薛思雅,張潤(rùn)峰,王清,陳山*

1(廣西大學(xué) 輕工與食品工程學(xué)院,廣西 南寧,530000) 2(信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院 食品學(xué)院,河南 信陽(yáng),464000)

1960年,百里香精油(thyme essential oil, TEO)具有抗菌特性已被報(bào)道[1]。由于TEO中含有百里酚和香芹酚[2]等酚類(lèi)活性物質(zhì),使其具有廣譜的抑菌活性,從而被廣泛應(yīng)用于制藥、化妝品、農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)等領(lǐng)域[3-4]。然而,由于精油(essential oils, EOs)的水溶性較低、揮發(fā)性較高、伴隨風(fēng)味因素的影響且具有高濃度潛在毒性[5],使其在食品工業(yè)中的應(yīng)用受到限制。通過(guò)將EOs乳化以增強(qiáng)其分散性并防止EOs降解成為一種替代方案[6]。

乳液根據(jù)液滴大小可分為粗乳液、微乳液和納米乳液(nanoemulsions, NEs)[7],其中NEs是指平均粒徑在10～100 nm的均勻分散系統(tǒng),是有前景且可行的封裝EOs方法[8]。GUO等[9]研究表明,百里香精油納米乳液(thyme essential oil nanoemulsion, TEON)具有很強(qiáng)的抗菌作用,其研究重點(diǎn)偏向于超聲和乳液協(xié)同抗菌,通過(guò)研究探索抑菌機(jī)制來(lái)判斷抑菌效果[9-11],然而,NEs液滴大小對(duì)抗菌性影響的相關(guān)研究仍不夠深入,大多都是探索微米和納米級(jí)別EOs的抗菌性能的差異[3]。

NEs具有動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì),不受溫度和pH在內(nèi)的物理和化學(xué)變化的影響,更適用于各類(lèi)研究及應(yīng)用[12],而且NEs對(duì)細(xì)菌的抑菌效果是純EOs的10倍[9]。已有研究表明,相比于TEO,TEON不易降解,穩(wěn)定性得到提升,具有更高的活性成分負(fù)載能力[13],能夠極大提升其抗菌活性[14]。NEs可以通過(guò)高能量或低能量的方法制備得到[15],其中超聲波法作為一種空化輔助技術(shù),具有安全、健康和對(duì)環(huán)境無(wú)害的優(yōu)點(diǎn)[16],同時(shí)也能避免NEs在制備過(guò)程中的質(zhì)量損耗并保證其化學(xué)成分不受影響[15],已成為一種很有前景的方法。因此,本文選取了環(huán)境衛(wèi)生和食品衛(wèi)生學(xué)中典型的4種細(xì)菌,在探索了不同TEO濃度下制備的TEON對(duì)抑菌性影響的基礎(chǔ)上,再探索其粒徑大小對(duì)不同菌株抑菌性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯化鈉,天津北辰方正試劑廠(chǎng);無(wú)水磷酸氫二鈉,天津大茂化學(xué)試劑廠(chǎng);磷酸二氫鉀,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;氯化鉀,天津博迪化工股份有限公司;瓊脂粉、蛋白胨,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;酵母提取物,OXOID公司;TEO、Tween 80,上海源葉生物科技有限公司;磷鎢酸,北京索萊寶科技有限公司;普通碳支持膜,北京中鏡科儀技術(shù)有限公司。

微生物菌株:大腸桿菌CMCC 44102、銅綠假單胞菌CMCC 10104、枯草芽孢桿菌CMCC 63501、金黃色葡萄球菌CMCC 26003,上海保藏技術(shù)中心。

1.2 儀器與設(shè)備

Scientz-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī),寧波新芝生物科技有限公司;Zetasizer Nano ZS90納米激光粒度儀,英國(guó)Malvern公司;HT7700-日立透射電子顯微鏡,日本Advanced Microscope公司;傅里葉紅外光譜儀德國(guó)Bruker公司;SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱,上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)。

1.3 TEON的制備

使用超聲粉碎機(jī)對(duì)TEO進(jìn)行超聲處理。制備相同超聲功率下不同濃度的TEON,將1 mL的Tween 80和不同體積的TEO混合,定容至100 mL,于磁力攪拌器上混合5 min。將混合液在20 kHz的頻率、380 W的功率下超聲處理20 min,反應(yīng)過(guò)程通過(guò)冰水浴控制體系溫度為20 ℃。

