張晶晶

（福建省淡水水產(chǎn)研究所，福州 350002）

0 引言

維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)是隸屬于氣單胞菌科，氣單胞菌屬的革蘭氏陰性致病菌。其最適生長溫度為28～37℃[1]，夏、秋兩季在水體環(huán)境中繁殖最快。作為一種條件致病菌，維氏氣單胞菌廣泛存在于自然界水體、土壤和水生動物體中，并且在人、獸和水生動物中都有相關(guān)的感染報道[2]。維氏氣單胞引起的水生動物疾病在全國范圍可見廣泛報道，感染魚體常出現(xiàn)體表潰爛出血、剖檢可見內(nèi)臟器受損出血，且伴隨腸炎、腹水等癥狀，嚴(yán)重時魚體可發(fā)生較高的死亡率[3]。目前感染的水產(chǎn)養(yǎng)殖動物有克氏原螫蝦[4]、西伯利亞鱘[5]、羅非魚[6]、錦鯉[7]、虹鱒[8]、大黃魚[9]、草魚[10-11]、鰻鱺[12]等。

半刺厚唇魚(Acrossocheilus hemispinus)，俗稱“石板魚”、“坑魚”，隸屬于鯉科(Cyprindae)、鲃亞科(Barbinae)、光唇魚屬(Acrossocheilus)，主要分布于福建省的閩江、九龍江、交溪、霍童溪等江河水系和湖南省的湘江、資水、沅水、澧水[13]。半刺厚唇魚肉質(zhì)嫩滑、味道鮮美，在閩浙一帶深受當(dāng)?shù)鼐用裣矏?。由于傳統(tǒng)棲息環(huán)境的破壞、非法捕撈和濫捕、各種污染源破壞等，野生種質(zhì)資源量銳減，為了保護(hù)其野生種質(zhì)資源，福建省將半刺厚唇魚納入《福建省水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)規(guī)劃》保護(hù)經(jīng)濟(jì)物種，并建立了浦城縣南浦溪和順昌縣麻溪2個半刺厚唇魚國家級水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)。近年來相關(guān)科研院所在半刺厚唇魚人工繁育、苗種培育、飼料營養(yǎng)、病害防治等技術(shù)研究方面取得了一定的突破[14-15]，但是由于半刺厚唇魚養(yǎng)殖處于剛發(fā)展階段，有關(guān)養(yǎng)殖過程中的病害研究相對較少，目前僅有小瓜蟲寄生蟲[16]、寄生性嗜酸性卵甲藻[17]和扁彎口吸蟲[18]感染的報道，未見細(xì)菌性感染報道。

2021 年8 月順昌縣兆興魚種養(yǎng)殖有限公司養(yǎng)殖半刺厚唇魚陸續(xù)發(fā)生少量死亡，死亡魚體皮膚潰爛形成潰瘍灶、尾鰭充血，眼部發(fā)紅渾濁，剖檢可見肝腎、脾臟腫大與出血；養(yǎng)殖池發(fā)病魚體出現(xiàn)游動緩慢、體色偏黑、食欲不振等癥狀。本研究開展病魚的細(xì)菌分離純化和鑒定與致病性研究，明確了發(fā)病病原為維氏氣單胞菌溫和生物型，同時開展了分離菌株的藥物敏感性試驗，為養(yǎng)殖生產(chǎn)中疾病的防控提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

具有典型癥狀的發(fā)病半刺厚唇魚（體質(zhì)量85～120 g）和回歸感染用健康半刺厚唇魚（體質(zhì)量35～40 g），均由順昌縣兆興魚種養(yǎng)殖有限公司提供。營養(yǎng)瓊脂(NA)、羊血瓊脂平板、甲基紅、纖維二糖、D-甘露醇、七葉苷、水楊苷、賴氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶、鳥氨酸脫羧酶購自廣州環(huán)凱生物科技有限公司。藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。DNA 2×Premix Taq 聚合酶購自大連寶生物工程有限公司，DNA Marker購自北京擎科生物科技有限公司。引物合成與測序送至上海生工生物工程技術(shù)股份有限公司完成。

1.2 致病菌的分離與純化

取發(fā)病癥狀典型的患病半刺厚唇魚，在無菌超凈臺用滅菌鑷子挑取少量肝、脾、腎組織，營養(yǎng)瓊脂平板劃線，28℃恒溫培養(yǎng)。24 h后挑取平板上優(yōu)勢菌落，重復(fù)劃線純化3 次。純化菌株于營養(yǎng)瓊脂斜面5℃冰箱和25%甘油的LB液體-80℃低溫冰箱保存。

