馮 倩,何 齊,李 雪,易鴛鴦,孫 建,朱 靜,顧美英,譚慧林,張志東,

0 引 言

【研究意義】新疆阿克蘇地區(qū)位于天山南麓,楊樹資源豐富,每年的7～9月大量牛肝菌子實體成熟,有關該地區(qū)野生牛肝菌相關研究報道較少。多糖是牛肝菌中的主要次生代謝產(chǎn)物之一,加大對相關牛肝菌多糖的提取和功能評價,對于進一步開發(fā)和利用阿克蘇地區(qū)野生牛肝菌資源具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】蘑菇多糖提取一般采用水提醇沉,其中,隨著乙醇濃度的增加,不同組分多糖的相對分子質(zhì)量降低,抗氧化活性增強[1]。同時,乙醇分級沉淀可使分子量大小有差別的多糖在濃度不同的乙醇中析出,獲得不同組分多糖,表現(xiàn)出不同活性[2]?！颈狙芯壳腥朦c】目前,有關阿克蘇野生牛肝菌鮮有報道,為皺皮疣柄牛肝菌(Leccinumduriusculum)[3],其多糖的提取和理化特性、抗氧化活性等尚無報道。需研究野生牛肝菌多糖提取優(yōu)化及不同組分抗氧化活性分析?！緮M解決的關鍵問題】采用熱水提取法,優(yōu)化牛肝菌粗多糖最佳工藝條件,研究不同醇沉多糖組分的水溶性、持水力、粘度及體外抗氧化活性,為野生牛肝菌的進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

野生牛肝菌,采自阿克蘇市拜城縣賽里木鎮(zhèn)(E 82°11′55",N 41°47′10")。新鮮牛肝菌子實體經(jīng)清洗干凈后切片,80℃烘干6 h,粉碎,過60目篩,備用。 圖1

圖1 阿克蘇楊樹林下野生牛肝菌

1.2 方 法

1.2.1 粗多糖提取的初始條件

稱取一定量的牛肝菌子實體粉末,以水為提取液,按料液比1∶ 20,80℃下提取2 h后,8 000 r/min,離心5 min,收集上清液,加入無水乙醇至終濃度為80%,于4℃靜置過夜,以6 000 r/min,離心5 min,收集沉淀,并將沉淀用80%乙醇洗滌兩次;于-80℃冷凍干燥,得到牛肝菌粗多糖。

多糖提取率(%)=(多糖質(zhì)量/菌粉質(zhì)量)×100%。

(1)

1.2.2 多糖含量測定

多糖含量測定采用“苯酚-硫酸法”[4],以葡萄糖為標準品制作標準曲線。

1.2.3 牛肝菌粗多糖提取的工藝優(yōu)化

1.2.3.1 單因素試驗

選取料液比、浸提溫度和浸提時間為因素,分別分析不同料液比(1∶ 20、1∶ 25、1∶ 30、1∶ 35、1∶ 40 g/mL)、不同浸提溫度(50、60、70、80、90℃)和不同浸提時間(1、2、3、4、5 h)對野生牛肝菌總多糖提取率的影響。在每個因素不同處理中,除了考察的單因素數(shù)值變動外,其他考察因素取固定值。

1.2.3.2 正交試驗

在單因素實驗的基礎上,選取料液比(A)、提取溫度(B)和提取時間(C)3個因素,設置L9(33)正交試驗,優(yōu)化提取工藝。表1

表1 牛肝菌粗多糖提取條件優(yōu)化正交試驗因素與水平

1.2.4 牛肝菌不同組分多糖的制備

取一定量的粗多糖,充分溶解于水中,配制成一定濃度的多糖溶液,加入無水乙醇使體系終濃度達到40%,于 4℃ 醇沉過夜,6 000 r/min離心5 min,收集下層沉淀,獲得LD-40多糖。向處理后的上清液中繼續(xù)添加無水乙醇,使體系終濃度為80%,于4℃冰箱醇沉過夜,6 000 r/min 離心5 min,收集下層沉淀,獲得LD-80多糖。將獲得的LD-40和LD-80冷凍干燥,備用,計算各多糖組分提取率。

