賀騰飛,劉英玉,張柳青,陳 旺,李澤亞,胡 蕓,蔣金豆,祖力胡馬爾·艾力

(新疆農業(yè)大學動物醫(yī)學學院,烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】質粒是染色體外的遺傳物質,攜帶遺傳信息,并能夠通過接合的方式有效進行遺傳信息的水平轉移,進而增強細菌對不同環(huán)境的適應能力[1]。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA)及耐萬古霉素金黃色葡萄球菌(Vancomycin resistantStaphylococcusaureus,VRSA)的出現(xiàn)是有危害的。在當前具有感染性的金黃色葡萄球菌菌株中,抗生素的耐藥性通常是由質粒編碼的,這些質?？梢酝ㄟ^水平DNA轉移機制在菌株之間傳播。臨床分離的金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌(coagulase negative staphylococci,CNS)通常攜帶一個或多個耐藥質粒,這些質粒是基因轉移的重要載體,有助于葡萄球菌耐藥關鍵基因的獲得、維持和傳播。金黃色葡萄球菌D353對苯唑西林、萬古霉素、紅霉素、克拉霉素和諾氟沙星等12種抗生素耐藥,類似這種耐多重抗生素菌株的出現(xiàn)和水平傳播增加了人類治療人畜共患疾病的困難,深入研究金黃色葡萄球菌質粒的復制方式、攜帶耐藥基因及結構特點,對于揭示金黃色葡萄球菌對環(huán)境的適應機制、監(jiān)測金黃色葡萄球菌的流行性并干預其質粒傳播具有重要意義[2-4]。【前人研究進展】常見的有小滾圈復制的葡萄球菌質粒(1-5 kb),其生物學特性已經被詳細分析,但除了它們攜帶抗性基因外,Theta復制質粒也攜帶抗性基因且片段較大,但對這種質粒的關注相對較少。目前已在葡萄球菌中識別出三類Theta復制質粒,即pSK639家族、多耐藥質粒(重金屬/β-內酰胺酶質粒和pSK1家族)和接合多耐藥質粒(pSK41家族)[5]。了解質粒復制的詳細分子機制可能會發(fā)現(xiàn)用于逆轉或減緩耐藥性發(fā)展的新方法[6]?！颈狙芯壳腥朦c】在前期研究中,發(fā)現(xiàn)新疆牛羊源的金黃色葡萄球菌存在大量的耐藥菌株和一些MRSA菌株[7],其中D353菌株對于苯唑西林、諾氟沙星、克拉霉素、紅霉素和萬古霉素等12種抗生素耐藥。分析金黃色葡萄球菌耐甲氧西林菌株和耐萬古霉素菌株的野生型質粒序列特征?！緮M解決的關鍵問題】提取耐藥菌株質粒并測序,分析質粒的結構和同源性,解釋質粒復制轉移能力和自身特性,對新疆牛羊源金黃色葡萄球菌質粒數(shù)據(jù)庫提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

金黃色葡萄球菌D353[7],來源于新疆庫爾勒牛羊肉農貿市場的工具拭子,樣品獲取時間為2018年10月,菌液與60%甘油1∶ 1,-20℃保存于新疆農業(yè)大學畜產品質量安全實驗室。

質粒提取試劑盒(TIANGEN公司);溶菌酶(Solarbio公司);7.5% NaCl 肉湯(青島海博生物技術公司);Baird-Parker瓊脂基礎(青島海博生物技術公司);10×Loading Buffer(TaKaRa公司);1 kb Ladder(康為世紀公司)。

生物安全柜(美國LABCONCO公司);高速離心機D2012 plus(SCILOGEX公司);恒溫振蕩器(上海一恒科學儀器有限公司);電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學儀器有限公司);微量分光光度計SMA4000(Merinton 儀器公司);梯度PCR儀(美國伯樂公司)。

1.2 方 法

1.2.1 菌株培養(yǎng)

將實驗室保存的金黃色葡萄球菌D353和7.5% NaCl 肉湯液體培養(yǎng)基按照1∶ 9混合,放入恒溫振蕩器,150 r/min 培養(yǎng)18 h ,劃線接種 Baird-Parker 平板,放入電熱恒溫培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24 h。

1.2.2 菌株16S rRNA鑒定

取1 mL菌液提取基因組DNA,16S rRNA的擴增引物序列為F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG,R:ACGGCTACCTTGTTACGACTT,擴增反應條件為94℃預變性5 min,94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸90 s,30個循環(huán),72℃再延伸5 min,4℃保存,將PCR產物送上海生物工程有限公司測序,鑒定菌株類別。

