趙 薇,許彤駿,王喻元,曾艷華,周 進(jìn)

(1. 清華大學(xué) 深圳國(guó)際研究生院 海洋工程研究院,廣東 深圳 518055;2.美國(guó)考文垂教會(huì)中學(xué),波茨敦 賓夕法尼亞州 19464;3.深圳市紅嶺中學(xué),廣東 深圳 518000)

有害赤潮(HABs)是一種嚴(yán)重的全球性海洋災(zāi)害,近年來赤潮發(fā)生次數(shù)增多,發(fā)生區(qū)域擴(kuò)大,危害日益加劇。為了有效地控制HABs,研究者推出了許多措施,包括化學(xué)、物理和生物學(xué)方法[1]。化學(xué)方法則需要利用金屬、光敏劑、除草劑和其他化學(xué)品破壞藻類的正常代謝來殺死藻細(xì)胞;物理方法則需要借助超聲、膜過濾和吸附等技術(shù)來殺死藻細(xì)胞;生物學(xué)方法只需要利用自然生態(tài)中的水生動(dòng)物、植物和微生物等來殺死藻細(xì)胞。化學(xué)和物理方法雖然在一定程度上可以有效去除藻細(xì)胞,但是成本較高且容易造成二次污染。因此,具有無毒、高效、專一性強(qiáng)等特點(diǎn)的生物學(xué)方法有著明顯的優(yōu)勢(shì),已成為研究的熱點(diǎn)[2]。

溶藻細(xì)菌(algicidal bacteria)的發(fā)現(xiàn)為生物防治赤潮提供了可能的途徑。細(xì)菌對(duì)藻類的影響體現(xiàn)在：一方面,細(xì)菌吸收藻類產(chǎn)生的有機(jī)物質(zhì),并為藻類的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)鹽和必要的生長(zhǎng)因子,從而調(diào)節(jié)藻類的生長(zhǎng);另一方面,細(xì)菌也可以通過直接或間接作用抑制藻類的生長(zhǎng),甚至裂解藻細(xì)胞,從而表現(xiàn)為殺藻效應(yīng)[3]。溶藻菌在赤潮暴發(fā)過程中具有重要的作用,一些研究者認(rèn)為赤潮的終止與溶藻菌有直接的關(guān)系[4]。這類細(xì)菌分泌的胞外物質(zhì)具有高效、專一地殺死或者抑制藻類生長(zhǎng)的作用,開發(fā)利用這些溶藻菌用于赤潮的生物防控[5]是當(dāng)今最熱門的研究方向之一。近年來,針對(duì)溶藻細(xì)菌的開發(fā)取得了諸多進(jìn)展。Lovejoy 等[6]在澳大利亞分離到1株P(guān)seudoalteromonas屬細(xì)菌,該菌在3 h內(nèi)能導(dǎo)致赤潮藻Gymnodiniumcatenatum、Chattonellamarina和Heterosigmaakashiwo細(xì)胞裂解,作用機(jī)制在于向海水培養(yǎng)基釋放活性物質(zhì)而起作用。Doucette等[7]分離到1株細(xì)菌Cytophaga41-DBG2,該細(xì)菌能產(chǎn)生一種溶解性殺藻復(fù)合物從而有效地殺死Gymnodiniumbreve。Imai等[8]從Pseudomonasstutzer中提取出的甲藻生長(zhǎng)抑制劑(DGI)活性較高,且毒性較穩(wěn)定(4 ℃時(shí)3個(gè)月保持不變),并且對(duì)魚類無害,是比較理想的殺藻物質(zhì)[9]。Kodani等[10]從日本東京Shinobazu池塘中分離到12株具有殺藻活性的細(xì)菌,9株屬于Pseudoalteromonassp.,其中K44-1的甲醇提取物具有明顯的殺藻活性,進(jìn)一步從中提取到1-甲基-β咔啉,在30 μg/disc時(shí)能抑制幾種藍(lán)藻的生長(zhǎng)。關(guān)于殺藻機(jī)制,一般認(rèn)為它通過作用于生理過程如阻斷呼吸鏈、抑制細(xì)胞壁合成以及抑制孢子的形成等方面,以達(dá)到抑制藻細(xì)胞生長(zhǎng)或殺滅藻細(xì)胞的目的。

