李劉若蘭,張程程,劉秉書,于雷雷,田豐偉,陳衛(wèi),翟齊嘯

(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無(wú)錫,214122)

假小鏈雙歧桿菌(Bifidobacteriumpseudocatenulatum)在各個(gè)年齡段人群中普遍存在,是中國(guó)人群腸道中的優(yōu)勢(shì)雙歧桿菌[1]。據(jù)報(bào)道腸道中長(zhǎng)雙歧桿菌和假小鏈雙歧桿菌在中國(guó)兒童[2]、成年人[3]以及健康老人[4]的腸道中占據(jù)了豐度優(yōu)勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn),假小鏈雙歧桿菌能調(diào)節(jié)胰島素抵抗肥胖兒童的炎癥狀態(tài)和血脂水平[5]、改善肥胖表型[6]。假小鏈雙歧桿菌C95[7]、MY40C和CCFM680[8]菌株能改善葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠的疾病表型。在食品工業(yè)的應(yīng)用上,假小鏈雙歧桿菌通過分泌植酸酶[9]、β-葡萄糖苷酶從而提高人體對(duì)面包礦物質(zhì)、對(duì)異黃酮的利用率,展現(xiàn)了作為食品發(fā)酵劑的潛力。

發(fā)酵碳水化合物是腸道中大部分細(xì)菌所必須的代謝過程[10]。雙歧桿菌對(duì)碳水化合物的利用一直以來(lái)是研究的重點(diǎn),雙歧桿菌能利用多種膳食來(lái)源的寡糖,如:低聚果糖(fructooligosaccharide,FOS)、低聚半乳糖(galactooligosaccharides,GOS)、低聚木糖等,以及母乳寡糖和少數(shù)淀粉類多糖[11]。與碳水化合物利用相關(guān)的基因在雙歧桿菌基因組中的比例為12%～14%,高于其他腸道菌群的比例[12],這使得它們可以代謝各種宿主無(wú)法消化的碳水化合物,從而能夠?yàn)殡p歧桿菌的定殖提供優(yōu)勢(shì)。人的腸道中含有大量復(fù)雜的碳水化合物,而這些不被人體消化的寡糖或多糖最終會(huì)成為腸道菌群的底物。通過競(jìng)爭(zhēng)有限的碳源,這些腸道菌群得以存活和定殖。

MILANI研究發(fā)現(xiàn),構(gòu)成雙歧桿菌的主要碳源代謝途徑“Bifid Shunt”的基因?qū)儆诤诵幕蚪M,許多碳水化合物利用基因具有物種特異性[13]。假小鏈雙歧桿菌具有豐富的碳水化合物代謝基因結(jié)構(gòu),可利用大豆異黃酮苷[14]降解復(fù)雜植物多糖等[15]。長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種能專門代謝成人飲食中發(fā)現(xiàn)的特定植物聚糖,大量的文獻(xiàn)也揭示了雙歧桿菌對(duì)母乳寡糖的利用[15]。但在過往的報(bào)道中,大多數(shù)研究都集中在單株假小鏈雙歧桿菌上,缺少對(duì)假小鏈雙歧桿菌碳水化合物利用的整體研究。

了解不同假小鏈雙歧桿菌菌株對(duì)碳水化合物的利用及差異,找到對(duì)其具有促生長(zhǎng)作用的碳水化合物從而提高在人腸道中的豐度,找到碳水化合物利用能力較強(qiáng)的假小鏈雙歧桿菌菌株,有助于確定不同種類的碳水化合物如何搭配合適的合生元配方。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 細(xì)菌菌株

本研究使用的12株來(lái)自人體的假小鏈雙歧桿菌信息如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)菌株信息Table 1 Strains information

