徐 喆 周會芳 龔博煬 王 瑩 趙澤宇 邊育紅

天津中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院 (天津, 301617)

近年來,隨著人民生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變,肝病及其相關并發(fā)癥已成為全球重大公共衛(wèi)生問題[1,2]。肝硬化是各種慢性肝病的終末期發(fā)展階段之一,而腹水是肝硬化的常見并發(fā)癥,預示著肝硬化進展為失代償期,其臨床預后不佳,3年內(nèi)死亡率達50%[3]。門靜脈高壓癥和鈉水潴留是腹水形成的兩個關鍵因素[4]。肝硬化腹水嚴重降低了患者的生活質(zhì)量,給社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔。限鈉、利尿、大容量腹腔穿刺術(shù)和經(jīng)頸靜脈肝內(nèi)門體支架分流術(shù)是西醫(yī)治療肝硬化腹水的主要治療手段,但仍然存在其治療效果不理想、副作用多且容易復發(fā)等問題[5]。

中醫(yī)藥在肝硬化腹水的防治中發(fā)揮了十分重要的作用,針對肝硬化腹水病因、病機、分期進行辨證論治,從而改善臨床癥狀、提高生活質(zhì)量、延長生存時間,取得了良好的療效[6]。因此,有必要運用現(xiàn)代研究方法,對中藥專利復方進行深入探索,研究它們之間的關聯(lián)規(guī)則和配伍規(guī)律。本研究通過挖掘國家專利數(shù)據(jù)庫中治療肝硬化腹水的中藥復方數(shù)據(jù),分析其用藥規(guī)律和配伍特點,確定核心藥物,運用網(wǎng)絡藥理學篩選有效成分和治療靶點,并進行富集分析,選取主要成分與核心靶點做初步的分子對接驗證。我們探索和闡述了核心藥物治療肝硬化腹水的潛在分子機制,為其在臨床的推廣提供參考依據(jù),為新藥研發(fā)提供思路,整體研究思路如圖1 所示。

圖1 國家專利中藥復方核心藥物治療肝硬化腹水的作用機制研究思路

1 材料與方法

1.1 復方數(shù)據(jù)來源 登錄“國家知識產(chǎn)權(quán)局-中國專利公布公告”網(wǎng)站(https：//www.cnipa.gov.cn/),進入“高級查詢”頁面,勾選“發(fā)明公布”與“發(fā)明授權(quán)”,將“肝硬化腹水AND中藥”作為“名稱”進行檢索,篩選結(jié)果后得到最終數(shù)據(jù)。檢索時間范圍為建庫至2022年3月8日。

1.2 復方納入與數(shù)據(jù)標準化 納入國家專利數(shù)據(jù)庫中治療肝硬化腹水的全部中藥復方專利;藥物組成相同但用量不同的可重復錄入,藥物組成及用量相同的僅錄入1次。排除外用復方,排除非中醫(yī)藥醫(yī)療類專利。依據(jù)2020年版《中國藥典》、《中華本草》對中藥名稱進行規(guī)范化處理;按照《中藥學》規(guī)范中藥復方的藥物功效類別。

1.3 數(shù)據(jù)關聯(lián)規(guī)則與聚類分析 利用IBM SPSS Modeler 18.0軟件,基于Apriori算法對已納入的中藥復方進行關聯(lián)規(guī)則分析,設置同時滿足最低條件支持度≥7,最小規(guī)則置信度百分比≥65,提升度>2的藥物為治療肝硬化腹水的常見藥物。利用IBM SPSS Statistics 24軟件中的組間聯(lián)接聚類算法,對高頻藥物進行聚類分析。

1.4 中藥復方專利核心藥物化學成分與作用靶點挖掘 根據(jù)頻次統(tǒng)計與關聯(lián)規(guī)則,確定治療核心中藥。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫[7]挖掘核心藥物的化學成分,設置化合物生物口服利用度(OB)≥30%、類藥性指數(shù)(BL)≥0.18,篩選活性成分和蛋白靶點。此外,查閱文獻添加已報道的化學成分和蛋白靶點。使用Uniport數(shù)據(jù)庫[8]對蛋白進行名稱規(guī)范轉(zhuǎn)化操作。

