李 濤，李慶梅，王小偉，衛(wèi)麗敏，屈平平

（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東濰坊 261061）

兔大腸桿菌病，是導(dǎo)致規(guī)模化肉兔場幼兔存活率低下和生長發(fā)育受阻的重要疾病之一，是由致病性大腸桿菌及其毒素引起的，以水樣或膠凍樣腹瀉為主要特征，死亡率較高，給養(yǎng)兔業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。目前，兔大腸桿菌病的防控主要以抗生素的使用為主，但是由于長期使用和濫用抗生素，使得耐藥大腸桿菌菌株的產(chǎn)生和傳播愈來愈嚴(yán)重，肉兔大腸桿菌病的防控愈來愈困難[4-5]。

本試驗(yàn)通過對山東地區(qū)肉兔養(yǎng)殖比較密集的地區(qū)（青島、濰坊、臨沂、萊蕪）兔場患腹瀉病死兔進(jìn)行細(xì)菌分離、純化、鑒定，并對分離菌株同源性及耐藥性進(jìn)行了分析，旨在為規(guī)?；馔脠龈篂a病綜合防控提供一定的建議。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品

用于分離大腸腸桿菌的病料來源于患腹瀉病死亡的病兔心臟、肝臟、腸系膜淋巴結(jié)等病變組織。

1.1.2 主要儀器與試劑

營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、伊紅美蘭培養(yǎng)基、麥基康凱培養(yǎng)基均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；革蘭氏細(xì)菌染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，細(xì)菌藥敏試紙盒購自杭州濱河微生物試劑有限公司。

超凈工作臺、生化培養(yǎng)箱、水浴鍋、恒溫?fù)u床均購自上海博訊科技有限公司。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

采用PCR 的方法獲得細(xì)菌16S rRNA，通用引物序列為：F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'；R：5'-TACGCYTACCTTGTTACGACTT-3'，擴(kuò)增片段大小約為1459p，該引物由上海生工有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大腸桿菌分離與純化

將因患腹瀉病死亡的病兔（死亡時(shí)間小于12h）剖檢，在無菌條件下取心臟、肝臟、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)，涂抹于普通營養(yǎng)瓊脂平板，37℃生化培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。次日挑取單個(gè)可疑菌落，接種于伊紅美蘭培養(yǎng)基，37℃生化培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。次日將疑似大腸桿菌的菌落，再接種于麥康凱培養(yǎng)基，37℃生化培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，再次鑒定。二次鑒別培養(yǎng)后，將可疑菌株重新接種于營養(yǎng)瓊脂平板，重復(fù)3～4 次，獲得細(xì)菌純培養(yǎng)物，挑取可疑單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭染色，鏡檢。

1.2.2 16S rRNA 基因測序及同源性分析

將純化好的疑似大腸桿菌的菌株送至上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行16S rRNA 基因測序，并在NCBI 數(shù)據(jù)庫，運(yùn)用Blast 軟件進(jìn)行比對。然后利用ggtree 軟件進(jìn)行同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 大腸桿菌耐藥性分析

選取10 種常用臨床抗菌藥物，采用Kirby-Bauer 紙片擴(kuò)散法進(jìn)行。用滅菌棉拭子蘸取菌液均勻涂布在普通培養(yǎng)基表面，靜置3～5min 后用鑷子夾取藥敏片放置在培養(yǎng)基上，靜置15min后于37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)24h。藥敏結(jié)果根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室國家標(biāo)準(zhǔn)化委員會(NC-CLS)制定的標(biāo)準(zhǔn)判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌菌落形態(tài)和鏡檢結(jié)果

將普通營養(yǎng)瓊脂平板中分離到的可疑單菌落（凸起、不透明、圓形、扁平、邊緣整齊、表面光滑、濕潤的白色菌落）（圖1），劃線接種于伊紅美蘭培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基上，置37 ℃恒溫培養(yǎng)24h。在伊紅美蘭培養(yǎng)基，可見深紫黑色、光滑、濕潤、帶有金屬光澤的圓形菌落（見圖2）。在麥康凱培養(yǎng)基表現(xiàn)為邊緣整齊、表面濕潤、光滑、桃紅色的圓形小菌落（圖3）。挑取單個(gè)菌落涂片固定進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢可見兩端鈍圓、成對或散在存在的紅色短小桿菌（圖4）。

