郭 丹 崔大鵬 韓 帥 李紫宣 馮志林 張迎春 連晶晶 劉 博

1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院肝膽外科 (河北 張家口, 075000) 2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院創(chuàng)傷急救外科 3.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院麻醉科 4.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科 5.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院病理科

肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌(ICC)為臨床常見的一種原發(fā)性惡性腫瘤,近年來其發(fā)病率不斷上升,肝硬化、肝炎病毒感染及肝內(nèi)膽管結(jié)石等均是影響其發(fā)生的危險(xiǎn)因素[1,2]。在臨床中,ICC主要采用根治性手術(shù)方法進(jìn)行治療,但患者術(shù)后復(fù)發(fā)、預(yù)后情況較差。糖鏈抗原19-9(CA19-9)表面的糖蛋白能夠傳遞信息,當(dāng)正常細(xì)胞出現(xiàn)惡變時(shí)其水平較高[3],在臨床中已被作為腫瘤診斷、評估的重要標(biāo)志物,但關(guān)于其對腫瘤患者預(yù)后的預(yù)測價(jià)值存在較多爭議[4,5]。磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(GPC-1)為肝素結(jié)合生長因子共受體,附著于細(xì)胞膜表面,在多種腫瘤中均呈陽性表達(dá),可影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及生長[6]。本研究分析GPC-1、CA19-9在ICC組織中的表達(dá)并探究其與患者臨床病理、預(yù)后的關(guān)系,為改善患者預(yù)后提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2014年7月至2018年12月本院收治的108例ICC患者手術(shù)切除的癌組織及癌旁組織蠟塊,均經(jīng)病理科證實(shí)。108例患者中男67例,女41例;年齡42～75歲,平均(59.33±7.40)歲;TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期55例,Ⅲ～Ⅳ期53例;腫瘤直徑2～6 cm,平均(4.32±1.17)cm;中低分化41例,高分化67例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均行根治性手術(shù)治療;②經(jīng)病理學(xué)檢測均確診為ICC患者;③所有患者病例資料詳細(xì)完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤者;②存在嚴(yán)重腎功能疾病者;③為復(fù)發(fā)腫瘤者;④術(shù)前進(jìn)行放化療或有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者。本研究經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號：2014-0602)。

1.2 試劑與儀器 GPC-1單克隆抗體(貨號：CSB-PA009703LA01HU)購置武漢華美生物工程有限公司;CA19-9抗體(貨號：FNab10532)購置武漢菲恩生物科技有限公司;山羊抗兔IgG抗體(貨號：GtxRb-003-E3EUR)購置武漢艾美捷科技有限公司;二氨基聯(lián)苯胺(DAB)酶底物顯色試劑盒購置福州邁新生物公司;石蠟切片機(jī)RM 2016、石蠟包埋機(jī)EG1150H均購置德國Leica;光學(xué)顯微鏡BX 45購置日本Olympus。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測GPC-1、CA19-9表達(dá)情況 將從病理科收集的石蠟包埋組織制成厚度為4 μm的切片,依次進(jìn)行常規(guī)二甲苯脫蠟,乙醇、蒸餾水水化,枸櫞酸鹽緩沖液修復(fù)抗原,PBS沖洗后加入體積分?jǐn)?shù)為3%的過氧化氫去離子水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶反應(yīng)10 min,加入一抗并在4℃下孵育過夜,PBS沖洗后加入二抗室溫孵育30 min,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,脫水、封片。PBS代替一抗作為陰性對照。上述操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。在高倍鏡(×400)下隨機(jī)選取3個(gè)視野觀察,結(jié)果判定采用兩級標(biāo)準(zhǔn)計(jì)分法,染色強(qiáng)度評分：無染色、淺黃色、棕黃色、棕褐色分別計(jì)0分、1分、2分、3分。陽性細(xì)胞占比<26%為1分,26%～50%為2分,51%～75%為3分,>75%為4分。將上述兩項(xiàng)評分結(jié)果相乘進(jìn)行判定：<3分為陰性,≥3分為陽性[7]。由2位高年資醫(yī)師進(jìn)行雙盲法閱片。

1.4 隨訪 患者術(shù)后每6個(gè)月隨訪1次,隨訪開始時(shí)間為手術(shù)結(jié)束后,直至患者死亡或2021年12月,記錄隨訪期間復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等情況,以死亡為終點(diǎn)事件。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)數(shù)資料采用n(%)描述,行χ2檢驗(yàn)。癌組織及癌旁組織GPC-1、CA19-9表達(dá)比較采用配對卡方檢驗(yàn)。Spearman法分析癌組織中GPC-1和CA19-9表達(dá)的相關(guān)性;Kaplan-Meier曲線分析GPC-1及CA19-9表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織中GPC-1、CA19-9表達(dá)情況 ICC癌組織GPC-1及CA19-9陽性表達(dá)率分別為70.37%(76/108)、75.00%(81/108),均明顯高于癌旁組織9.26%(10/108)、17.59%(19/108)(χ2=84.159,P<0.001;χ2=71.578,P<0.001)。

2.2 癌組織中GPC-1、CA19-9表達(dá)相關(guān)性分析 見表1。

2.3 GPC-1、CA19-9表達(dá)與ICC病理特征關(guān)系 見表2。

表2 GPC-1、CA19-9表達(dá)與ICC臨床病理特征的關(guān)系 (n,%)