在溶藻菌株的研究歷程中,針對(duì)細(xì)菌的分離、溶藻范圍、溶藻化合物以及作用機(jī)制(直接或間接)都有了較多的積累[1]。然而,需要注意的是,細(xì)菌的行為是一種群體表現(xiàn),其功能效應(yīng)的發(fā)揮依賴一定的細(xì)胞密度,而溶藻行為的產(chǎn)生是否依賴于群體,是否受控于某種信號(hào)調(diào)節(jié)還未曾揭示。因?yàn)榧?xì)菌間存在的通訊語言——群體感應(yīng)信號(hào)(quorum sensing,QS)具有多樣化的生態(tài)功能[11]。在微生物之間,QS可引發(fā)一系列的連鎖反應(yīng),表現(xiàn)出群體效應(yīng),完成一系列單一物種不可能完成的任務(wù)。目前這一理論已對(duì)諸多生物學(xué)現(xiàn)象進(jìn)行了闡釋,如銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)毒力的形成、沙門氏菌(Salmonellasp.)耐藥性的產(chǎn)生、哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)生物熒光的出現(xiàn)以及微生物被膜(biofilm)的產(chǎn)生等[12]。早期,針對(duì)群感信號(hào)調(diào)節(jié)下的溶藻行為僅僅在銅綠微囊藻有過零星報(bào)道[13-17],而在其他藻類(如甲藻)中的作用還未曾提及。為此,我們推測(cè)群體感應(yīng)信號(hào)在溶藻活力的過程中起了一定的調(diào)節(jié)作用。為了驗(yàn)證這一假設(shè),我們從藻際微生物中篩選了溶藻菌株,并選取代表性的一種進(jìn)行重點(diǎn)研究(包括QS信號(hào)分子的檢測(cè)、QS突變株的構(gòu)建以及野生株與突變株溶藻活力比較等),以期找尋信號(hào)調(diào)節(jié)下的溶藻行為,擴(kuò)充對(duì)微生物溶藻機(jī)制的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 試劑及藻種

1.1.1 試劑

蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物,Oxoid公司;CTAB、TEMED、過硫酸銨(Thiamine. HCl),華美生物工程公司;Tris、瓊脂糖、氨芐青霉素,廈門泰京生物技術(shù)有限公司; DAPI、dNTP、IPTG、X-Gal,Promegagon公司、DNA marker,MBI Fermentas公司;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基

f/2培養(yǎng)基：NaNO375 mg、NaH2PO4·H2O 5 mg、Thiamine·HCl 0.1 mg、Na2EDTA·2H2O 4.36 mg、FeCl2·6H2O 3.15 mg、CuSO4·5H2O 0.01 mg、ZnSO4·7H2O 0.022 mg、CoCl2·6H2O 0.01 mg、MnCl2·4H2O 0.18 mg、NaMoO4·2H2O 0.006 mg、生物素 0.5 μg以及維生素B120.5 μg,陳海水定容到1 L。

LB培養(yǎng)基：NaCl 10 g、胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g,瓊脂粉 10 g(固體培養(yǎng)基),pH 7.0～7.2,去離子水定容到1 L。

LB-Amp培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基滅菌后,冷卻到50 ℃,加入氨芐青霉素至終質(zhì)量濃度為100 μg/mL。

Zobell 2216 E培養(yǎng)基：蛋白胨5 g、酵母提取物1 g、磷酸鐵0.1 g、瓊脂粉 10 g(固體培養(yǎng)基),pH 7.6～7.8,陳海水定容到1 L。

R2A培養(yǎng)基：酵母粉0.5 g、朊蛋白胨0.5 g、水解酪蛋白0.5 g、葡萄糖0.5 g、可溶性淀粉0.5 g、丙酮酸鈉0.3 g、K2HPO40.3 g、MgSO40.05 g、瓊脂粉10 g,溶解于1 L陳海水中。

1.1.3 藻種

實(shí)驗(yàn)用的藻種主要為裸甲藻(Gymnodiniumaeruginosum),由本實(shí)驗(yàn)室從自然水域中分離獲得。藻類所用培養(yǎng)液為f/2培養(yǎng)液。藻類置于室內(nèi)三角瓶中培養(yǎng),溫度為(20±1) ℃,光照條件為12 h 光照∶12 h黑暗。

1.2 樣品采集與微生物培養(yǎng)

樣品采自深圳海域自然發(fā)生的裸甲藻赤潮。用采樣瓶裝取含有赤潮的表層水樣,然后置于冷藏箱中立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。經(jīng)梯度(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6)稀釋后取稀釋液50 μL涂布于R2A固體培養(yǎng)基。將平板置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～7 d,挑取菌落形態(tài)有差異的(大小、形狀、顏色、表面等)單克隆轉(zhuǎn)接到R2A固體培養(yǎng)基。經(jīng)過進(jìn)行1～2次純化后,將純化的菌株用固體斜面培養(yǎng)基4 ℃保存。

1.3 菌株鑒定

利用基因組提取試劑盒EasyPure Genomic DNA Kit(北京全式金生物技術(shù)股份有限公司)提取菌株的基因組DNA。16S rRNA基因擴(kuò)增采用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系為25 μL,之后通過10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,目的片段大小在1 500 bp左右的PCR產(chǎn)物送至深圳華大基因科技有限公司測(cè)序。將得到的基因序列與EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)(https：∥www.ezbiocloud.net/identify)中的序列進(jìn)行同源性比對(duì),取相似度最高的作為細(xì)菌參考分類。