1.2.5 多糖水合特性的測定

1.2.5.1 水溶性

參照文獻方法[5],準確稱取0.2 g不同組分粗多糖樣品,置于50 mL的燒杯中,再加入20 mL的去離子水, 90℃連續(xù)攪拌水浴30 min,水浴結束后,6 000 r/min,離心10 min,取上清液,于105℃烘干至恒重,記錄質(zhì)量,計算多糖的水溶性。

(2)

式中,M0表示烘干后固體的質(zhì)量,M表示樣品質(zhì)量。

1.2.5.2 持水力(WHC)測定

參照文獻方法[6]略做修改,準確稱取0.2 g不同組分多糖樣品,于50 mL的離心管中,加入40 mL的蒸餾水,振蕩搖勻后室溫靜置24 h,轉速為6 000 r/min條件下離心10 min,去除上清液,并使用濾紙吸取沉淀中的剩余水分,然后稱量沉淀重量并作記錄。

(3)

式中,M1表示樣品恒重后的質(zhì)量,M表示樣品質(zhì)量。

1.2.5.3 粘度測定

分別配制濃度為5、10、20 mg/mL的2種多糖組分溶液各30 mL,置于燒杯中,使用SNB-2數(shù)字式粘度計測定,采用3號轉子,轉速為12 r/min,室溫測定,記錄數(shù)據(jù)。

1.2.6 不同多糖組分的抗氧化試驗

1.2.6.1 DPPH 自由基清除率測定

參照文獻方法[7]略作修改,以水溶性VC作陽性對照,蒸餾水作空白對照。加不同濃度的多糖溶液,再加0.1 mmol/L 的DPPH溶液,渦旋混勻。避光反應0.5 h,5 000 r/min,離心5 min,用酶標儀于517 nm處測定吸光度值。以上步驟3個平行,取均值。

(4)

式中,A0表示空白對照的吸光度值;A1表示樣品的吸光度值。

1.2.6.2 羥自由基清除率測定

參考文獻[8]方法略作修改,以水溶性VC作陽性對照,蒸餾水作空白對照。加入不同濃度的多糖溶液, 9 mmol/L FeSO4,9 mmol/L水楊酸無水乙醇,8.8 mmol/L H2O2,渦旋混勻,37℃反應0.5 h,5 000 r/min,離心5 min,用酶標儀測定510 nm處吸光度值,以上步驟3個平行,取均值。

(5)

式中,A0表示空白對照的吸光度值;A1表示樣品的吸光度值;A2表示蒸餾水替代H2O2的吸光值。

1.2.6.3 還原能力測定

參考文獻[9]方法,配制不同濃度多糖溶液,將0.2 mol/L PBS(pH=6.6)和多糖溶液混勻,再加入1%(W/V)的鐵氰化鉀溶液,渦旋混勻后50℃水浴保溫30 min,流水冷卻后加入10%(W/V)的三氯乙酸,混勻后10 000 r/min,離心5 min,取上清液,加入蒸餾水和0.1%的氯化鐵,靜置10 min,700 nm比色,記錄其吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel2019整理數(shù)據(jù), 用SPSS.25對試驗數(shù)據(jù)進行分析。

2 結果與分析

2.1 多糖測定標準曲線的繪制

研究表明,以葡萄糖含量為橫坐標、吸光度值(A)為縱坐標繪制標準曲線,得出線性回歸方程為y=7.256 5x-0.005 3,R2=0.999 1,標準曲線呈現(xiàn)良好的線性關系。圖2