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

低聚半乳糖,新金山生物科技股份有限公司;菊粉,上海麥克林生化科技有限公司;葡萄糖、乳糖、木糖、D-半乳糖、蔗糖、D-麥芽糖、甘露糖、海藻糖、低聚果糖、D-果糖,D-阿拉伯糖,纖維二糖、甘露醇,L-鼠李糖,可溶性淀粉以及mMRS中的其他化學(xué)品,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒,中國(guó)北京天根生物技術(shù)有限公司;糞便基因組提取試劑盒,美國(guó)MP公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高壓蒸汽滅菌鍋SX-500,日本Tomy Digital Biology公司;厭氧工作站AW500SG DG250,英國(guó)Etectrotek公司;酶標(biāo)儀MULTISCAN GO,賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;全自動(dòng)酶標(biāo)儀Infinite F50,瑞士Tecan公司;超低溫冰箱Thermo-994,美國(guó)Thermo Fisher科技公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基及試劑配制

參考文獻(xiàn)方法[16]配制mMRS培養(yǎng)基。

不同碳源培養(yǎng)基:配制不含葡萄糖的mMRS液體培養(yǎng)基。將菊粉、乳糖、D-半乳糖、蔗糖、L-鼠李糖、葡萄糖、D-麥芽糖、木糖、纖維二糖、FOS、GOS、甘露糖、D-阿拉伯糖、海藻糖、D-果糖、甘露醇和可溶性淀粉等17種碳源制成濃度為1 g/10 mL的糖液經(jīng)濾膜過濾后加入無(wú)糖mMRS中,使糖終濃度為10 g/L。

溴甲酚紫母液的配制:使用無(wú)水乙醇溶解,用水定容(如配制20 mL 0.5%溴甲酚紫溶液,將0.1 g固體溴甲酚紫稱于50 mL離心管中,加入4 mL無(wú)水乙醇溶解,反復(fù)吹打,定容至20 mL,1 L培養(yǎng)基中加入15 mL母液)。

體外發(fā)酵GMM培養(yǎng)基:參考GOODMAN等[17]的方法配制GMM培養(yǎng)基并進(jìn)行體外發(fā)酵實(shí)驗(yàn),參考LIKOTRAFITI等[18]的方法確定接種量為109CFU/mL活菌。

1.3.2 碳水化合物利用實(shí)驗(yàn)

1.3.2.1 菌株活化與培養(yǎng)

將冷藏于-80 ℃的保菌管取出,于厭氧工作站中培養(yǎng)18～24 h,37 ℃,活化2～3代后開始實(shí)驗(yàn)。菌株培養(yǎng)后,取1 mL菌液,8 000 r/min離心5 min,等體積無(wú)菌生理鹽水重懸。

1.3.2.2 實(shí)驗(yàn)菌株的碳源利用能力測(cè)定

參考文獻(xiàn)方法[19]進(jìn)行碳源利用能力測(cè)定。在不同碳源培養(yǎng)基中加入溴甲酚紫溶液,將菌液按接種量1%加入96孔板中,培養(yǎng)24 h,每隔2 h觀察記錄一次顏色變化,若顏色由紫變黃,即pH≤5.2,則說(shuō)明該菌株可以利用該碳源進(jìn)行代謝。

1.3.2.3 實(shí)驗(yàn)菌株在不同碳源培養(yǎng)基中代時(shí)的測(cè)定

參考文獻(xiàn)方法[16]進(jìn)行代時(shí)的測(cè)定。代時(shí)計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

式中:G表示雙歧桿菌的生長(zhǎng)代時(shí);A0表示進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)菌株的初始吸光度;At表示t時(shí)刻雙歧桿菌吸光度。

1.3.2.4 實(shí)驗(yàn)菌株在不同碳源培養(yǎng)基中吸光度OD600值的測(cè)定

以1%的接種量將菌懸液分別接種到各種碳源培養(yǎng)基中,37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h取出,利用酶標(biāo)儀測(cè)定OD600值。以葡萄糖為碳源的mMRS和去糖mMRS作為陽(yáng)性和陰性實(shí)驗(yàn)組。

1.3.3 雙歧桿菌在人糞便體外發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況測(cè)定

將各菌株接入GMM培養(yǎng)基后,置于厭氧工作站中分別孵育0、24 h,結(jié)束后取出置于冰上15 min終止發(fā)酵,轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存?zhèn)溆?。測(cè)試之前放于冰上解凍,樣品經(jīng)過10 000×g、4 ℃離心10 min后,取沉淀使用糞便基因組DNA提取試劑盒提取DNA用于定量PCR,通過絕對(duì)定量分析糞便中雙歧桿菌的豐度變化。