1.4 溶藻活力及藻細(xì)胞酶活測(cè)定方法

將純化后的細(xì)菌接種于50 mL Zobell 2216E液體培養(yǎng)基中,28 ℃、150 r/min搖瓶培養(yǎng)至培養(yǎng)基耗盡(約培養(yǎng)至48 h),取40 mL進(jìn)行離心,離心后的上清液過0.22 μm濾膜得到無菌濾液,參照文獻(xiàn)[18]的方法按照1%的接種量加入指數(shù)生長(zhǎng)的裸甲藻培養(yǎng)液中。定時(shí)取樣,參照文獻(xiàn)[19]介紹的方法采用FDA染色計(jì)活細(xì)胞數(shù),按式(1)計(jì)算殺藻率。以不添加任何物質(zhì)的無菌藻培養(yǎng)液作為對(duì)照,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

殺藻率=(NC-NT)/NC×100%

(1)

式中：NC表示對(duì)照組中的活細(xì)胞數(shù),NT表示實(shí)驗(yàn)組中的活細(xì)胞數(shù)。

采用浮游植物熒光儀PhytoPam (德國(guó)WALZ公司)并行分析實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的葉綠素含量(μg/L)。

添加濾液后繼續(xù)培養(yǎng)藻類24 h(此時(shí)藻細(xì)胞接近指數(shù)后期,密度約為2.0×104個(gè)/mL),取50 mL藻液10 000g離心10 min收集藻體,用于以下指標(biāo)的測(cè)定。

丙二醛(MDA)含量測(cè)定：收集的藻細(xì)胞加入等體積的三氯乙酸與硫代巴比妥酸,煮沸 20 min,迅速冷卻,5 000 r/min離心5 min后,分別測(cè)定450、532和600 nm處的吸光值A(chǔ)450、A532和A600。樣品中 MDA含量的計(jì)算見式(2)。

c=6.45(A532-A600)-0.56A450

(2)

式中：c為MDA的濃度,μmol/L,A為吸光值[20]。

超氧化物歧化酶(SOD)活力測(cè)定：向離心后的藻細(xì)胞加入預(yù)冷至4 ℃的pH 7.8的磷酸緩沖液(含1% 聚乙烯吡咯烷酮PVP和0.25% Triton-100)和少量石英砂冰浴研磨,勻漿液7 000 r/min離心10 min,取上清液測(cè)定酶活性。按照試劑盒(南京建成生物科技有限公司)的方法測(cè)定SOD活性。

SOD活性=(A0-As)Vt/(0.5A0×cells×Vs)

(3)

式中：A0為對(duì)照管的吸光值,As為樣品管的吸光值,Vt為樣液總體積,Vs為測(cè)定時(shí)樣品用量。

1.5 群體感應(yīng)信號(hào)AHL的檢測(cè)方法

采用薄層色譜法(TLC)分析AHL信號(hào)分子。菌株在搖瓶發(fā)酵24 h后收集上清液(1 L),采用乙酸乙酯進(jìn)行萃取,其步驟：向離心后的上清液中加入等體積的乙酸乙酯(含0.2%冰醋酸)并充分振蕩,靜置分層后再次充分振蕩,待液體靜置再分層后,收集上層有機(jī)相;取下層水相重復(fù)萃取2次,然后合并3次萃取的所有上層有機(jī)相;采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將全部萃取液蒸發(fā)至干燥,最后用1 mL乙酸乙酯(含0.2%冰醋酸)重新溶解蒸餾燒瓶底部的萃取物,得到的AHL萃取液置于-20 ℃保存。

AHL信號(hào)分子的判斷通過TLC確定[21]。首先通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定AHL標(biāo)準(zhǔn)品和萃取液的最佳上樣量,能夠使A136(Agrobacteriumtumefaciens136)產(chǎn)生明顯顏色反應(yīng)的AHL萃取液或AHL標(biāo)準(zhǔn)品的最小上樣量即為TLC分析的最佳上樣量。本研究中使用AHL標(biāo)準(zhǔn)品(C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL和3-O-C8-HSL,Sigma公司)為對(duì)照進(jìn)行TLC分析,步驟如下：首先在TLC平板(20 cm×20 cm TLC aluminum sheets;RP-18 F254 S,Merck公司)底部距離下邊緣2 cm處用鉛筆和直尺輕輕劃一條直線;分別取AHL標(biāo)準(zhǔn)品與AHL萃取液以2 cm的間距點(diǎn)樣品(按照確定好的最佳上樣量)到直線上;上樣完畢后,將TLC平板置于含有甲醇和水(體積比為60∶40)的展層劑中(展層劑不要沒過直線),待展層劑到達(dá)距離TLC平板上邊緣約2 cm處時(shí)將平板拿出;待平板完全吹干后置于平底容器中,并向平板上傾倒含有A136菌液的軟瓊脂(配制方法與最佳上樣量實(shí)驗(yàn)一致)。待瓊脂凝固后均勻涂布X-Gal,用錫箔紙覆蓋TLC平板所在的容器并置于28 ℃培養(yǎng)24 h。通過與AHL標(biāo)準(zhǔn)品比較來確定AHL萃取液中的信號(hào)分子結(jié)構(gòu)。