1.3 回歸感染實驗

健康半刺厚唇魚于100 L連續(xù)爆氣的玻璃缸暫養(yǎng)2 周，溫度控制26～28℃。純化的菌株過夜培養(yǎng)后，用0.9%無菌生理鹽水清洗，10倍稀釋制成不同濃度菌懸液?；貧w感染設(shè)置6組，每組7尾健康半刺厚唇魚，背部肌肉注射不同濃度細(xì)菌懸液0.1 mL，對照組注射0.1 mL 0.9%無菌生理鹽水。同時，平板菌落計數(shù)法測定細(xì)菌懸液濃度。試驗期間不投餌，每天換水1次，每次換水40%，水溫控制26～28℃。每天記錄各組發(fā)病情況，對瀕臨死亡、癥狀明顯的患病魚體再次分離和純化細(xì)菌。

1.4 菌株鑒定

1.4.1 形態(tài)特征觀察純化的菌株于28℃恒溫箱培養(yǎng)24 h后，挑取單菌落革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體染色以及形態(tài)特征。

1.4.2 生理生化特性測定使用梅里埃公司的VITEK2全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)對分離純化的菌株進(jìn)行分析，對照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊[1]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[19]，補(bǔ)充甲基紅、纖維二糖、D-甘露醇、水楊苷、七葉苷、鳥氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶、賴氨酸脫羧酶、羊血瓊脂溶血實驗。

1.4.3 16S rDNA與gyrB基因分子鑒定用接菌環(huán)挑取純化菌株單菌落于無菌離心管中，加入500μL無菌雙蒸水，渦旋30 s，置95℃水浴5 min，12000 r/min 離心2 min，取上清液為DNA 模板。16S rDNA 通用引物上、下游引物序列分別為 AGAGTTT GATCCTGGCTCAG 和 TACGGCTAC CTTGTTAC GACTT[20]；gyrB 上、下游引物序列分別為TCCGGCGGTCTGCACGGCGT 和TTGTCC GGGT TGTACTCGTC[21-22]。PCR 反應(yīng)體系50 μL：2×Premix Taq 25 μL，DNA 模板4 μL，上下游引物各1 μL(10μmol/L)，ddH2O 19μL。16S rDNA 序列的PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸90 s，34個循環(huán)，72℃延伸10 min。gyrB基因PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，66℃復(fù)性30 s，72℃延伸60 s，34 個循環(huán)，72℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)股份有限公司測序，測序結(jié)果在BLSAT(Basic Local Alignment Search Tool)網(wǎng)站進(jìn)行線上序列同源性比對，采用MEGA11.0.10 軟件鄰接法(Neighbor joining，NJ)構(gòu)建進(jìn)化樹，設(shè)定Bootstrap為1000。

1.5 毒力基因擴(kuò)增

合成細(xì)胞毒性腸毒素(ast、act、alt)、氣溶素(aerA)、溶血素(hlyA)、IV 型菌毛基因(tapA)引物[23-25]（表1）。PCR反應(yīng)體系25μL，其中2×Premix Taq 12.5μL，DNA模板2μL，上下游引物各0.5μL，ddH2O 9.5μL。PCR反應(yīng)如下：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，act退火溫度55℃，延伸20 s，ast退火溫度55℃，延伸25 s，alt退火溫度55℃，延伸30 s，aerA退火溫度68℃，延伸時間30 s，hlyA退火溫度62℃，延伸時間40 s，tapA退火溫度55℃，延伸時間40 s，35 個循環(huán)，72℃延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后測序分析。

1.6 藥物敏感性實驗

純化菌株過夜培養(yǎng)后，挑取單菌落于無菌生理鹽水制成菌懸液，采用麥?zhǔn)媳葷岱▽⒕簼舛认♂?.5麥?zhǔn)蠞岫?1.0×108CFU/mL)，取100μL 稀釋菌懸液均勻涂布營養(yǎng)瓊脂平板上，待平板表面干后，將藥敏紙片粘貼于平板表面，每種藥物3個平行，28℃恒溫培養(yǎng)24 h，測量平板上的抑菌圈并計算平均值，根據(jù)產(chǎn)品說明書判斷該細(xì)菌的藥物敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株形態(tài)特征