1.3.3.1 糞便基因組提取

快速糞便基因組提取試劑盒用于從糞便樣本中提取細(xì)菌基因組DNA,糞便基因組DNA提取方法參考肖越[20]的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。

1.3.3.2 雙歧桿菌的絕對(duì)定量

參考文獻(xiàn)方法[20]進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建及絕對(duì)定量操作。假小鏈雙歧桿菌的種特異性引物[21](BiCAT-1:CGGATGCTCCGACTCCT,BiCAT-2:CGAAGGCTTGCTCCCGAT,序列5′-3′,退火溫度65 ℃,產(chǎn)物長(zhǎng)度285 bp)。簡(jiǎn)述定量PCR反應(yīng)體系與擴(kuò)增程如下:20 μL體系,2×supermix(BIO-RAD)10 μL,DNA模板2 μL,上下游引物各2 μL,ddH2O(PCR級(jí)水)4 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?95 ℃,2 min;95 ℃、5 s,65 ℃、30 s;建立融解曲線:65～95 ℃以0.5 ℃增量且2～5 s/步,進(jìn)行30個(gè)循環(huán),95 ℃聚合酶激活和DNA變性5 min。得到Cq值。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果、稀釋倍數(shù)、Cq值就可以繪制出lg(CFU)-Cq值標(biāo)準(zhǔn)曲線。將糞便原始DNA進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)得到的Cq值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線曲即可得到糞便中所求菌種的CFU數(shù)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

該論文中實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn),數(shù)據(jù)顯示為每組的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。使用單因素方差分析和Tukey多重比較檢驗(yàn)來(lái)考察各組平均值的差異。P<0.05用于確定統(tǒng)計(jì)顯著性。GraphPad Prism 9.4用于所有統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)菌株的碳源利用能力

測(cè)定了12株假小鏈雙歧桿菌對(duì)17種碳水化合物的利用情況,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示?？芍?2株假小鏈雙歧桿菌均不利用D-阿拉伯糖、甘露糖、L-鼠李糖和可溶性淀粉,均利用葡萄糖、乳糖、FOS、GOS和菊粉,僅有1株菌利用甘露醇、纖維二糖。有50%～91.67%的假小鏈雙歧桿菌能夠利用D-半乳糖、木糖、D-果糖、D-麥芽糖及蔗糖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示12株假小鏈雙歧桿菌對(duì)17種碳水化合物的利用具有株間差異,某些菌株能利用10種以上碳水化合物,而某些菌株僅能利用5種。

表2 假小鏈雙歧桿菌對(duì)17種碳水化合物的利用能力Table 2 Utilization abilities of 17 carbon sources by B.pseudocatenulatum

有研究[16]檢測(cè)了30株假小鏈雙歧桿菌的碳水化合物利用情況,結(jié)果顯示,90%以上的菌株能利用葡萄糖、乳糖、GOS、FOS,與本研究結(jié)果一致。另外,該文章還報(bào)道了假小鏈雙歧桿菌對(duì)植物來(lái)源的碳源利用能力強(qiáng)于兩歧雙歧桿菌,但對(duì)于宿主來(lái)源的碳源(如粘蛋白、2′巖藻糖基乳糖等)利用能力不如兩歧雙歧桿菌。

2.2 實(shí)驗(yàn)菌株在不同碳源培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況

12株假小鏈雙歧桿菌在不同碳源培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況也顯示出碳源利用的差異性。由圖1可知,12株假小鏈雙歧桿菌在9種碳源培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線具有差異性,除FJSNT37M5外其他菌株對(duì)葡萄糖的利用良好(圖1-a),在接種1 250 min后,FJSNT37M5的OD600值僅達(dá)到0.39。菌株在不同培養(yǎng)基中的延滯期大部分為480 min左右,但個(gè)別菌株延滯期很長(zhǎng),如FJSNT36M3(900 min,圖1-b;780 min,圖1-c;),FAHBZ2M3(870 min,圖1-c;780 min,圖1-d;750 min,圖1-i),FJSNT37M5(900 min,圖1-d;990 min,圖1-f;900 min,圖1-g),A14(990 min,圖1-d;990 min,圖1-f;960 min,圖1-g),FHNBA14M1(780 min,圖1-i),FFJND17M1(870 min,圖1-i),FXJWS49M21(990 min,圖1-i)等,延滯期的差異體現(xiàn)了菌株對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力的不同。