1.6 AHL突變株與回補(bǔ)株的構(gòu)建方法

分子克隆與原核表達(dá)、基因敲除與回補(bǔ)等遺傳操作實(shí)驗(yàn)用到的大腸桿菌和質(zhì)粒見文獻(xiàn)[21]。所有大腸桿菌均在37 ℃下LB培養(yǎng)基中培養(yǎng),必要時(shí)需向培養(yǎng)基中添加氨芐青霉素(100 μg/mL)、卡那霉素(50 μg/mL)或四環(huán)素(5 μg/mL)。AHL報(bào)告菌株AgrobacteriumtumefaciensA136(pCF218)(pCF372)通常在28 ℃下含有壯觀霉素(50 μg/mL)和四環(huán)素(4.5 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

為了探究AHL對(duì)溶藻活力的調(diào)控作用,以YTD5-新鞘氨醇桿菌為例,通過框內(nèi)缺失突變法(in-frame deletion)對(duì)菌株的AHL功能基因進(jìn)行了敲除[22]。用來構(gòu)建突變株的引物序列見文獻(xiàn)[21]附表Ⅱ。敲除步驟：首先分別擴(kuò)增待敲除基因兩側(cè)的序列(片段大小500～1 000 bp為宜),通過第二輪融合PCR將這兩個(gè)側(cè)翼序列連接在一起;然后利用事先設(shè)計(jì)好的雙酶切位點(diǎn)將此融合片段克隆到自殺質(zhì)粒pAK405上,并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coliS17-1/λpir中;最后通過接合轉(zhuǎn)移的方式轉(zhuǎn)入菌株SZD1-新鞘氨醇桿菌中。染色體上的突變整合利用卡那霉素(50 μg/L)篩選,并用菌落PCR的方法驗(yàn)證。把經(jīng)證實(shí)的轉(zhuǎn)化結(jié)合子在不含抗生素的R2A液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),然后稀釋涂布在含有鏈霉素(100 μg/L)的R2A平板上;隨后,為了獲得目標(biāo)基因敲除的菌株,利用PCR的方法對(duì)卡那霉素敏感且耐受鏈霉素的菌株進(jìn)行篩選。最后,通過對(duì)突變區(qū)域測(cè)序的方式來驗(yàn)證這些篩選出來的突變株。

在進(jìn)行基因回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)時(shí),首先利用文獻(xiàn)[21]附表Ⅱ中的相應(yīng)引物擴(kuò)增目的基因及其自身啟動(dòng)子序列,進(jìn)而利用無縫連接試劑盒將此擴(kuò)增片段與pCM62連接,然后將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到目的基因已敲除的突變株中獲得回補(bǔ)株,最后,通過菌落PCR及四環(huán)素抗性來驗(yàn)證基因回補(bǔ)是否成功。

1.7 野生株、突變株與回補(bǔ)株溶藻能力檢測(cè)方法

挑取野生株YTD5-新鞘氨醇桿菌、QS突變株及QS回補(bǔ)株的單克隆分別接種在R2A液體培養(yǎng)基中,于200 r/min、28 ℃條件下過夜振蕩培養(yǎng);當(dāng)細(xì)菌生物量(OD600)達(dá)到0.9左右時(shí),收集上清液,再檢測(cè)溶藻活力,每個(gè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組設(shè)置3個(gè)平行。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析包含3個(gè)重復(fù)數(shù)據(jù),結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,以P值表示差異性(P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著)。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶藻細(xì)菌的篩選與鑒定

將篩選到可培養(yǎng)的單克隆菌株121株,通過細(xì)菌培養(yǎng)物添加實(shí)驗(yàn)獲得具有溶藻活力的菌株17株。使用16S序列分析并去除重復(fù)后,共得到10株細(xì)菌(序號(hào)為YTD1～YTD10)。序列經(jīng)GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后,以同源性不小于99.9%為判斷依據(jù),共獲得10株陽性菌株。經(jīng)鑒定均屬于變形菌門(Proteobacteria)的α-變形菌綱(α-Proteobacteria)和γ-變形菌綱(γ-Proteobacteria),分屬于5個(gè)屬,其中,菌株YTD1、YTD2和YDD3屬于交替假單胞菌屬(Pseudoalteromonassp.);菌株YTD4、YTD6和YTD9屬于假單胞菌屬(Pseudomonassp.);YTD7和YTD8屬于弧菌屬(Vibriosp.);菌株YTD5和YTD10分別為新鞘氨醇桿菌(Novosphingobiumsp.)和鞘氨醇單胞菌(Sphingomonassp.),結(jié)果統(tǒng)計(jì)于表1。