圖2 多糖測定工作曲線

2.2 牛肝菌粗多糖提取工藝單因素

2.2.1 提取溫度對多糖得率的影響

研究表明,在提取時間為2 h,料液比為1∶ 20的條件下,多糖得率與提取溫度之間存在正相關關系,即隨著溫度的增加多糖的提取率也增加,其中80℃時多糖得率為9.9%,90℃時得率最高,達到 10.72%,僅較80℃時多糖得率高出0.82%,后續(xù)試驗選取80℃。圖3

圖3 不同提取溫度下多糖得率變化

2.2.2 提取料液比對多糖得率的影響

研究表明,在浸提時間為 2 h、提取溫度為80℃的條件下,料液比1∶ 20～1∶ 30,多糖得率明顯上升,到1∶ 30時到達頂峰,水量增多有助于多糖的擴散傳質(zhì),當料液比超過1∶ 30后,多糖得率反而下降。選取1∶ 25為較好料液比。圖4

圖4 不同料液比下多糖得率變化

2.2.3 提取時間對多糖得率的影響

研究表明,在料液比為1∶ 25,提取溫度為80℃的條件下,隨著浸提時間的增加而增加,但上升速率較慢,在1 h時多糖得率為10.00%,繼續(xù)延長提取時間到4 h時得率最高為11.54%,再增加提取時間對多糖的提取率基本不變,而提取時間的延長也會導致能源消耗增加,以提取時間2、3、4 h作為正交試驗中的試驗參數(shù)。圖5

圖5 不同提取時間下多糖得率變化

2.3 牛肝菌多糖提取的正交設計試驗

研究表明,對多糖提取率的影響較大的因素是提取時間,其次是提取溫度,料液比對多糖提取率的影響最小。 A2B1C2,即料液比1∶ 25,溫度75℃,時間3 h,多糖得率最高可達到12.92%。最佳提取條件為A3B2C2,即料液比1∶ 30,溫度80℃,時間3 h。多糖得率最高為13.36%。表2

表2 牛肝菌粗多糖提取正交試驗

2.4 不同多糖組分水溶性和持水力

研究表明,采用終濃度40%無水乙醇,獲得LD-40多糖。繼續(xù)添加無水乙醇,使體系終濃度為80%,獲得LD-80多糖。通過干燥后計算,LD-40和 LD-80的占野生牛肝菌多糖的92.37%、7.63%。

LD-40持水力大于LD-80,而LD-80的水溶性強于LD-40,小分子多糖較大分子多糖易溶解。 表3

表3 不同多糖組分的水合性質(zhì)

2.5 不同多糖組分的粘度

研究表明,兩種多糖組分的粘度均隨著多糖濃度的升高而高,且在相同濃度下,LD-40粘度明顯強于LD-80,當多糖濃度達到20 mg/mL時,LD-40粘度最大為1 059 mPa.s,而LD-80粘度僅為573.6 mPa·s,LD-40粘度約為LD-80的2倍。圖6

圖6 不同濃度下各多糖組分粘度變化

2.6 體外抗氧化試驗

2.6.1 DPPH 自由基清除試驗

研究表明,當有清除自由基的物質(zhì)存在時,溶液會從最初的紫色變?yōu)榉€(wěn)定的黃色,其褪色程度與抗氧化能力成正相關。兩種多糖隨著質(zhì)量濃度的升高而上升,相同濃度下LD-80對 DPPH 自由基的清除能力明顯高于LD-40,在多糖濃度為10 mg/mL時,LD-80對DPPH 的清除作用最高達到 48%。圖7

圖7 不同濃度下各多糖組分對

2.6.2 羥基自由基清除試驗

研究表明,在 1.25～10 mg/mL 范圍內(nèi),LD-40和 LD-80兩種組分對羥自由基的清除能力都隨著質(zhì)量濃度的升高而上升,相同濃度下LD-80對羥基自由基的清除作用強于LD-40,但遠低于同等濃度下VC的清除能力。圖 8