從癥狀典型瀕死亡魚體肝臟分離純化得到單一優(yōu)勢菌株，將其命名為AS0829L1。菌株過夜培養(yǎng)后出現(xiàn)圓形凸起，表面光滑濕潤的灰黃色菌落，菌體直徑約為2～4 mm（圖1）。細(xì)菌革蘭氏染色結(jié)果陰性，兩端鈍圓，短桿狀（圖2）。

圖1 AS0829L1培養(yǎng)菌落形態(tài)

圖2 AS0829L1菌株革蘭氏染色陰性(100×)

2.2 回歸感染實驗

對健康半刺厚唇魚實驗魚背部注射菌液，注射濃度分別為5×1010、5×109、5×108、5×107、5×106CFU/mL?；貧w感染后第1 天，5×1010CFU/mL 濃度組全部死亡，5×109CFU/mL濃度組死亡率71.4%，第2天全部死亡；5×108CFU/mL濃度組第3天出現(xiàn)死亡，至14 d死亡率為28.6%，其他濃度組以及對照組無死亡情況（表2）。實驗組活動異常，部分魚呈現(xiàn)體表發(fā)紅、潰爛、鱗片脫落、爛尾等癥狀，剖檢可見肝臟發(fā)黃發(fā)白、脾臟發(fā)黑腫大（圖3）。

圖3 人工感染后半刺厚唇魚出現(xiàn)的癥狀

表2 分離菌株AS0829L1回歸實驗結(jié)果

2.3 分離菌株16S rDNA和gyrB基因序列的擴(kuò)增與分析

16S rDNA通用引物和gyrB基因特異性引物PCR擴(kuò)增結(jié)果分別獲得大小為1452 bp（GenBank 號OP268346）和1080 bp（GenBank 號OP311617）的序列。通過NCBI 的Blast 程序進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示菌株序列與維氏氣單胞菌(A.veronii)同源性最高，分別達(dá)到99.93%（登錄號MF716690.1）和99.34%（登錄號KJ747137.1）。根據(jù)16SrDNA 與gyrB 基因序列采用NJ 法分別構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，AS0829L1 菌株與維氏氣單胞菌聚為一類，可確定分離菌為維氏氣單胞菌（圖4）。

圖4 分離菌株16S rDNA序列(a)與gyrB基因序列(b)構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 生理生化鑒定

2.4.1 生理生化鑒定VITEK2全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鑒定菌株與氣單胞菌屬的溫和氣單胞菌的相應(yīng)特征相符，置信度89%，α-半乳糖苷酶實驗陽性，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶陽性，與溫和氣單胞菌生理生化特征不符（表3）。補(bǔ)充生化檢測結(jié)果，甲基紅、纖維二糖、D-甘露醇為陽性，水楊苷、鳥氨酸脫羧酶為陰性，羊血-瓊脂溶血實驗呈β-溶血（圖5），根據(jù)伯杰氏細(xì)菌分類手冊[1]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[26]，綜合生化反應(yīng)結(jié)果該分離菌可鑒定為維氏氣單胞菌。

圖5 AS0829L1菌株溶血性β-溶血

表3 分離菌株AS0829L1生理生化鑒定結(jié)果

2.4.2 菌株生物型鑒定維氏氣單胞菌溫和生物型具有act、aer A、alt、hly A、tap A基因，維氏氣單胞菌維羅納生物型具有ast、alt、act、hlyA、aer A基因[25,27]（表1）。分離菌株毒力基因擴(kuò)增得到act、aer A、alt、hly A、tap A（圖6），因此，此檢測結(jié)果與維氏氣單胞菌溫和生物型一致。精氨酸雙水解酶、賴氨酸脫羧酶和七葉苷實驗結(jié)果顯示，精氨酸雙水解為陽性，賴氨酸脫羧酶實驗為陰性，七葉苷水解實驗為陰性。維氏氣單胞菌溫和生物型精氨酸雙水解為陰性，賴氨酸脫羧酶實驗為陽性，七葉苷水解實驗為陽性，維氏氣單胞菌維羅納生物型精氨酸雙水解為陽性，賴氨酸脫羧酶實驗為陰性，七葉苷水解實驗為陰性[26]，實驗結(jié)果符合維氏氣單胞菌溫和生物型特征。