表1 菌株的鑒定

2.2 殺藻細(xì)菌的作用方式

不同菌株的溶藻活力如圖1所示。由圖1可知：在所有細(xì)菌的2216E培養(yǎng)液上清均具有一定的抑藻能力,表明它們是通過間接方式溶藻,尤其以YTD5菌株——新鞘氨醇桿菌的溶藻作用最為明顯,溶藻能力大于90%。為了探究溶藻細(xì)菌對(duì)目標(biāo)藻類的殺滅能力,以溶藻能力最強(qiáng)的菌株——YTD5(Novosphingobiumsp. D5)為例,考察共培養(yǎng)過程中對(duì)藻細(xì)胞的形態(tài)影響,結(jié)果如圖2所示。由圖2可知：添加了細(xì)菌濾液后,藻首先沉降于培養(yǎng)瓶底,隨著時(shí)間延長(zhǎng),藻細(xì)胞逐漸收縮,殼板分離,細(xì)胞質(zhì)變得較為致密,此時(shí)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)減弱,內(nèi)部結(jié)構(gòu)變得無序;接著殼板破裂,內(nèi)容物釋放,藻細(xì)胞崩解,直至死亡。

圖1 不同菌株的溶藻活力Fig.1 The algicidal rate of ten strains

a～e—添加溶藻細(xì)菌后不同階段的藻細(xì)胞;f—正常藻細(xì)胞圖2 添加溶藻細(xì)菌后藻細(xì)胞的形態(tài)變化Fig.2 Morphological changes of algal cell after adding algicidal bacteria

為了獲得生理水平的機(jī)制,研究了代表性菌株YTD5菌株對(duì)裸甲藻的生理影響,結(jié)果如圖3所示。由圖3可知：溶藻細(xì)菌培養(yǎng)物濾液的加入使宿主的膜脂過氧化產(chǎn)物MDA含量升高,且呈現(xiàn)添加劑量的依賴性,其中當(dāng)添加量達(dá)到4%時(shí)與對(duì)照組相比呈現(xiàn)極顯著差異(P<0.01),說明溶藻菌濾液的加入促使藻細(xì)胞發(fā)生了膜脂過氧化;對(duì)于藻細(xì)胞超氧物歧化酶(SOD)活性的變化情況則是先升后降的趨勢(shì),隨著添加劑量的上升,SOD活性也上升,至2%的添加量時(shí)達(dá)到最大值(P<0.01),當(dāng)添加量達(dá)到4%時(shí),SOD活性反而呈現(xiàn)下降趨勢(shì),回落到與對(duì)照組無明顯差異的狀態(tài)(P>0.05),這一先升后降的過程表明,裸甲藻的生理穩(wěn)態(tài)受到了溶藻細(xì)菌胞外濾液的擾動(dòng);溶藻菌濾液的葉綠素含量顯著降低,除了0.5%的劑量組沒有呈現(xiàn)明顯差異外,其余劑量組(1%、2%和4%)的添加使得葉綠素含量分別下降了30%、50%和70%(P<0.05)。

圖3 不同比例的溶藻菌濾液對(duì)裸甲藻MDA濃度、SOD活性以及藻細(xì)胞葉綠素含量的影響Fig.3 Effects of different addition of bacterial filtrate on MDA content,SOD activity,and chlorophyl concentration of target algae

2.3 溶藻細(xì)菌群體感應(yīng)信號(hào)能力的檢測(cè)

對(duì)10株細(xì)菌代謝產(chǎn)物的抽提物進(jìn)行TLC檢測(cè),鑒定其分泌的AHL信號(hào)類型,結(jié)果如圖4所示。由圖4可知：有8株細(xì)菌具有明顯的斑點(diǎn)顯色能力,說明具有產(chǎn)高絲氨酸內(nèi)酯的能力,經(jīng)過與AHL標(biāo)準(zhǔn)品的比對(duì)和薄層遷移速率分析后發(fā)現(xiàn),其產(chǎn)物主要為C8-HSL、C8-O-HSL以及C10-HSL 3種AHL分子,其中弧菌屬(YTD7和YTD8)具有產(chǎn)2種或3種信號(hào)分子的能力(C8-HSL、C8-O-HSL或C10-HSL),而交替假單胞菌(YTD2)和假單胞菌(YTD9)在TLC上的沒有顯色或者很弱,我們目前還不能完全排除這2株菌不具有產(chǎn)信號(hào)的能力,可能的原因是抽提物濃度太低,未達(dá)到TLC方法的檢測(cè)限。