a-葡萄糖培養(yǎng)基;b-GOS培養(yǎng)基;c-FOS培養(yǎng)基;d-菊粉培養(yǎng)基;e-乳糖培養(yǎng)基;f-木糖培養(yǎng)基;g-麥芽糖培養(yǎng)基;h-D-半乳糖培養(yǎng)基;i-蔗糖培養(yǎng)基圖1 假小鏈雙歧桿菌在9種碳源培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of B.pseudocatenulatum in 9 kinds of carbon source media注:每株菌N=3

有研究[22]結(jié)果顯示,2株兩歧雙歧桿菌960 min后才進(jìn)入對(duì)數(shù)期,4株鏈球菌120 min后即進(jìn)入對(duì)數(shù)期。另外,12株假小鏈雙歧桿菌在24 h內(nèi)的生長(zhǎng)速度、生長(zhǎng)量也有顯著差異,具體情況如下。

在生長(zhǎng)曲線中,延滯期后的一段細(xì)胞數(shù)以幾何級(jí)數(shù)增長(zhǎng)的時(shí)期為指數(shù)期,細(xì)菌在指數(shù)期生長(zhǎng)速率最大,代時(shí)最短,本研究把細(xì)菌在指數(shù)期時(shí)的代時(shí)計(jì)算出來(lái)如圖2所示。12株假小鏈雙歧桿菌在每種碳源培養(yǎng)基中的代時(shí)中位數(shù)分別為156.15、144.87、155.86、166.11、180.88、337.53、155.93、382.08、137.61 min。結(jié)果顯示,每株雙歧桿菌在不同碳源培養(yǎng)基中表現(xiàn)出生長(zhǎng)速率的差異性,A14在木糖和麥芽糖培養(yǎng)基中的代時(shí)最短(圖2-g,圖2-f,P<0.05),FGSYC12M4在葡萄糖、木糖、麥芽糖和D-半乳糖培養(yǎng)基中的代時(shí)最短(圖2-a、圖2-f、圖2-g、圖2-h、P<0.05),FXJWS49M35在GOS、FOS、乳糖、木糖培養(yǎng)基中代時(shí)較長(zhǎng)(圖2-b、圖2-c、圖2-e、圖2-f、P<0.05),FXJWS49M33在FOS、菊粉、D-半乳糖培養(yǎng)基中代時(shí)較長(zhǎng)(圖2-c,圖2-d,圖2-h,P<0.05)。

a-葡萄糖培養(yǎng)基;b-GOS培養(yǎng)基;c-FOS培養(yǎng)基;d-菊粉培養(yǎng)基;e-乳糖培養(yǎng)基;f-木糖培養(yǎng)基;g-麥芽糖培養(yǎng)基;h-D-半乳糖培養(yǎng)基;i-蔗糖培養(yǎng)基圖2 假小鏈雙歧桿菌在不同碳源培養(yǎng)基中的代時(shí)Fig.2 Generation time of B.pseudocatenulatum in different carbon source media注:每株菌N=3,不同字母 (a～l) 表示不同組之間存在顯著差異(P<0.05)

有研究報(bào)道了假小鏈雙歧桿菌FGSZY20M1在GOS、FOS、葡萄糖培養(yǎng)基中的代時(shí)分別為110、150、100 min,與本研究測(cè)得數(shù)據(jù)相近,另外,研究還檢測(cè)了短雙歧桿菌在上述3種培養(yǎng)基中的代時(shí)分別為90、120、70 min,長(zhǎng)雙歧桿菌為100、90、145 min[16],實(shí)驗(yàn)證明,假小鏈雙歧桿菌在葡萄糖培養(yǎng)基中的代時(shí)與長(zhǎng)雙歧桿菌相近,而在GOS和FOS培養(yǎng)基中的代時(shí)要高于上述2種雙歧桿菌。