1.2.3 質粒提取

按照質粒提取試劑盒方法提取質粒,取1～5 mL菌液離心,去上清,先用溶菌酶100 mg/mL,37℃,20 min恒溫處理菌體,按照試劑盒說明書提取質粒。

1.2.4 質粒濃度

用微量分光光度計測定提取的質粒原液濃度,獲得質粒濃度。

1.2.5 質粒測序與組裝

將提取的質粒送至西安擎科生物技術公司測序,采用Miseq測序法,之后利用 plasmidid(version 1.6.5)進行組裝。

1.2.6 生物信息學

利用NCBI網站上的ORF Finder尋找質粒的開放閱讀框(open reading frame,ORF)以及BLAST進行初步注釋,利用Snap Gene(version 4.2.4)制作質粒圖譜,使用MEGA 11軟件制作16s rRNA序列和質粒復制起始蛋白repB的Neighbor-Joining進化樹,并利用Mauve軟件進一步分析幾株質粒間的親緣關系。

2 結果與分析

2.1 菌株16S rRNA鑒定結果

研究表明,以葡萄球菌屬S91和表皮葡萄球菌SW-7/FSE的16S rRNA基因為參照,建立ML樹。分析可知,D353與金黃色葡萄球菌 NRLFFD288以及 B0021-01R親緣關系較近,且與金黃色葡萄球菌DFI-23聚為一支。確定菌株D353為金黃色葡萄球菌。圖1

圖1 質粒pD353 16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 質粒濃度和序列

研究表明,利用微量分光光度計測定pD353濃度為40.29 ng/μL,將pD353測序拼接序列上傳NCBI的Gene Bank數(shù)據(jù)庫,序列號為NZ_CP080004,利用NCBI網站上的BLAST分析,其中質粒pSaD592、pIT1-S和pIT4-R與pD353同屬于金黃色葡萄球菌質粒,而質粒pfas4-2和pSF2來自于海氏腸球菌和糞腸球菌。

質粒pD353長度34063 bp,其(G+C)mol含量為30.42%。pD353質粒有47個超過200個核苷酸的ORF。ORF110編碼314 aa的復制蛋白repA,repA含有復制起始蛋白A的N端結構域屬于超家族cl21459和復制起始蛋白A的C 端結構域是超家族cl39431。ORF139編碼286 aa的復制蛋白repB屬于COG5527超家族結構域。ORF41編碼一個類似于IS21元件的ISBmu3家族轉座酶istA基因,ORF13編碼一個類似于IS21元件的 IS5376 家族輔助ATPaseistB基因。在pD353發(fā)現(xiàn)了5種轉座酶,分別是IS3家族轉座酶、類IS6 ISSau6家族轉座酶、IS21家族轉座酶、IS30家族轉座酶和IS1182家族轉座酶。圖2

圖2 pD353質粒圈

2.3 質粒進化同源

研究表明,pD353與金黃色葡萄球菌質粒pIT1-S和pIT4-R結構組成基本相同,都僅有一個模塊發(fā)生逆轉。與海氏腸球菌質粒pfas4-2和糞腸球菌質粒pSF2都有3個相似模塊,但也有未配對序列無相似性,所以質粒pD353與此兩株質粒親緣相對較近。而與金黃色葡萄球菌質粒pSaD592相比,雖然兩株質粒都來自于金黃色葡萄球菌,但兩株質粒含有很多的不同模塊,兩株質粒親緣較遠,差異較大。pD353與pIT1-S和pIT4-R可能共同起源于海氏腸球菌和糞腸球菌質粒,由于pD353與pIT1-S和pIT4-R有更近的親緣關系,pD353由意大利人源金黃色葡萄球菌質粒進化而來。圖3

A pD353與pIT1-S,pIT4-R的親緣關系比對

B pD353與pfas4-2的親緣關系比對

C pD353與pSF2的親緣關系比對

D pD353與pSaD592的親緣關系比對

2.4 質粒復制起點

研究表明,pD353質粒的repB與pN315質粒的rep蛋白屬于同種蛋白,兩者都與質粒pSK639近源,預測質粒pD353和pN315同屬于pSK639家族質粒,采用Theta型復制。圖4

圖4 質粒pD353 repB 系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5 質粒pD353復制起點