2.4 GPC-1、CA19-9表達(dá)與ICC患者預(yù)后的關(guān)系 ICC患者總生存率為44.44%(48/108),GPC-1陽性表達(dá)患者生存率為28.95%(22/76),陰性表達(dá)患者生存率為81.25%(26/32)(Log RanK=21.768,P<0.001);CA19-9陽性表達(dá)患者生存率為34.57%(28/81),陰性表達(dá)患者生存率為74.07%(20/27)(Log RanK=12.796,P<0.001),見圖1。ICC患者復(fù)發(fā)率為56.48%(61/108),GPC-1陽性表達(dá)患者復(fù)發(fā)率為72.37%(55/76),陰性表達(dá)患者復(fù)發(fā)率為18.75%(6/32)(Log RanK=24.087,P<0.001);CA19-9陽性表達(dá)患者復(fù)發(fā)率為66.67%(54/81),陰性表達(dá)患者復(fù)發(fā)率為25.93%(7/27)(Log RanK=11.870,P=0.001),見圖2。

圖1 不同GPC-1、CA19-9表達(dá)ICC患者生存曲線

圖2 不同GPC-1、CA19-9表達(dá)ICC患者復(fù)發(fā)情況分析

3 討論

GPC-1為硫酸乙酰肝素蛋白多糖家族中的一員,是由糖、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等組成的復(fù)雜復(fù)合物,可附著于細(xì)胞膜表面[8]。國外研究顯示,GPC-1絲氨酸殘基與硫酸乙酰肝素鏈相連,然后由硫酸乙酰肝素鏈通過與各種細(xì)胞因子結(jié)合而發(fā)揮其對細(xì)胞的調(diào)控作用[9,10]。倪文等[11]、陸飛等[12]研究顯示,GPC-1作為細(xì)胞膜共受體,正常機(jī)體中無表達(dá)或表達(dá)量非常低,在多種腫瘤細(xì)胞中呈陽性表達(dá),在癌變過程中起著關(guān)鍵作用,且與腫瘤的轉(zhuǎn)移及增殖有關(guān)。Duan等[13]研究指出,GPC-1可作為預(yù)測胰腺癌生存期的重要因素。但是還有學(xué)者研究認(rèn)為,GPC-1在不同腫瘤類型中表達(dá)的差異很大,其在胰腺癌、乳腺癌以及肝癌等腫瘤中呈現(xiàn)異常高表達(dá),而在肺癌、子宮內(nèi)膜癌等腫瘤中表達(dá)量很低,認(rèn)為其在不同腫瘤類型中的作用可能是不同的[14,15]。本研究結(jié)果顯示,ICC癌組織中GPC-1陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織,且GPC-1表達(dá)與ICC患者腫瘤大小、包膜浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及分化程度有關(guān),但與年齡、性別、肝硬化等無關(guān),提示其可能與ICC的發(fā)生有關(guān)。通過對患者預(yù)后情況分析發(fā)現(xiàn),GPC-1陽性表達(dá)患者生存率顯著低于陰性表達(dá)患者生存率,復(fù)發(fā)率高于陰性表達(dá)患者,因此,臨床應(yīng)用時(shí)應(yīng)對GPC-1陽性表達(dá)患者實(shí)施針對性干預(yù),以緩解其預(yù)后。

CA19-9屬于低聚糖蛋白,是由膽道導(dǎo)管細(xì)胞、胰腺細(xì)胞等產(chǎn)生的連體Lewis血型抗原蛋白,在機(jī)體健康狀態(tài)下CA19-9僅有少量存在,當(dāng)機(jī)體細(xì)胞出現(xiàn)癌變時(shí)將會(huì)有大量CA19-9釋放,造成機(jī)體CA19-9異常升高[16]。有學(xué)者認(rèn)為,CA19-9在胰腺及膽管等消化道腫瘤中的水平明顯升高,為臨床診斷消化道腫瘤的常用血清腫瘤標(biāo)志物[17,18]。吳慧娟等[18]研究顯示,CA19-9對ICC具有較高的診斷價(jià)值。但是關(guān)于CA19-9在ICC組織中的表達(dá)情況與患者生存期的關(guān)系目前尚未見報(bào)告,因此本研究通過檢測ICC患者組織中CA19-9表達(dá)情況發(fā)現(xiàn),與癌旁組織相比,ICC癌組織中CA19-9陽性表達(dá)率明顯升高,并且其表達(dá)與腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度有關(guān),提示CA19-9可能與ICC的發(fā)生有關(guān);其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是ICC的主要轉(zhuǎn)移方式,而TNM分期是評估ICC疾病嚴(yán)重程度的關(guān)鍵,此結(jié)果更加說明CA19-9異常表達(dá)對ICC疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后具有極大的影響。本研究發(fā)現(xiàn),CA19-9陽性表達(dá)患者生存率顯著低于陰性表達(dá)患者生存率,復(fù)發(fā)率高于陰性表達(dá)患者,進(jìn)一步提示CA19-9表達(dá)異常可影響患者預(yù)后。本研究還發(fā)現(xiàn)癌組織中GPC-1與CA19-9存在顯著正相關(guān)性,表明GPC-1與CA19-9共同參與ICC的發(fā)生,影響ICC患者病情及預(yù)后。