S為AHL標(biāo)準(zhǔn)品,YTD1～YTD10為待檢菌株圖4 TLC分析菌株產(chǎn)AHL的能力Fig.4 Quorum sensing (acyl-homoserine lactones) test of the five strains

2.4 群體感應(yīng)信號(hào)對(duì)溶藻活力的調(diào)節(jié)作用

基于YTD5新鞘氨醇桿菌溶藻能力最強(qiáng),其AHL分泌的能力也相對(duì)突出,因此選擇該菌株進(jìn)行突變株的構(gòu)建,并評(píng)估了QS信號(hào)對(duì)溶藻活力的調(diào)節(jié)作用。通過框內(nèi)缺失突變法敲除了菌株的2個(gè)QS基因(novI、novR),得到QS突變株ΔnovI/R,并通過平板劃線進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果見圖5。由圖5可知：野生株能夠在24 h內(nèi)使AHL報(bào)告菌A136產(chǎn)生顯著的顯色反應(yīng),表現(xiàn)出AHL活性;與野生株相比,突變株在經(jīng)過48 h后依舊只有很弱的產(chǎn)信號(hào)能力,說明信號(hào)基因的缺失導(dǎo)致了信號(hào)產(chǎn)生能力的喪失;同時(shí)也表明QS突變株被成功構(gòu)建。

圖5 野生株及其突變株產(chǎn)信號(hào)能力的檢測(cè)Fig.5 Quorum sensing detection of wild type and mutant of YTD5-Novosphingobium sp.

為了評(píng)估QS對(duì)溶藻活力的調(diào)控作用,比較了野生株和QS突變株之間溶藻能力的差異,結(jié)果如圖6所示。由圖6可知：以1%的添加量為例,野生株YTD5在12 h內(nèi)顯示出對(duì)裸甲藻生長(zhǎng)抑制的能力,溶藻率超過75%;而突變株的溶藻能力明顯下降,至觀察點(diǎn)結(jié)束(72 h)也未看到明顯的抑藻作用,溶藻能力始終低于10%?；匮a(bǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)當(dāng)ΔnovI/R基因通過回補(bǔ)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到相應(yīng)突變株,其對(duì)應(yīng)回補(bǔ)株ΔnovI/R(pC)的溶藻能力得到了恢復(fù)。這表明QS基因的敲除顯著降低了溶藻能力,說明QS在溶藻作用中起正調(diào)控作用。

圖6 QS信號(hào)的缺失對(duì)溶藻活力的影響Fig.6 Effects of QS signal on algicidal activity

2.5 討論

溶藻細(xì)菌是一類以直接或間接方式抑制或殺死藻類的細(xì)菌統(tǒng)稱。雖然近年來發(fā)現(xiàn)多株海洋殺藻細(xì)菌,但所檢測(cè)到的殺藻多集中在少數(shù)幾個(gè)類群,已知的殺藻細(xì)菌主要屬于Bacteroidetes和γ-Proteobacteria,包括Cytophaga、Saprospira、Flavobacterium、Zobellia和Pseudoalteromonas、Alteromonas、Vibrio、Shewanella,這些細(xì)菌都是革蘭氏陰性細(xì)菌[23],偶有革蘭氏陽性細(xì)菌的報(bào)道[24]。本研究中篩選得到多株殺藻細(xì)菌,均屬于變形菌門(Proteobacteria)的α-變形菌綱(α-Proteobacteria)和γ-變形菌綱(γ-Proteobacteria),包括交替假單胞菌屬(Pseudoalteromonassp.)、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、弧菌屬(Vibriosp.)、新鞘氨醇桿菌屬(Novosphingobiumsp.)以及鞘氨醇單胞菌(Sphingomonassp.)。γ-變形菌綱在生態(tài)系統(tǒng)中常常是K策略生存者[25],這表明溶藻細(xì)菌通常具有較強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)能力,包括對(duì)宿主的抑制或者殺滅。此外,考慮到海洋中絕大多數(shù)細(xì)菌尚未能被培養(yǎng),因此還存在著大量細(xì)菌資源等待挖掘。

殺藻細(xì)菌的作用方式時(shí)常有2種情形：一是需要接觸的直接殺藻,二是不需要接觸的間接殺藻。前者是殺藻細(xì)菌,能夠直接進(jìn)攻并殺死藻細(xì)胞,后者則是通過分泌殺藻物質(zhì)(agicidal substance)來殺死藻細(xì)胞。常見的殺藻細(xì)菌中,Saprospira和Cytophaga主要是接觸殺藻;Alteromonas和Pseudoalteromonas主要是間接殺藻[19]。本研究篩選得到的10株殺藻細(xì)菌的2216E培養(yǎng)液均能有效地抑制藻類,屬于間接殺藻。Alteromonasstrain K and D、Pseudoalteromonassp. T827/2B、Pseudoalteromonassp. A28也以同種的方式殺藻[8,26-27]?，F(xiàn)今越來越多的證據(jù)表明：非接觸型間接殺藻在溶藻方式中占的比例更大,且在實(shí)際的應(yīng)用中也更具優(yōu)勢(shì)。需要指出的是,雖然我們發(fā)現(xiàn)了溶藻效應(yīng),但對(duì)溶藻活性物質(zhì)還未曾得知,在后續(xù)的工作中將采用液相色譜和核磁共振的方式對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行鑒定,明確具體的活性成分。