生長(zhǎng)和繁殖是保證微生物獲得生物量的必要前提,生長(zhǎng)意味著原生質(zhì)含量的增加,而生長(zhǎng)量的測(cè)定可以以此為依據(jù),通過比濁法進(jìn)行間接測(cè)定。從圖3-a～圖3-i,12株假小鏈雙歧桿菌在每種碳源培養(yǎng)基中的OD600值中位數(shù)分別為0.99、1.00、0.85、0.75、1.01、0.31、0.82、0.70、0.85。結(jié)果顯示,每株雙歧桿菌在不同碳源培養(yǎng)基中表現(xiàn)出生長(zhǎng)量的差異性,FFJND17M1在葡萄糖、GOS、蔗糖培養(yǎng)基中的OD600值最高(圖3-a、圖3-b、圖3-i,P<0.05),FGZ6I1M3在菊粉、木糖培養(yǎng)基中的OD600值最高(圖3-d、圖3-f,P<0.05),FXJWS49M35在葡萄糖、FOS、菊粉培養(yǎng)基中的OD600值較低(圖3-a、圖3-c、圖3-d,P<0.05)。

a-葡萄糖培養(yǎng)基;b-GOS培養(yǎng)基;c-FOS培養(yǎng)基;d-菊粉培養(yǎng)基;e-乳糖培養(yǎng)基;f-木糖培養(yǎng)基;g-麥芽糖培養(yǎng)基;h-D-半乳糖培養(yǎng)基;i-蔗糖培養(yǎng)基圖3 假小鏈雙歧桿菌在不同碳源培養(yǎng)基中的OD600值Fig.3 OD600 of B.pseudocatenulatum in different carbon source medium注:每株菌N=3,不同字母(a～l)表示不同組之間存在顯著差異(P<0.05)

有研究[16]檢測(cè)了5株假小鏈雙歧桿菌在木糖培養(yǎng)基中的OD600值為0.6～0.9,高于本實(shí)驗(yàn)結(jié)果,其他雙歧桿菌(兩歧雙歧、短雙歧、長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種)在乳糖培養(yǎng)基中的OD600值在0.1～0.2。5株假小鏈雙歧桿菌在乳糖培養(yǎng)基中的OD600值在0.7～1.1,與本研究一致,其他雙歧桿菌(兩歧雙歧、短雙歧、長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種,青春雙歧桿菌)在乳糖培養(yǎng)基中的OD600值在0.6～0.8,總而言之,其他研究的實(shí)驗(yàn)也顯示出不同假小鏈雙歧桿菌對(duì)碳水化合物利用能力具有差異性,其在乳糖培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)能力較強(qiáng)。

將12株菌在每種碳源培養(yǎng)基中的代時(shí)處于整體代時(shí)中位數(shù)以下,或OD600值在整體OD600值中位數(shù)以上的指標(biāo)記為達(dá)標(biāo),將達(dá)標(biāo)數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì),各株菌表現(xiàn)情況如表3所示。可知12株假小鏈雙歧桿菌在碳源培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況也呈現(xiàn)出了較大的差異性,在這些實(shí)驗(yàn)菌株中,FGSYC12M4、FGZ16I1M1、FFJND17M1的表現(xiàn)最好,FXJWS49M35、FXJWS49M33、FAHBZ2M3的表現(xiàn)最差。有趣的是,有些菌株在代時(shí)(生長(zhǎng)速率)和OD600值(生長(zhǎng)量)中呈現(xiàn)出了相反的趨勢(shì),如FHNBA14M1在木糖、FOS、GOS培養(yǎng)基中代時(shí)較長(zhǎng),但24 h后的OD600值卻較高,A14在乳糖、菊粉、D-半乳糖、D-麥芽糖、木糖、低聚果糖培養(yǎng)基中的代時(shí)很短,但24 h后的OD600值卻較低,這表明生長(zhǎng)速率較快的菌株最終的生長(zhǎng)量并不一定較高。有研究顯示出類似的結(jié)果,如假小鏈雙歧桿菌在0.5% 的FOS、GOS培養(yǎng)基中的代時(shí)分別為160 min和110 min,但最終的OD600值分別為1.2和1.0[16]。

