)子具有更大的潛能。因此,研究啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄強(qiáng)弱隨底盤細(xì)胞生長的變化具有十分重要的意義,選擇pRS41H-PPOLI-EGFP進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 PPOLI啟動(dòng)子強(qiáng)度隨酵母細(xì)胞生長的變化

根據(jù)圖5,釀酒酵母啟動(dòng)子PPOLI熒光強(qiáng)度最高,遂選取pRS41H-PPOLI-EGFP,研究熒光強(qiáng)度隨細(xì)胞生長的變化情況,每12 h測1次,持續(xù)180 h。圖6所示即為流式細(xì)胞儀測定的重組釀酒酵母的平均熒光強(qiáng)度隨細(xì)胞生長的變化。

圖 6 PPOLI重組釀酒酵母熒光強(qiáng)度檢測Fig.6 The fluorescence intensity of recombinant S.cerevisiae of PPOLI

從圖6可以看出,熒光強(qiáng)度隨著細(xì)胞的生長逐漸增強(qiáng),最終維持在較高的轉(zhuǎn)錄水平。在12～24 h階段,熒光強(qiáng)度隨釀酒酵母生長增長速度最快,隨后生長速率放緩,與上一階段持平。釀酒酵母是合成生物學(xué)中最常用的真核底盤宿主細(xì)胞,啟動(dòng)子作為合成生物學(xué)中的核心元件,在基因精準(zhǔn)高效表達(dá)調(diào)控,代謝通路平衡方面發(fā)揮重要作用。WANG等利用強(qiáng)啟動(dòng)子改造鏈霉菌底盤細(xì)胞,從而過量表達(dá)所需基因,提高工程鏈霉菌產(chǎn)物產(chǎn)量[29]。而啟動(dòng)子PPOLI隨著釀酒酵母的生長,強(qiáng)度趨于某一水平并能持續(xù)表達(dá),說明該啟動(dòng)子可用于釀酒酵母底盤細(xì)胞中,作為釀酒酵母工廠產(chǎn)品質(zhì)量和穩(wěn)定產(chǎn)出的保障,從而在一定程度上可以為釀酒酵母工廠中啟動(dòng)子的選擇和構(gòu)建提供理論依據(jù)。

3 結(jié) 語

通過比對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫,成功篩選出釀酒酵母細(xì)胞中的6個(gè)啟動(dòng)子,分別為:PCBFI、PPAFI、PPOLI、PPOLII、PPOLIII、PRTFI。利用OE-PCR和酶切構(gòu)建pRS41H-Promoter-EGFP表達(dá)載體,并電擊轉(zhuǎn)入釀酒酵母細(xì)胞中。利用流式細(xì)胞術(shù),測定各工程酵母的熒光表達(dá)強(qiáng)度,其中表達(dá)強(qiáng)度最高的為PPOLI,且明顯高于其他5個(gè)啟動(dòng)子。此外,為了探究啟動(dòng)子的表達(dá)強(qiáng)度隨酵母細(xì)胞生長的變化,以pRS41H-Promoter-EGFP工程酵母為研究對(duì)象,每隔12 h測其熒光表達(dá)強(qiáng)度,結(jié)果表明,啟動(dòng)子隨著釀酒酵母的生長,表達(dá)強(qiáng)度也會(huì)隨之增強(qiáng),并在180 h左右趨于穩(wěn)定,維持在較高的轉(zhuǎn)錄水平。這些結(jié)果為構(gòu)建釀酒酵母菌株在實(shí)際條件下進(jìn)行高效生物生產(chǎn)提供了參考。