藻類在逆境條件下常發(fā)生膜脂過氧化作用,MDA是其產(chǎn)物之一,通常利用它作為脂質(zhì)過氧化指標(biāo),以表征細(xì)胞膜脂過氧化程度和藻類對(duì)逆境條件反應(yīng)的強(qiáng)弱[20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),未添加無菌濾液的對(duì)照組,其MDA濃度維持在較低水平(0.1 μmol/L左右),說明藻細(xì)胞膜脂未受到損傷;而當(dāng)加入無菌濾液后,MDA濃度開始顯著升高,說明藻細(xì)胞膜脂過氧化水平有明顯響應(yīng),表明溶藻菌無菌濾液的加入誘發(fā)了藻細(xì)胞膜脂的過氧化狀態(tài),致使膜的通透性和抗穩(wěn)定性受到損傷,從而加大了細(xì)胞內(nèi)溶物外滲的風(fēng)險(xiǎn)。在不同的添加劑量中,可以看到明顯的濃度依賴性,表明可能的殺藻機(jī)制是使藻細(xì)胞膜受到損傷,進(jìn)而導(dǎo)致藻細(xì)胞裂解。

與此同時(shí),活性氧(ROS)也是對(duì)藻類造成氧化傷害的原因之一[28]。SOD是抗氧化系統(tǒng)中主要的酶類,它通過清除細(xì)胞中的ROS來消除或減輕氧化損傷[29]。本研究結(jié)果表明,當(dāng)加入0.5%的溶藻菌濾液時(shí),藻的SOD活性顯著升高,說明藻體啟動(dòng)自我保護(hù),通過提高SOD活性應(yīng)對(duì)外界壓力;當(dāng)添加量超過4%時(shí),抗氧化酶類活性受到極限脅迫,從而活性明顯降低。這表明殺藻細(xì)菌分泌的胞外物質(zhì)能夠引起藻細(xì)胞的ROS積累,并干擾其抗氧化系統(tǒng)。事實(shí)上,在前期的文獻(xiàn)中也報(bào)道了類似的結(jié)果。如,張冬慧[30]發(fā)現(xiàn),溶藻菌WS8胞外活性物質(zhì)的施入,會(huì)使銅綠微囊藻SOD活性隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。吳培楓等[31]用溶藻菌Halomonasp.DH-e無菌濾液處理東海原甲藻,也發(fā)現(xiàn)不同濃度的無菌濾液可以使甲藻SOD活性呈現(xiàn)一定的趨勢(shì)變化,本研究結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了前人的結(jié)果。由此可以推測(cè),溶藻物質(zhì)的存在引起了藻細(xì)胞膜脂過氧化的加劇及抗氧化系統(tǒng)的紊亂,最終導(dǎo)致生長(zhǎng)抑制或細(xì)胞裂解的發(fā)生。

QS信號(hào)是細(xì)菌之間的密度調(diào)節(jié)分子,其中尤以AHLs信號(hào)研究的最為廣泛。QS可調(diào)節(jié)菌群的密度和級(jí)聯(lián)行為并實(shí)現(xiàn)單個(gè)微生物無法完成的生態(tài)功能[32],在菌株特性、生物膜的形成、生態(tài)系統(tǒng)的發(fā)生以及環(huán)境適應(yīng)性上具有重要作用[33]。本研究篩選到的溶藻細(xì)菌具有產(chǎn)至少一種AHL的能力,且均分布在α-變形菌綱和γ-變形菌綱。這一結(jié)果與Case等[34]僅在變形菌門的基因組中發(fā)現(xiàn)了LuxI和LuxR同源蛋白是一致的。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)的群體感應(yīng)信號(hào)類型主要是中長(zhǎng)鏈的高絲氨酸內(nèi)酯,例如3-O-C8-HSL,它是單胞菌屬產(chǎn)生的一類最主要的AHL信號(hào)分子[35]。需要指出的是,本研究沒有檢測(cè)到假單胞菌的AHL信號(hào),而前人的結(jié)果中報(bào)道該菌是常見的信號(hào)菌[36],這可能是本研究中提取的信號(hào)分子濃度不夠,沒有達(dá)到TLC的檢測(cè)限,后續(xù)我們將進(jìn)一步提高萃取量進(jìn)行二次驗(yàn)證。