1.5 肝硬化腹水潛在靶點獲取 以“cirrhosis ascites”“cirrhotic ascites”為關鍵詞分別在GeneCards 數(shù)據(jù)庫和OMIM 數(shù)據(jù)庫進行檢索,獲取肝硬化腹水相關靶點。

1.6 PPI網(wǎng)絡構(gòu)建及核心靶點篩選 將核心藥物作用靶點和肝硬化腹水潛在靶點進行比對,得到作用靶點。將作用靶點導入String Version 11.5平臺[9],選取分值>0.9分的高置信度區(qū)間,根據(jù)自由度值≥2倍中位數(shù)的靶點構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡,篩選核心靶點。

1.7 核心藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡構(gòu)建 將核心藥物、化合物成分、核心靶點、疾病信息導入Cytoscape 3.8.0軟件[10]繪制中藥-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡圖。

1.8 KEGG通路和GO功能富集分析 為進一步研究核心藥物治療肝硬化腹水的作用情況,使用和Metascape平臺[11]對核心靶點進行KEGG信號通路和GO功能富集分析,結(jié)果以P值升序排列。

1.9 分子對接驗證 根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果[12-17]和Degree值選出β-谷甾醇、常春藤皂苷元、毛蕊異黃酮、丹參酮ⅡA、異鼠李素、槲皮素、兒茶素、澤瀉醇C作為核心藥物的主要成分,與核心靶點做初步的分子對接驗證。下載主要成分和靶點文件,配置Config 文件,運行Autodock vina1.1.2,計算分子對接結(jié)合能[18-20];在Open Babel GUL軟件中將pdbqt格式文件轉(zhuǎn)化為pdb格式文件,在PyMOL中打開pdb格式文件,運用PLIP網(wǎng)站[21]進行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 專利檢索統(tǒng)計與分析 通過檢索國家專利數(shù)據(jù)庫,共獲得專利139項,納入符合標準的共110項。110項專利涉及藥物456味,用藥頻次總計1 607次。其中使用頻率≥10次的藥物共40味,占總使用頻次的44.18%,見表1。對頻次≥10次的藥物進行功效類別分析,發(fā)現(xiàn)各中藥類別使用頻率排名前4位的為：補虛藥、利水滲濕藥、活血化瘀藥和理氣藥,多有補氣健脾、利水滲濕、活血利濕、調(diào)理氣機的作用,用藥特點與鼓脹的基本病機“脾氣虛弱、氣滯、血瘀、水停”相符。

表1 110付治療肝硬化腹水中藥復方專利高頻藥物(≥10次)

2.2 關聯(lián)規(guī)則與聚類分析 將40味高頻藥物導入IBM SPSS Modeler 18.0軟件中,得出專利復方治療肝硬化腹水在組方配伍時同時出現(xiàn)且頻率較高的藥物。關聯(lián)規(guī)則結(jié)果以“后項→前項”展示,按支持度百分比由高到低排序。

2.2.1 設定最大前項數(shù)為2,得到關聯(lián)規(guī)則89條,取前5條關聯(lián)規(guī)則進行展示,見表2。結(jié)果顯示二階關聯(lián)規(guī)則中支持度最高的為丹參-黃芪,三階關聯(lián)規(guī)則中支持度最高的為白術(shù)-黃芪-丹參。

表2 中藥復方專利治療肝硬化腹水藥物關聯(lián)分析表

2.2.2 根據(jù)數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果,繪制高頻藥物關聯(lián)規(guī)則web可視化布局圖。通過線條粗細來表示藥物配伍關系的強弱,線條越粗,藥物之間的配伍關系越強。結(jié)果顯示,強配伍關系為白術(shù)-茯苓,見圖2。

圖2 高頻藥物關聯(lián)規(guī)則web可視化布局圖

2.2.3 運用IBM SPSS Statistics 24軟件中的組間聯(lián)接聚類算法,對上述40味高頻藥物進行聚類分析,根據(jù)結(jié)果,可將中藥組合分為6類,見圖3。

圖3 高頻藥物聚類分析樹狀圖

2.3 核心藥物作用化合物及靶點 根據(jù)頻次統(tǒng)計與關聯(lián)規(guī)則,確定白術(shù)、茯苓、黃芪、丹參、茵陳、大腹皮、澤瀉為核心中藥。綜合文獻報道及各數(shù)據(jù)庫檢索,化合物種類為：白術(shù)4種、茯苓13種、黃芪18種、丹參62種、茵陳11種、大腹皮3種、澤瀉9種,去除重復后獲得116個化合物,涉及作用靶點912個。