圖6 毒力基因擴(kuò)增結(jié)果電泳圖

2.5 藥物敏感性

由表4 可知，菌株AS0829L1 對所測試的37 種抗菌藥物中的β-內(nèi)酰胺類的頭孢曲松、頭孢派酮、頭孢他啶、頭孢呋辛、頭孢唑啉、頭孢銨芐、頭孢拉定，氨基糖苷類卡那霉素、慶大霉素、新霉素、丁胺卡那，磺胺類復(fù)方新諾敏、甲氧芐啶，喹諾酮類環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星；氯霉素類氯霉素，糖肽類多粘霉素B，青霉素類派拉西林鈉，硝基呋喃類呋喃唑酮20種藥物高度敏感；對β-內(nèi)酰胺類羧芐西林，氨基酸苷類鏈霉素，氯霉素類氟苯尼考，福霉素類利福平，米諾環(huán)素類二甲胺四環(huán)素5種藥物中度敏感；對β-內(nèi)酰胺類的青霉素，喹諾酮類的諾氟沙星，大環(huán)內(nèi)酯類的紅霉素、羅紅霉素、麥迪霉素，四環(huán)素類的四環(huán)素、多西環(huán)素，糖肽類的萬古霉素，林可酰胺類的克林霉素、青霉素類阿莫西林、苯唑西林、硝基咪唑類抗生素甲硝唑12種藥物耐藥。

表4 分離菌株AS0829L1藥敏試驗結(jié)果

3 討論

維氏氣單胞菌是一種人、獸、魚共患病原菌，與其他致病菌相比，維氏氣單胞菌感染的魚類物種范圍更廣，可引起蝦類[4]、蟹類[28]、貝類[29]和魚類等水產(chǎn)動物致病。感染維氏氣單胞菌的魚體癥狀各有差異，但主要以皮膚潰瘍，臟器出血和嚴(yán)重腹水等癥狀為主。相關(guān)報道表明，維氏氣單胞可引起鯉魚和鱸魚的紅腫病，病魚腹部出現(xiàn)紅斑，肛門紅腫等癥狀[30-31]；羅非魚、鱸魚、鯽魚、鯉魚、和西伯利亞鱘魚的出血性敗血癥，主要癥狀表現(xiàn)為體表及內(nèi)臟的出血、充血等[32-33]；青蝦的“軟殼綜合征”，主要癥狀表現(xiàn)為軟殼、掉肢、肌肉水腫等[34]；黃顙魚的“潰瘍綜合征”，主要癥狀表現(xiàn)為體表潰瘍和潰爛等[35]。

16S rDNA序列分析是細(xì)菌種屬鑒定的常用方法，但在區(qū)分種間親緣關(guān)系較近的菌株準(zhǔn)確性較差[36]。gyrB基因編碼DNA促旋酶中B亞單位蛋白的基因，在細(xì)菌中普遍存在且不會發(fā)生頻繁的水平轉(zhuǎn)移，更適合親緣關(guān)系較近的菌種鑒別[10]。溫和氣單胞菌和維氏氣單胞菌理化特性比較接近，因此這2 種氣單胞菌在鑒定時容易混淆[37-38]，本研究同時選用16S rDNA和gyrB基因?qū)Σ≡M(jìn)行分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析區(qū)分二者。在生理生化鑒定方面，東秀珠等[26]認(rèn)為增加靛基質(zhì)、V-P 試驗、纖維二糖、甘油、蔗糖產(chǎn)酸，葡萄糖產(chǎn)氣等項目將二者區(qū)分開。Brenner等[1]認(rèn)為通過羊血平板溶血實驗驗證菌株溶血能力也可區(qū)分兩者。

維氏氣單胞菌有維氏氣單胞菌維羅納和維氏氣單胞菌溫和2 種生物型，其中維氏氣單胞菌溫和生物型致病性較強(qiáng)，危害較大[39]。國內(nèi)水生生物感染維氏氣單胞菌的報道多集中在維氏氣單胞菌溫和生物型，其可引起大口黑鱸肝脾腫大、腎臟出血、體表鱗片脫落及出血，腹腔注射攻毒3×107、1.5×108、3×108CFU/mL 可分別導(dǎo)致7%、40%、100%的死亡率[40]；黃鱔全身出血，腹部腫脹，肛門紅腫，解剖可見腸道出血，該菌對黃鱔的半致死濃度約為5.79×107CFU/mL[41]；青蝦掉肢、軟殼、肝胰腺發(fā)黃和肌肉水腫，該菌對青蝦的半數(shù)致死濃度為1.47×106CFU/mL 等[42]。本研究AS0829L1 菌株攻毒健康半刺厚唇魚，出現(xiàn)體表發(fā)紅潰爛、鱗片脫落、尾柄腐爛等癥狀，5×108CFU/mL菌液可導(dǎo)致健康魚體28.6%死亡，與相關(guān)報道的維氏氣單胞菌溫和型相比，該菌株毒力較為溫和，這與自然發(fā)病魚體治療前持續(xù)5 d保持日死亡量20～40條（全池約3000條），未出現(xiàn)爆發(fā)死亡的實際情況相符。