圖1 LB 固體培養(yǎng)基上的菌落

圖2 伊紅美蘭培養(yǎng)基上的菌落

圖3 麥康凱培養(yǎng)基上的菌落

圖4 大腸桿菌革蘭氏染色（×100）

2.2 16S rRNA 測序結(jié)果及同源性分析

經(jīng)過克隆測序比對后發(fā)現(xiàn)22 株菌的16S rRNA 基因序列與大腸桿菌的16S rRNA 序列同源性為99%以上（表1）。根據(jù)Mat suki 的研究，凡是16S rRNA 序列的同源性大于97%便可認(rèn)為是同一種，進(jìn)一步驗(yàn)證了分離純化到的菌株為大腸桿菌。通過ggtree 軟件對22 株大腸桿菌菌株同源性分析，發(fā)現(xiàn)從青島地區(qū)分離的菌株與從濰坊地區(qū)分離的菌株具有較高的同源性，而從臨沂地區(qū)分離的菌株與從萊蕪地區(qū)分離的菌株具有較高的同源性（圖5），說明規(guī)?；脠鲋虏⌒源竽c桿菌的同源性具有明顯的地區(qū)特征。

表1 22 株大腸桿菌擴(kuò)增基因片段長度及比對結(jié)果

圖5 22 株大腸桿菌的同源性

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

由表2 和表3 可知，22 株大腸桿菌中，77.27%菌株對大觀霉素較敏感，68.18%菌株對丁胺卡那較為敏感。50%以上的菌株對慶大霉素、鏈霉素、氟苯尼考、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、多西環(huán)素、氨芐西林具有較強(qiáng)耐藥性。由表4 可見，注：菌株QDTE1～QDTE5，來源于青島地區(qū)；菌株WFTE1～WFTE6，來源于濰坊地區(qū)；菌株LYTE1～LYTE5，來源于臨沂地區(qū)；菌株LWTE1～LWTE6，來源于萊蕪地區(qū)。18.18%菌株耐受8 種藥物，22.73%菌株耐受7 種藥物，22.73%菌株耐受6 種藥物，對5 種以上藥物耐藥的菌株占比59.09%。因此，本項(xiàng)目分離的腸致病性大腸桿菌為多重耐藥性菌株。

表2 22 株大腸桿菌藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果（抑菌圈直徑） 單位：mm

表3 22 株大腸桿菌對10 種抗生素的耐受性

表4 22 株大腸桿菌多重耐藥情況

3 討論

研究表明由于抗生素的濫用和超量使用，使得細(xì)菌的耐藥性越來越嚴(yán)重，甚至出現(xiàn)了一些超級細(xì)菌[6-8]。李重陽等[9]對濱州市地區(qū)分離的35 株兔大腸桿菌對27 種常用藥物的耐藥性情況進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果表明，80%菌株產(chǎn)生多重耐藥性，僅對頭孢曲松和頭孢哌酮兩種抗生素的敏感性較高。劉照波等[10]從山東濰坊某兔場發(fā)生腹瀉死亡的病兔，分離了2 株大腸桿菌，藥敏試驗(yàn)顯示2株大腸桿菌對替米考星、丁胺卡那敏感，對安普霉素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、強(qiáng)力霉素、氟苯尼考耐藥性較為嚴(yán)重。欒慧慧等[11]對山東省茌平、蒙陰、泰安、諸城和萊蕪五個(gè)地區(qū)的7 個(gè)規(guī)?；脠龇蛛x的的兔腸致病性大腸桿菌進(jìn)行耐藥性分析，結(jié)果顯示，不同地區(qū)兔場所分離的大腸桿菌菌株對常用抗菌藥物的耐受程度和耐藥種類各不相同，多重耐藥菌株占比為79.25%。耐藥類型則以3 耐（15.09%）、5 耐（15.09%）和11 耐（11.32%）占比較高，且在2～6 耐和11～12 耐較為集中，多重耐藥菌株存在地域差異，以茌平和蒙陰兔場致病菌株的多重耐藥現(xiàn)象最為突出，耐藥譜型寬，耐藥程度嚴(yán)重，諸城兔場分離株譜型較窄，耐藥現(xiàn)象輕微。而本試驗(yàn)分離的22 株兔致病性大腸桿菌對常用抗生素耐藥情況與上述研究結(jié)果稍有不同，但22 株兔大腸桿菌均屬于多重耐藥菌株。

4 小結(jié)

大腸桿菌多重耐藥性的產(chǎn)生是兔大腸桿菌病的防控難度增加的主要原因之一，必須引起一線獸醫(yī)的高度重視。建議大腸桿菌病頻發(fā)的兔場先通過藥敏試驗(yàn)篩選出對本地區(qū)大腸桿菌敏感的抗生素，規(guī)范的、合理的使用敏感藥物針對性的給與治療，嚴(yán)禁盲目、過量使用抗菌藥物。同時(shí)還急需高校及科研院所尋求新型的、不易產(chǎn)生耐藥性的抗生素替代品，如中藥提取物或噬菌體等，加快新型抗菌藥物的開發(fā)及應(yīng)用。