在相同TEO濃度下,通過(guò)改變超聲功率制備不同粒徑的TEON,將1 mL的Tween 80和1.2 mL的TEO混合,定容至100 mL,于磁力攪拌器上混合5 min。設(shè)置不同超聲功率,其余制備過(guò)程與上述一致。

1.4 接種物的制備

LB培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10、酵母提取物5,氯化鈉10,pH 7.0。在121 ℃滅菌鍋中滅菌20 min。

LB固體培養(yǎng)基(g/L):在LB培養(yǎng)基中加入16 g瓊脂粉。

PBS緩沖液:4 g氯化鈉、0.1 g氯化鉀、0.71 g無(wú)水磷酸氫二鈉和0.135 g磷酸二氫鉀,將混合物定容至400 mL,調(diào)pH值至7.4,定容至500 mL。

以上培養(yǎng)基均在121 ℃滅菌鍋中滅菌20 min。

1.5 乳液粒徑的測(cè)定

使用納米粒度儀在173°的散射角下通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射(dynamic light scattering, DLS)測(cè)量油滴尺寸。為避免多重散射效應(yīng),測(cè)量前用去離子水對(duì)TEON進(jìn)行稀釋。

1.6 透射電子顯微鏡(transmission electron microscope, TEM)觀(guān)察液滴形態(tài)

用TEM觀(guān)察TEON的微觀(guān)結(jié)構(gòu)。在TEM觀(guān)察前,樣品用去離子水以1∶100的比例進(jìn)行稀釋,將稀釋后的TEON置于普通碳支持膜上,等待干燥后,用2%的磷鎢酸水溶液負(fù)染15 min,濾紙吸干多余液體,干燥后觀(guān)察。

1.7 傅里葉紅外光譜儀(Fourier transform infrared spectrometer, FT-IR)

TEON的FT-IR于衰減全反射(attenuated total reflection, ATR)模式下在4 000～500 cm-1進(jìn)行記錄。

1.8 抗菌活性的測(cè)定

采用平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)抗菌活性。4種微生物接種在LB培養(yǎng)基中,于搖床培養(yǎng)12 h(37 ℃,200 r/min),得到細(xì)菌菌懸液。使用PBS緩沖液對(duì)菌懸液進(jìn)行梯度稀釋,使1 mL菌懸液在20 mL的LB固體培養(yǎng)基中的菌落數(shù)為30～300 CFU,做空白對(duì)照組。取10 mL稀釋過(guò)的菌懸液,分別加入適量TEON,并通過(guò)0.45 μm 過(guò)濾器過(guò)濾滅菌,使1 mL混合液在20 mL的LB固體培養(yǎng)基中的菌落數(shù)為0～300 CFU。將接種后的培養(yǎng)皿(直徑9 cm)放入37 ℃培養(yǎng)箱中,48 h后觀(guān)察細(xì)菌菌落數(shù)。

1.9 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Nano Measure 1.2軟件對(duì)TEM圖片進(jìn)行粒徑分析,使用OriginPro 9.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖,抗菌試驗(yàn)每組設(shè)置3個(gè)平行,用SPSS 20.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,以P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 TEON的形態(tài)

采用納米粒度儀和TEM對(duì)TEON的粒徑分布情況和形態(tài)進(jìn)行表征分析,以便直觀(guān)地觀(guān)察TEON的微觀(guān)結(jié)構(gòu)。如圖1和圖2所示,1.2%(體積分?jǐn)?shù))的TEO在380 W的超聲功率下獲得的TEON的平均粒徑在50 nm左右,乳化后的TEON清晰可見(jiàn),液滴的形態(tài)呈現(xiàn)球形,尺寸分布均勻,與納米粒度儀分析結(jié)果相似,兩者微小差異可能是DLS測(cè)量過(guò)程中,乳液球體傾向于包裹在水膜中,導(dǎo)致數(shù)值偏大[17]。

圖1 TEON的粒徑分布Fig.1 The droplet size distribution for TEON

圖2 TEON的透射電子顯微鏡圖像Fig.2 Transmission electron microscope image for TEON

2.2 FT-IR分析

圖3 相同TEO濃度、不同超聲功率下制備的TEON的FT-IR光譜Fig.3 FT-IR Spectra of TEON prepared at the same concentration of TEO and different ultrasonic power