2.4 肝硬化腹水疾病潛在靶點 在GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫中分別找到肝硬化腹水相關靶點2 017和99個,去除重復靶點,共得到2 048個疾病靶點。

2.5 PPI網(wǎng)絡構(gòu)建及核心靶點篩選 將核心藥物的912個靶點與肝硬化腹水潛在靶點取交集,得到核心藥物治療肝硬化腹水的作用靶點共331個,根據(jù)自由度篩選得到61個核心作用靶點。

2.6 構(gòu)建核心藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡 將中藥、化合物成分、核心靶點和疾病導入Cytoscape 3.8.0軟件繪制中藥-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡圖。見圖4。倒三角形表示核心藥物,六邊形表示化合物成分,菱形表示核心靶點,三角形表示肝硬化腹水疾病。

圖4 核心藥物-成分-治療靶點-疾病網(wǎng)絡圖

2.7 KEGG通路和GO富集分析 將61個核心靶點導入Metascape平臺進行KEGG通路富集分析,得到KEGG通路總計174條。排名靠前的通路主要有癌癥相關途徑、乙型肝炎、PI3K-Akt信號通路、丙型肝炎等,按P值對排名前20的通路繪制富集分析氣泡圖,見圖5。

同時將這61個核心靶點導入Metascape平臺進行GO富集分析,獲得1 432條生物過程條目,71條細胞組分條目,105條分子功能條目。根據(jù)P值進行排序,選擇生物過程前10條、細胞組分和分子功能前5條目繪制富集分析氣泡圖,見圖6。GO富集分析可知,靶點蛋白主要參與了對生長因子的反應、蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復合物、局灶性粘連、蛋白激酶活性、激酶結(jié)合等過程。

圖6 GO生物過程、細胞組分以及分子功能富集分析氣泡圖

3.8 分子對接 將核心藥物主要成分β-谷甾醇(Beta-sitosterol)、常春藤皂苷元(Hederagenin)、毛蕊異黃酮(Calycosin)、丹參酮ⅡA(Tanshinone ⅡA)、異鼠李素(Isorhamnetin)、槲皮素(Quercetin)、兒茶素(+)-Catechin、澤瀉醇C(Alisol C)與核心靶點SRC(1O43)、TP53(4CZ5)、HSP90AA1(1BYQ)、STAT3(6NJS)進行分子對接結(jié)合。一般而言,小分子配體與大分子受體結(jié)合的構(gòu)象越穩(wěn)定時能量越低,發(fā)生作用的可能性越大,對接結(jié)合能<-5 kcal/mol時說明可形成穩(wěn)定的對接結(jié)構(gòu)[22]。本研究結(jié)果顯示,八種主要成分都能與核心靶點較好的結(jié)合,其中常春藤皂苷元與核心靶點結(jié)合最好,見表3,分子對接圖見圖7。

表3 核心藥物主要成分與核心靶點對接結(jié)合能(kcal /mol)

3 討論

根據(jù)肝硬化腹水的臨床表現(xiàn)和病變特點,歸屬于中醫(yī)“鼓脹”范疇,其病機為肝失疏泄、脾失健運、腎失氣化,辨證分型為：氣滯水停證、脾虛水停證、濕熱水停證、血瘀水停證、脾腎陽虛水停證、肝腎陰虛水停證[6]。治療肝硬化腹水多注重病機和癥狀治療,臨床多運用白術(shù)、茯苓、黃芪、丹參、大腹皮等藥物。