表3 假小鏈雙歧桿菌在9種碳源培養(yǎng)基中的達(dá)標(biāo)情況Table 3 The up-to-standard status of B.pseudocatenulatum in 9 kinds of carbon source media

2.3 假小鏈雙歧桿菌糖苷水解酶分布特征

如圖4所示,假小鏈雙歧桿菌的糖苷水解酶分布同樣具有差異性。在假小鏈雙歧桿菌含量較多的前30個(gè)糖苷水解酶中,80%以上與植物碳源相關(guān),乳源相關(guān)的為GH42和GH2。在碳水化合物利用中表型優(yōu)良的菌株FGSYC12M4、FGZ16I1M1、FFJND17M1均含有3個(gè)以上特異性糖苷水解酶,如GH5_44、GH13_13、GH1、GH36等,GH5為β-1,3-葡萄糖苷酶,GH13為蔗糖磷酸化酶/α-1,6-葡萄糖苷酶,GH1為β-葡萄糖苷酶,GH36為α-半乳糖苷酶[16],這些均為植物碳源相關(guān)的糖苷水解酶,此外,ZHU等[23]報(bào)告過植物乳桿菌QS7T在以菊粉為碳源的培養(yǎng)基中的最大OD600值為1.891±0.028,并且通過基因組測(cè)序和分析顯示,與菊粉消耗相關(guān)的功能基因(特別是糖苷水解酶)表達(dá)顯著上調(diào)。在本研究中,FFJND17M1基因組中編碼GH5_44和GH13_13的基因數(shù)量分別是其他11株假小鏈雙歧桿菌的2倍或1.5倍,這也許與FFJND17M1在葡萄糖、蔗糖培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)量顯著高于其他菌株的結(jié)果有關(guān)。FXJWS49M35、FXJWS49M33、FAHBZ2M3的表型最差,基因分析也發(fā)現(xiàn)它們的糖苷水解酶含量低于其他菌株。研究發(fā)現(xiàn)假小鏈雙歧桿菌利用乳糖的能力較強(qiáng),可能與它們含有較多的乳源糖苷水解酶(GH42、GH2)有關(guān)。

圖4 假小鏈雙歧桿菌糖苷水解酶分布特征Fig.4 Distribution of glycoside hydrolase across B.pseudocatenulatum

雙歧桿菌因編碼大量與碳水化合物修飾相關(guān)的酶而表現(xiàn)出對(duì)富含復(fù)雜碳水化合物的胃腸道環(huán)境的適應(yīng)性[24]。不同的假小鏈雙歧桿菌利用碳水化合物的能力具有差異,很可能是因?yàn)榻到夂娃D(zhuǎn)運(yùn)碳水化合物的酶不同,研究表明,假小鏈雙歧桿菌能較好的降解復(fù)雜的植物多糖[14],在本實(shí)驗(yàn)中,假小鏈雙歧桿菌也表現(xiàn)出較強(qiáng)的降解植物碳源的能力。據(jù)報(bào)道,假小鏈雙歧桿菌代表菌株C15的β-半乳糖苷酶和阿拉伯糖滲透酶等糖利用基因拷貝數(shù)顯著高于其他菌株[15]。菌株IPLA因包含4個(gè)GH3家族的編碼基因而被預(yù)測(cè)有利用大豆異黃酮苷的性狀[14]。目前關(guān)于假小鏈雙歧桿菌碳水化合物利用相關(guān)基因的研究還缺少針對(duì)該菌種的全面研究。