2.3 TEO濃度對(duì)抗菌性的影響

不同TEO濃度下制備的TEON的粒徑大小如圖4 所示,當(dāng)添加0.7%～1%(體積分?jǐn)?shù))的TEO時(shí),TEON的平均粒徑隨濃度增加而減小。體積分?jǐn)?shù)為1.1%～1.7% 時(shí),TEON的平均粒徑隨濃度增大而增大,并且平均粒徑在100 nm以?xún)?nèi),表明在此濃度區(qū)間內(nèi)通過(guò)超聲處理均能獲得NEs[8]。并且在TEO和Tween 80為1∶1比例時(shí)得到最小粒徑的TEON。在后續(xù)濃度與抑菌效果的關(guān)系研究中,為控制菌落數(shù)在0～300 CFU,并且菌落數(shù)小于空白對(duì)照組,選擇TEO體積分?jǐn)?shù)為1%～1.7%。

圖4 不同TEO濃度下制備的TEON粒徑Fig.4 The droplet size diagram of TEON prepared at different concentration of TEO注:數(shù)據(jù)表示為3次測(cè)定平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(下同)

2.3.1 TEO濃度對(duì)革蘭氏陰性菌抑菌性能的影響

對(duì)革蘭氏陰性菌的抗菌特性的探究中,選取了大腸桿菌和銅綠假單胞菌2個(gè)典型的菌株。為控制空白對(duì)照組的菌落數(shù)在30～300 CFU,將大腸桿菌菌懸液梯度稀釋到10-7,又為了方便觀(guān)察TEON對(duì)大腸桿菌的影響規(guī)律,各濃度梯度均添加0.8 mL的TEON用于抗菌性研究。如圖5所示,相較于未添加TEON的空白對(duì)照組,添加了TEON的實(shí)驗(yàn)組隨著TEO濃度的增加,細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制,菌落數(shù)顯著減少(P<0.05)。當(dāng)TEO體積分?jǐn)?shù)達(dá)到1.7%之后,大腸桿菌無(wú)法生存。

圖5 不同TEO濃度下制備的TEON對(duì)大腸桿菌的抑菌效果Fig.5 The bacteriostatic effect of TEON perpared at different concentration of TEO on Escherichia coli注:圖中對(duì)照為未添加精油,不同字母表示存在顯著差異(P<0.05)(下同)

將銅綠假單胞菌菌懸液梯度稀釋到10-6,并添加0.5 mL的TEON。如圖6所示,相較于空白對(duì)照組,添加了TEON的實(shí)驗(yàn)組,當(dāng)TEO濃度達(dá)到一定后,隨著濃度的增加,細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制,菌落數(shù)顯著減少(P<0.05)。由此可以判斷,隨著TEO濃度的增加,其對(duì)TEON革蘭氏陰性菌的抗菌性也逐漸提升,與FADLI等[20]研究結(jié)論一致。本研究通過(guò)對(duì)多組濃度梯度進(jìn)行探究,更具說(shuō)服力,也便于觀(guān)察濃度與抑菌性之間的規(guī)律關(guān)系。

圖6 不同TEO濃度下制備的TEON對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌效果Fig.6 The bacteriostatic effect of TEON perpared at different concentration of TEO on Pseudomonas aeruginosa

2.3.2 TEO濃度對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌性能的影響

對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抗菌特性的探究中,選取了金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌2個(gè)典型的菌株。將金黃色葡萄球菌菌懸液梯度稀釋到10-7,添加0.5 mL的TEON。如圖7所示,相較于空白對(duì)照組,隨著TEO濃度的增加,細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制,菌落數(shù)顯著減少(P<0.05)。當(dāng)TEO體積分?jǐn)?shù)達(dá)到1.7%之后,金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)完全受到抑制。

圖7 不同TEO濃度下制備的TEON對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果Fig.7 The bacteriostatic effect of TEON perpared at different concentration of TEO on Staphylococcus aureus

將枯草芽孢桿菌菌懸液梯度稀釋到10-5。當(dāng)添加0.2 mL的TEON時(shí),所有濃度下都未顯示出其對(duì)枯草芽孢桿菌的抗菌性,但當(dāng)添加0.25 mL的TEON時(shí),所有濃度下枯草芽孢桿菌幾乎全部失活,這可能與枯草芽孢桿菌特殊的細(xì)胞結(jié)構(gòu)有關(guān)。