本研究共納入110項治療肝硬化腹水的中藥復方專利,包含456味藥物。根據(jù)頻次統(tǒng)計與關聯(lián)規(guī)則,確定白術(shù)、茯苓、黃芪、丹參、茵陳、大腹皮、澤瀉為核心中藥。白術(shù)健脾益氣、燥濕利水,發(fā)揮保肝、利膽等作用[12]。茯苓健脾、利水滲濕,發(fā)揮保肝、防治肝細胞壞死等作用[13]。黃芪補氣升陽,發(fā)揮抗纖維化、保肝等作用[23]。丹參活血化瘀,具有防護肝細胞損傷、促進肝細胞再生、抗肝纖維化等作用[24]。茵陳利膽退黃,具有保肝、利膽、防治肝纖維化等作用[15]。大腹皮利水消腫、行氣寬中,能興奮胃腸道平滑肌。澤瀉利水滲濕,發(fā)揮利尿、保肝、減輕肝臟脂肪性病變等作用[17]。7味核心藥物中,白術(shù)、茯苓、黃芪、大腹皮、澤瀉以補氣健脾、利水滲濕為主,輔以丹參活血化瘀,茵陳清利濕熱。

根據(jù)高頻藥物類別分析,占據(jù)前4類的是補虛藥、利水滲濕藥、活血化瘀藥和理氣藥,這與核心藥物分布一致。在治療肝硬化腹水的專利復方中,常以補虛藥為主,利水滲濕藥、活血化瘀藥和理氣藥為輔。根據(jù)高頻藥物聚類分析共得出6個聚類組合,聚4類：柴胡、青皮、白花蛇舌草、山楂、牡丹皮、鱉甲、當歸、山藥、黃精、虎杖、豬苓、薏苡仁、茵陳、枳殼、茯苓、澤瀉、白術(shù)、黨參,可視為柴胡疏肝散、五苓散、參苓白術(shù)散化裁而來,其功擅疏肝理氣、健脾益氣、化氣利水、行水散滿,適用于肝硬化腹水氣滯水停和脾虛水停者。

分析PPI網(wǎng)絡可知,核心靶點包括SRC、TP53、HSP90AA1和STAT3。SRC在肝纖維化中具有重要作用,SRC抑制劑可通過阻止肝星狀細胞活化,降低結(jié)締組織生長因子來治療肝纖維化[25]。TP53是降低肝細胞癌風險的潛在候選物,其功能的喪失被認為是多階段肝癌發(fā)生中最重要的一步[26]。STAT3與肝損傷、炎癥、再生和肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展密切相關[27,28]。不難發(fā)現(xiàn),這些核心靶點主要參與肝纖維化、肝癌發(fā)生、肝損傷和肝硬化等過程,從而起到治療肝硬化腹水的作用。

根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果和Degree值篩選核心藥物的主要成分。β-谷甾醇廣泛應于與肝臟疾病,具有抗炎、降脂、防止肝組織膠原過度累積、改善肝毒性肝臟損傷作用[29]。常春藤皂苷元可抑制肝癌細胞的生長,降低血糖,降低血脂[30]。在HepG2肝癌細胞中,毛蕊異黃酮可誘導線粒體依賴性凋亡和細胞周期停滯,并通過ROS介導的信號通路抑制細胞遷移,從而抑制肝癌細胞生長[31]。丹參酮ⅡA是從丹參根中分離得到的,具有抗纖維化、抗癌、抗氧化、抗炎等作用[32]。異鼠李素是一種保護肝臟的黃酮類化合物,可通過TGF- β1/Smad3通路抑制細胞外基質(zhì)形成治療肝纖維化[33]。槲皮素對各種急、慢性肝損傷均具有良好的防治作用[34]。研究表明,(+)-兒茶素和澤瀉醇C均可改善肝脂代謝紊亂和肝損傷[16,17]。

分子對接結(jié)果顯示,主要活性成分與核心靶點穩(wěn)定結(jié)合,初步驗證了上述網(wǎng)絡藥理學預測結(jié)果的可靠性。通路富集結(jié)果顯示,核心藥物可能通過乙型肝炎、PI3K-Akt信號通路、丙型肝炎等發(fā)揮作用。其中乙型肝炎和丙型肝炎信號通路與肝病直接相關;PI3K/Akt信號通路可轉(zhuǎn)導調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)降解、肝星狀細胞活化和肝竇毛細血管化,在肝纖維化形成中起重要作用[35]。

但本研究仍存在一定局限性,基于國家專利數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)挖掘方法僅簡單地統(tǒng)計分析出用藥頻次,未能充分考慮中醫(yī)辨證分型的特點。獲得的關鍵蛋白靶點和信號通路,未能采用體內(nèi)外實驗來驗證其預測的準確性。因此,這些局限性有待課題組進一步完善和補充。