圖8 不同濃度下各多糖組分對

2.6.3 還原能力試驗

研究表明,與清除 DPPH自由基和清除羥基自由基能力相似,在 1.25～10 mg/mL 的質(zhì)量濃度范圍,2種多糖組分的還原能力均隨著質(zhì)量濃度的升高而上升,當濃度達到8 mg/mL以后兩者增長均不明顯。最高濃度10 mg/mL時,LD-80吸光度值最高可達1.02,而LD-40僅為0.27,盡管LD-80還原能力明顯強于LD-40,但其遠低于同等濃度下VC的還原能力。圖9

圖9 不同濃度各多糖組分的還原能力

3 討 論

DPPH 自由基是一種極為穩(wěn)定的自由基,在它接受氫自由基或電子后,會變成穩(wěn)定的基團分子[10]。一般還原能力越強,其抗氧化能力越強[11,12]。蘑菇多糖普遍具有抗氧化[13]、降血糖[14]、免疫調(diào)節(jié)[15]、保肝[16]等多種生物活性。目前,熱水提取法是多糖提取中應用最為廣泛也是操作最為簡單的一種方法,具有設備簡單,易于操作,成本低廉的特點[17],且不會對天然活性物質(zhì)多糖的結構及活性產(chǎn)生過多影響,有利于后續(xù)試驗的進行[18]。試驗通過水提法提取野生牛肝菌多糖,優(yōu)化了提取工藝,使多糖得率達到13.36%,顯著比杜敏華等[19]提取的野生牛肝菌多糖得率高出了4.23%,阿克蘇野生牛肝菌更富含多糖。

研究獲得了LD-40和LD-80,分別占粗多糖的92.3%、7.63%,野生牛肝菌可用較低濃度乙醇就可以獲得絕大部分多糖 。在相同濃度下,LD-40粘度和持水力均強于LD-80,原因可能是與多糖的分子量有關,乙醇體積分數(shù)越高,多糖分子量越小[20]。LD-40為大分子多糖,其粘度也較高的現(xiàn)象;但LD-80為小分子多糖,易溶解,所以水溶性較高。多糖的持水性等物理性質(zhì)常作為評價食品加工過程中物質(zhì)的口感、質(zhì)地和風味的重要指標,高粘度的多糖可作為增稠劑或膠凝劑,用于調(diào)整食品的流動性、可塑性和口感。酸奶中添加多糖會增加酸奶粘稠度,并且多糖的生物功能與其理化組成、水溶性、粘度等緊密相關[23]。在食品加工時可優(yōu)先選擇LD-40組分作為增稠劑。

不同菌蘑多糖其抗氧化功能存在明顯的差異,如紅托竹蓀菌托多糖的抗氧化能力最佳,香菇多糖次之,黑木耳多糖最差[24]。長白山野生牛肝菌的抗氧化能力也較強,多糖濃度在0.8 mg/mL下清除羥基自由基能力達到96.82%[25]。研究中不同組分多糖抗氧化活性具有明顯差異,LD-80體外抗氧化能力優(yōu)于LD-40,但當LD-80濃度達到10 mg/mL 時,其清除DPPH和OH-自由基能力也僅達到48% 和 52% ,遠低于一般菌多糖抗氧化能力,與報道的皺蓋疣柄牛肝菌多糖[7]抗氧化能力相當。

4 結 論

4.1野生牛肝菌粗多糖最佳提取工藝為料液比1∶ 30,溫度80℃,時間3 h,最佳工藝條件下,得出多糖得率為13.36%。

4.2采用分級醇沉的方法獲得了不同牛肝菌多糖提取物LD-40和LD-80 ,兩種多糖組分LD-40 和 LD-80分別占粗多糖的92.37%、7.63%。

4.3兩種多糖表現(xiàn)出不同的特性,其中 LD-40的粘度及持水力均強于LD-80。兩種多糖抗氧化能力均較弱,但LD-80抗氧化活性遠高于LD-40。