以上結(jié)果表明,革蘭氏陽(yáng)性菌比革蘭氏陰性菌對(duì)TEON更敏感。但GUERRA-ROSAS等[21]研究發(fā)現(xiàn),與革蘭氏陽(yáng)性菌相比,革蘭氏陰性菌對(duì)檸檬草精油納米乳液更加敏感。造成研究結(jié)果不同的原因,可能是因?yàn)椴煌⑸镂锓N的細(xì)胞包膜的結(jié)構(gòu)存在差異,而且不同的微生物種對(duì)不同的EOs的NEs也表現(xiàn)不同反應(yīng)。

2.4 乳液粒徑對(duì)抗菌性的影響

控制TEO體積分?jǐn)?shù)為1.2%,其他超聲條件一致,僅改變超聲功率,獲得的TEON的粒徑大小如圖8 所示。隨著超聲功率的增加,TEON的粒徑逐漸減小,但是變化幅度也越來(lái)越小,說(shuō)明當(dāng)超聲功率達(dá)到一定強(qiáng)度后,對(duì)粒徑的影響有限。

圖8 相同TEO濃度下制備不同粒徑的TEON粒徑Fig.8 The droplet size diagram of TEON with different droplet size perpared at the same concentration of TEO

2.4.1 粒徑對(duì)革蘭氏陰性菌的抑菌性能的影響

TEON對(duì)大腸桿菌的抗菌性能如圖9所示,當(dāng)超聲功率達(dá)到333 W之后,隨著NE粒徑的減小,不同粒徑之間的抗菌性能不存在顯著差異。但當(dāng)功率為285 W時(shí),存在顯著差異(P<0.05),這說(shuō)明當(dāng)粒徑差異較大時(shí),粒徑大小能夠影響NEs對(duì)大腸桿菌的抗菌性能。

圖9 不同粒徑TEON對(duì)大腸桿菌的抑菌效果Fig.9 The bacteriostatic effect of TEON with different droplet size on Escherichia coli

TEON對(duì)銅綠假單胞菌的抗菌性能如圖10所示,隨著粒徑的減小,不同粒徑乳液球體的抗菌性能出現(xiàn)顯著差異(P<0.05),即抗菌性能逐漸增加。這可能是因?yàn)檩^小尺寸的液滴具有更大的比表面積,能夠讓NEs與細(xì)胞膜更加充分地接觸,從而使細(xì)胞活力快速喪失[22]。

圖10 不同粒徑TEON對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌效果Fig.10 The bacteriostatic effect of TEON with different droplet size on Pseudomonas aeruginosa

2.4.2 粒徑對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌性能的影響

TEON對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌性能如圖11所示,隨著粒徑的減小,不同粒徑乳液球體的抗菌性能不存在顯著差異。TEON的粒徑大小對(duì)抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)沒(méi)有影響,LIAO等[23]研究得出類(lèi)似的結(jié)論。

圖11 不同粒徑TEON對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果Fig.11 The bacteriostatic effect of TEON with different droplet size on Staphylococcus aureus

將枯草芽孢桿菌菌懸液梯度稀釋到10-5。當(dāng)添加0.2 mL的TEON時(shí),所有粒徑下都未顯示出其對(duì)枯草芽孢桿菌的抗菌活性,但當(dāng)添加0.25 mL的TEON時(shí),所有濃度下枯草芽孢桿菌幾乎被完全殺死,這與添加不同濃度TEO制備的NEs時(shí)的結(jié)果一樣。

3 結(jié)論

通過(guò)超聲制備不同濃度和粒徑的TEON,對(duì)幾種典型革蘭氏細(xì)菌的抑菌性能進(jìn)行了檢測(cè)分析。結(jié)果表明,TEON抗菌性能隨著TEO濃度的增加而增強(qiáng),當(dāng)控制TEO濃度不變,制備不同粒徑的TEON,隨粒徑的減小,抗菌性能得到提升,且革蘭氏陰性菌比革蘭氏陽(yáng)性菌更易受到影響。對(duì)于枯草芽孢桿菌而言,可能是因?yàn)樘厥獾募?xì)胞結(jié)構(gòu),其對(duì)TEON的敏感性大于其他種類(lèi)的菌株,可在后續(xù)深入研究NEs對(duì)芽孢類(lèi)細(xì)菌的作用機(jī)制。NEs作為一種極具前景的抗菌劑,有效地調(diào)控其濃度和粒徑,為NEs用于提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的生物利用度,改善生物活性化合物的遞送等研究打下基礎(chǔ)。