維氏氣單胞菌的致病性與毒力基因的種類、數(shù)量存在一定的相關(guān)性。目前研究對維氏氣單胞的致病機(jī)制了解較少且主要針對單一毒力因子的研究，如氣溶素、溶血素、腸毒素、外膜蛋白、菌毛、鞭毛、蛋白酶、黏附因子等[3]。本研究檢測到了5種毒力基因，其中aerA是一種能引起β型溶血能改變細(xì)胞膜的通透性的穿孔毒素，導(dǎo)致宿主內(nèi)臟器官與體表出血[43-44]；細(xì)胞毒性腸毒素(Act)能夠引起溶血、細(xì)胞毒性和腸毒性；不耐熱細(xì)胞腸毒素(Alt)能夠增加腸上皮細(xì)胞cAMP和前列腺素的水平，刺激宿主促炎反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞凋亡[45]。溶血素hlyA可導(dǎo)致宿主細(xì)胞的滲透性裂解和完全溶血，在維氏氣單胞菌的致病過程中起到關(guān)鍵的作用[46]。tapA參與維氏氣單胞Tap IV 型菌毛形成，Tap 菌毛的生物合成對維氏氣單胞的毒力產(chǎn)生機(jī)制有待進(jìn)一步研究[3]。

細(xì)菌的藥物敏感性與分離菌株的地域、季節(jié)、寄生宿主有很大的關(guān)聯(lián)性。本研究的藥敏實驗共分析了37 種藥物，其中耐藥藥物12 種，包括青霉素、諾氟沙星、紅霉素、羅紅霉素、麥迪霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、萬古霉素、克林霉素、阿莫西林、苯唑西林、甲硝唑。耿昕穎等[47]從東北區(qū)域分離的52 株的維氏氣單胞菌菌株對慶大霉素、阿莫西林、紅霉素全部耐藥，對阿米卡星、磺胺間甲氧嘧啶和阿奇霉素的耐藥率也較高。周光等[48]從團(tuán)頭魴養(yǎng)殖池分離鑒定了56株維氏氣單胞，藥敏實驗結(jié)果表明分離菌株對氨芐西林耐藥，對諾氟沙星、復(fù)方新諾明、洛美沙星的耐藥性也較高。Sáncheza等[49]從虹鱒魚分離的11 株維氏氣單胞菌進(jìn)行耐藥性檢測發(fā)現(xiàn)所有分離的菌株對頭孢拉素類藥物呈現(xiàn)耐藥性。所以從不同地域、不同魚體分離的菌株對抗生素均存在不同程度的抗性，而且耐藥水平存在一定差異。因此在細(xì)菌性疾病防治之前，應(yīng)對病原進(jìn)行藥物敏感試驗，確定敏感藥物，做到精準(zhǔn)、科學(xué)、有效用藥。

4 結(jié)論

本研究對人工養(yǎng)殖出現(xiàn)皮膚潰爛、尾鰭出血、肝臟腫大的半刺厚唇魚進(jìn)行了細(xì)菌的分離鑒定以及藥物敏感性實驗。從癥狀典型的病魚肝組織分離純化到菌株AS0829L1，并由人工回歸感染證實為致病菌。分離菌株理生化特性鑒定，16S rDNA、gyrB 基因序列分析以及毒力基因檢測結(jié)果表明AS0829L1菌株為維氏氣單胞菌溫和生物型。藥物敏感性實驗證明該菌株對頭孢曲松、頭孢派酮、慶大霉素、新霉素、恩諾沙星、氧氟沙星等20種藥物高度敏感，對羧芐西林、鏈霉素、氟苯尼考等5 種藥物中度敏感，對青霉素、諾氟沙星、紅霉素等12種藥物不敏感。