2.5 重金屬相關基因

研究表明,pD353上含有5種的重金屬轉運蛋白基因。其中在22 088～24 268 bp的ORF49編碼鎘轉運 ATP 酶cadA與已上傳的金黃色葡萄球菌MRSA252菌株染色體的cadA基因相似率為99.9%。17 780～19 069 bp的ORF100編碼亞砷酸鹽外排轉運蛋白膜亞基arsB基因,19 383～19 069 bp的ORF131編碼一個As(III) 感應金屬調節(jié)轉錄阻遏物arsR基因,這2個基因與已上傳的金黃色葡萄球菌UP322染色體的arsB和arsR基因的相似率為100%。26 344～27 777 bp的ORF120編碼一個多銅氧化酶mco基因,與已上傳的金黃色葡萄球菌ATCC 12 600染色體的mco基因相似率為99.79%。27 792～29 921 bp的ORF150編碼一個銅/銀轉運 P 型 ATP 酶copB基因,與已上傳的金黃色葡萄球菌S3染色體的copB相似率為100%。

3 討 論

小于10 kb的質粒使用RC機制,大于14.5 kb的質粒使用Theta模式復制,中等10至14.5 kb大小范圍內的質粒使用這2個機制中的任一種[6]。近年來,金黃色葡萄球菌的耐藥性日益嚴重[8,9],試驗通過16S rRNA基因引物[10,11]確定D353為金黃色葡萄球菌之后,提取D353質粒測序,測序結果進行序列比對分析,在序列上研究發(fā)現(xiàn)了大量的酶切位點及豐富的重金屬轉運蛋白,將測得的質粒pD353歸類于重金屬質粒。類似的重金屬質粒也被白鳳嵐的牦牛源MASR菌株和張赫的黃河污泥源的金黃色葡萄球菌報道[12, 13]。20世紀60年代和70年代的金黃色葡萄球菌菌株通常含有對β-內酰胺類抗生素和重金屬或其他無機離子產生抗藥性的質粒[14]。大量的重金屬抗性基因能夠幫助細菌更好的適應惡劣的環(huán)境[15]。序列共線性分析結果表明,測得的質粒pD353與海氏腸球菌和糞腸球菌質粒存在一定的序列同源性,溯源分析發(fā)現(xiàn)質粒pD353與意大利金黃色葡萄球菌質粒[16]的起源相同。通過對質粒復制起始蛋白repB的研究,了解到該質粒與pSK639家族質粒復制起始蛋白同源[17-23],質粒的復制起點普遍具有3個特點:支持質粒自主復制的最小的順式作用元件;前導鏈合成的起始位置;打開 DNA 雙鏈,啟動復制機制的區(qū)域[24,25]。Theta型復制質粒復制起點還包括 AT 豐富區(qū)和 Rep 蛋白結合位點,后者含有相鄰或是被插入序列間隔的串聯(lián)重復序列[26],所以串聯(lián)重復序列是復制的活性起始點所必需的[27],分析復制起始蛋白上游的串聯(lián)重復序列,判斷出質粒pD353為重金屬Theta型復制質粒。

序列的基因分析發(fā)現(xiàn)在金黃色葡萄球菌質粒pD353上存在一定數(shù)量的轉座酶和插入序列,其中包括IS3家族轉座酶、類IS6 ISSau6家族轉座酶、IS21家族轉座酶、IS30家族轉座酶和IS1182家族轉座酶。介導DNA細胞內運動的插入序列和轉座子,以及促進細胞間DNA移動的質粒、噬菌體和整合接合元件之間的相互作用[28]。這些序列元件促進了細胞內和細胞間的基因遷移,使得基因水平之間的交換成為可能[19],并且還被發(fā)現(xiàn)在調節(jié)基因表達和基因組重排方面發(fā)揮著額外的作用[29],但其具體的作用機制尚需進一步的實驗研究。

串聯(lián)重復序列對質?？截悢?shù)的調控具有重要意義,例如質粒R6K的復制起點γ中移除7個串聯(lián)重復序列中的1個,對復制并無影響,但是當刪除2個串聯(lián)重復序列會降低DNA的復制效率,刪除3個或以上就會停止質粒的復制,這似乎使得阻斷耐藥質粒的傳播獲得了可能,分析金黃色葡萄球菌質粒的rep蛋白復制方式,具有一定的指導意義。

4 結 論

質粒pD353與Genebank庫中的意大利人源金黃色葡萄球菌質粒pIT1-S,pIT4-R有較少的模塊逆轉,具有非常近的親緣關系。pD353的repB與pSK639的repB近源,trf串聯(lián)重復序列發(fā)現(xiàn)pD353的repB序列前存在Theta型復制結構的LTR和sTR,由此鑒定質粒pD353為Theta型復制pSK639家族質粒,富含3種復制起始蛋白和豐富的重金屬轉運蛋白。未在該質粒發(fā)現(xiàn)任何的抗生素抗性基因,但該質粒特殊的Theta型復制結構對于阻斷基因遷移具有較高的研究價值。