為了驗(yàn)證群體感應(yīng)信號(hào)對(duì)溶藻活力的調(diào)節(jié)作用,本研究通過框內(nèi)缺失突變法敲除了菌株YTD5新鞘氨醇桿菌的QS基因(novI、novR),得到QS突變株ΔnovI/R。平行劃線檢測(cè)法顯示野生株能夠產(chǎn)生顯著的顯色反應(yīng),而突變株只有很弱的產(chǎn)信號(hào)能力,這表明我們成功構(gòu)建了QS突變株。溶藻活力的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證實(shí),QS基因的敲除顯著降低了菌株的溶藻率,說明QS在溶藻能力上起正調(diào)控作用。以往的研究發(fā)現(xiàn)溶藻能力受細(xì)菌生理、宿主狀態(tài)和環(huán)境因子多種機(jī)制調(diào)控,而信號(hào)作用下的受調(diào)控機(jī)制還不清楚。本研究采用QS基因敲除的方式,初步證實(shí)了QS對(duì)溶藻的正向調(diào)控作用,擴(kuò)充了QS調(diào)節(jié)下細(xì)菌生理行為。

針對(duì)QS調(diào)節(jié)溶藻活力的行為,前期有一些零星的探索。Wu等[14]報(bào)道了芽孢桿菌Bacillussp. strain S51107利用NprR-NprX型QS系統(tǒng)調(diào)節(jié)對(duì)銅綠微囊藻的殺滅作用。與此同時(shí),Guo等[17]也證實(shí)了氣單胞菌Aeromonassp. GLY-2107利用C4和C6短鏈AHL分子調(diào)節(jié)對(duì)銅綠微囊藻的裂解能力,原因在于AHL控制了溶藻物質(zhì)3-芐基哌嗪-2,5-二酮和3-甲基吲哚的合成。Chi等[15]證實(shí)從東海原甲藻微藻中分離得到的菌株P(guān)onticoccussp. PD-2具有抑制多種藻類(球形棕囊藻、亞歷山大藻)的能力,且該菌的溶藻能力依賴于高絲氨酸內(nèi)酯,因?yàn)樵撔盘?hào)會(huì)影響殺藻代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。Chi等[15]認(rèn)為,QS調(diào)節(jié)的殺藻系統(tǒng)可能在赤潮分解過程中發(fā)揮潛在作用,QS信號(hào)有望作為防控赤潮的一種潛在方法。在硅藻中,交替假單胞菌Pseudoalteromonaspiscicida利用QS信號(hào)——2′-庚基-4-喹諾酮調(diào)節(jié)對(duì)顆石藻Emilianiahuxleyi的溶解能力[37]以及高效溶藻菌FDHY-C3利用信號(hào)調(diào)節(jié)中肋骨條藻的裂解[38]。

例如,溶藻弧菌利用QS系統(tǒng)可影響抑藻活力和宿主對(duì)Fe的獲取機(jī)制[39],在甲藻的藻際環(huán)境中,還未曾有過專門的報(bào)道。我們猜測(cè)溶藻細(xì)菌借助QS信號(hào)調(diào)節(jié)與宿主的關(guān)系,這對(duì)幫助我們理解藻菌共生關(guān)系和赤潮的消亡機(jī)制具有重要意義[40]。然而,現(xiàn)實(shí)的結(jié)論還需進(jìn)一步的驗(yàn)證。

3 結(jié)論

通過藻際樣品的微生物分離,酶活性檢測(cè)以及群體感應(yīng)信號(hào)突變株的構(gòu)建,可以得到如下結(jié)論：

1)從藻際環(huán)境中篩選得到10株能殺藻的海洋細(xì)菌,經(jīng)鑒定分屬于交替假單胞菌屬(Pseudoalteromonassp.)、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、弧菌屬(Vibriosp.)、新鞘氨醇桿菌屬(Novosphingobiumsp.)以及鞘氨醇單胞菌(Sphingomonassp.);殺藻作用方式研究表明主要是間接殺藻。

2)殺藻機(jī)制初步研究表明新鞘氨醇桿菌YTD5培養(yǎng)物濾液的加入使裸甲藻的膜脂過氧化產(chǎn)物MDA含量明顯升高,而藻的SOD含量則呈先升后降的變化。這表明膜的穩(wěn)定性和抗氧化狀態(tài)的平衡是引發(fā)藻類生長(zhǎng)受限或細(xì)胞裂解的潛在原因。

3)通過對(duì)溶藻菌新鞘氨醇桿菌YTD5的基因突變證實(shí)溶藻能力的高低受到群體感應(yīng)信號(hào)的調(diào)節(jié),表明信號(hào)分子對(duì)溶藻活力具有正向調(diào)節(jié)作用,這為后續(xù)改造溶藻菌株提供了思路,例如開發(fā)底盤細(xì)菌,利用合成生物學(xué)手段對(duì)其進(jìn)行改造。