2.4 實(shí)驗(yàn)菌株占據(jù)腸道豐度的潛力研究

確定單一菌株對(duì)單一碳源的利用能力有利于分析菌株的生理特性,但腸道中復(fù)雜的碳水碳水化合物環(huán)境需要設(shè)計(jì)更復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估其對(duì)胃腸道環(huán)境的適應(yīng)性及在腸道環(huán)境中占據(jù)豐度優(yōu)勢(shì)的潛力。選取在碳水化合物利用實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)差異較大的4株雙歧桿菌(FHNBA14M1、FAHBZ2M3、A14、FGSYC12M4)進(jìn)行人糞便體外發(fā)酵實(shí)驗(yàn),將菌株接入GMM培養(yǎng)基發(fā)酵24 h后對(duì)其中的假小鏈雙歧桿菌進(jìn)行絕對(duì)定量,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示FGSYC12M4增殖量為5.57×107CFU/mL,顯著高于FAHBZ2M3和FHNBA14M1(圖5),4株菌的增殖量大小與碳水化合物利用能力的強(qiáng)弱趨勢(shì)一致(表3),即FGSYC12M4的碳水化合物利用能力最強(qiáng),在體外發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中的增殖量也最高,FAHBZ2M3的碳水化合物利用能力最弱,在體外發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中的增殖量也最低。但是,FHNBA14M1和A14兩株菌在表3中雖然總計(jì)差異不大,但兩者卻處于代時(shí)或OD600值兩個(gè)極端中,而體外發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,偏向于代時(shí)較短或者OD600值較高的菌株在增殖量方面并不體現(xiàn)差異性。即假小鏈雙歧桿菌占據(jù)腸道豐度的潛力是基于其對(duì)于碳水化合物利用能力的綜合考量。

圖5 假小鏈雙歧桿菌在GMM培養(yǎng)基中發(fā)酵24 h后的增殖Fig.5 Proliferation of B.pseudocatenulatum after 24 h of fermentation in GMM medium注:每組N=3,字母“a～c”表示顯著性差異(P<0.05)

吳歡等[6]從兒童營(yíng)養(yǎng)干預(yù)后的腸道中分離出優(yōu)勢(shì)菌假小鏈雙歧桿菌C95,進(jìn)行了復(fù)雜碳水化合物利用實(shí)驗(yàn)(包括FOS、中長(zhǎng)鏈菊粉、低聚麥芽糖、抗性淀粉等),發(fā)現(xiàn)其對(duì)碳水化合物的利用能力很強(qiáng),認(rèn)為這在一定程度上可以解釋雙歧桿菌被復(fù)雜碳水化合物富集而在腸道中成為優(yōu)勢(shì)菌的現(xiàn)象。SONNENBURG等[25]也表明,碳水化合物飲食的高低會(huì)影響腸道菌群的豐度。因此,碳水化合物利用能力強(qiáng)的菌株具有占據(jù)高豐度的潛力。

3 結(jié)論

為研究不同假小鏈雙歧桿菌對(duì)碳水化合物利用能力的差異性,本研究對(duì)12株假小鏈雙歧桿菌在17種碳水化合物中的生長(zhǎng)特性進(jìn)行了測(cè)定,使用溴甲酚紫檢測(cè)菌株對(duì)不同碳水化合物的利用情況,發(fā)現(xiàn)12株菌對(duì)碳水化合物利用的種類為5～11種。12株假小鏈雙歧桿菌編碼的大多為降解植源性碳水化合物的糖苷水解酶,在碳水化合物利用中展現(xiàn)出的株間差異可能是因?yàn)榻到夂娃D(zhuǎn)運(yùn)碳水化合物的酶具有差異性。通過測(cè)定生長(zhǎng)曲線,計(jì)算代時(shí),檢測(cè)OD600值確定了不同菌株在9種碳水化合物中的生長(zhǎng)能力,以中位數(shù)劃分每株菌的達(dá)標(biāo)數(shù)量,發(fā)現(xiàn)12株菌的達(dá)標(biāo)數(shù)目為5～16個(gè)不等。通過人糞便體外發(fā)酵實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了達(dá)標(biāo)數(shù)量與其占據(jù)豐度的大小有正相關(guān)性。結(jié)果顯示不同的假小鏈雙歧桿菌對(duì)碳水化合物利用具有較大的差異,本研究為假小鏈雙歧桿菌的碳水化合物利用能力的研究提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),為假小鏈雙歧桿菌作為益生元、益生菌的開發(fā)提供了參考。