李 姍

（湖北大學(xué)，湖北 武漢 430062）

水稻在國計(jì)民生和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面有著重要的影響，是最普遍的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)作物品種之一。水稻生長期間一旦發(fā)生水淹，會引起水稻缺氧，植株會通過厭氧呼吸來獲取氧份（養(yǎng)份）維持其基本的生理活動(dòng)，同時(shí)會產(chǎn)生乙醇。若水稻植株長時(shí)間處于缺氧狀態(tài)，則會因產(chǎn)生過多的乙醇而中毒，造成稻秧植株組織潰敗，導(dǎo)致植株萎縮或死株等。缺氧在很大程度上還會加重水稻稻瘟病、立枯病的發(fā)生，是制約水稻生產(chǎn)的重要因素。

2019 年孫凱等人利用200 份來源廣泛的水稻種質(zhì)為材料，在有氧環(huán)境下進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)，測量種子萌發(fā)率、萌發(fā)指數(shù)和活力指數(shù)；在低氧條件下測量芽鞘長和芽鞘直徑；進(jìn)行耐淹成苗試驗(yàn)，測定耐淹成苗率。發(fā)現(xiàn)種子活力、芽鞘長與耐淹成苗率密切相關(guān)，可作為篩選高耐淹成苗水稻材料的重要性狀。進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)分析、轉(zhuǎn)錄組分析與基因表達(dá)模式比較的聯(lián)合應(yīng)用，可提高候選基因的篩選效率。分析了影響耐淹成苗率的關(guān)鍵表型性狀，挖掘相關(guān)的遺傳位點(diǎn)和候選基因[1]。2020 年王杰等人對水稻育種發(fā)展趨勢進(jìn)行了分析，綜述了水稻耐淹水萌發(fā)表型的遺傳研究、基因鑒定、連鎖分子標(biāo)記開發(fā)等工作，并指出了該領(lǐng)域應(yīng)用研究的關(guān)鍵問題[2]。2021 年孫志廣等人對來自不同年代和地區(qū)的191 份粳稻種質(zhì)資源進(jìn)行了萌發(fā)耐淹性鑒定，共獲得12份萌發(fā)耐淹性強(qiáng)的種質(zhì)資源，其中連粳15號表現(xiàn)出較強(qiáng)的低氧萌發(fā)能力。利用其與秈稻品種構(gòu)建的分離群體，采用模擬大田的鑒定方法，在水稻1號、3號、9號、10號染色體上共檢測到4個(gè)QTL[3]。

雖然已有較多的水稻低溫萌發(fā)農(nóng)藝性狀的研究報(bào)道，但針對耐淹萌發(fā)的表現(xiàn)和遺傳鑒定研究較少。本研究利用具有遺傳多樣性的種質(zhì)資源構(gòu)建自然群體，結(jié)合實(shí)驗(yàn)采集、分析水稻遺傳數(shù)據(jù)，以期為選育耐淹品種、提高水稻產(chǎn)量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)以200 份常規(guī)粳稻為試驗(yàn)材料，來自于東鄉(xiāng)野生導(dǎo)入系自然群體。

1.2 試驗(yàn)試劑

本實(shí)驗(yàn)所用試劑包括次氯酸鈉、無水乙醇、氫氧化鈉、乙二胺四乙酸、瓊脂糖、蛋白胨、酵母提取物、硼酸、氯化鎂、曲拉通、肌醇、蔗糖、葡萄糖、硝酸鉀、硫酸銨、硫酸鎂、硫酸銅、硫酸亞鐵、硫酸鋅、磷酸二氫鉀、鉬酸鈉、谷氨酰胺、脯氨酸、水解酪蛋白等。

實(shí)驗(yàn)所用滅菌水為超純水，DNA 提取液采用EDTA 法配制。

1.3 試驗(yàn)設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋、電子天平、離心機(jī)、植物組織破碎儀、漩渦振蕩器、磁力攪拌器、pH 計(jì)、移液槍、PCR 儀、微波爐、電泳儀、電泳槽、恒溫?fù)u床、光照培養(yǎng)箱、根系掃描儀。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 種子萌發(fā)試驗(yàn)

200份自然群體材料，每個(gè)材料設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)內(nèi)分2 次技術(shù)重復(fù)，每個(gè)技術(shù)重復(fù)取100粒種子，放置在鋪好的兩層中速定性濾紙的9 cm 直徑培養(yǎng)皿上，加10 mL 超純水，蓋上培養(yǎng)皿蓋子，放置在恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)箱內(nèi)溫度設(shè)置為30℃，光照設(shè)置為光照8 h、無光照16 h。每隔24 h 測量記錄萌發(fā)種子個(gè)數(shù)持續(xù)7 d，第7 d 記錄未萌發(fā)種子數(shù)，測量萌發(fā)率、萌發(fā)勢、萌發(fā)指數(shù)和活力指數(shù)。

式中：Gt——第t天新萌發(fā)的正常幼苗數(shù)；Dt——萌發(fā)的天數(shù)。

1.4.2 淹水低氧萌發(fā)試驗(yàn)

200份自然群體材料，每個(gè)材料設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)內(nèi)份4 次技術(shù)重復(fù)，每個(gè)技術(shù)重復(fù)取5 粒種子（篩選去除空粒、癟粒的種子），放置在50 mL 透明塑料離心管中，加滿超純水并蓋緊蓋子造成淹水低氧環(huán)境，放置在恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，培養(yǎng)箱內(nèi)溫度設(shè)置為30℃，光照設(shè)置為光照8 h、無光照16 h。6 d 后用根系掃描儀測量芽鞘長度及芽鞘直徑。

1.4.3 遺傳圖譜構(gòu)建/全基因組關(guān)聯(lián)分析

采用瓊脂糖凝膠電泳分析DNA 的純度和完整性，Nanodrop 檢測DNA純度，Qubit 進(jìn)行濃度分析定量。

采用GWAS 專業(yè)分析軟件，采用混合線性模型，對群體結(jié)構(gòu)和個(gè)體親緣關(guān)系進(jìn)行校準(zhǔn)，同時(shí)減少計(jì)算時(shí)間。并利用已經(jīng)公布的SNP 數(shù)據(jù)，對不同群體的相關(guān)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，查找出潛在的候選的基因點(diǎn)位。

1.4.4 篩選候選基因/關(guān)聯(lián)位點(diǎn)分析

如果某一個(gè)SNP 位點(diǎn)與表型性狀呈顯著關(guān)聯(lián)，那么就認(rèn)為這個(gè)SNP 與表型數(shù)據(jù)存在協(xié)同變異關(guān)系。根據(jù)和水稻基因組注釋，查找與其相關(guān)的基因作為重要的候選基因。根據(jù)己發(fā)表的文章，查找己定位的QTL，查找在水稻中存在的同源基因。與GWAS 顯著峰值位點(diǎn)進(jìn)行比對，查找到候選基因。

2 試驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 水稻種子正常萌發(fā)表現(xiàn)

對200 份自然群體材料在正常條件下的10 個(gè)表型進(jìn)行調(diào)查。其中萌發(fā)指數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤差最大，是0.681 5，正常苗干質(zhì)量和正常根干質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)誤差最小，是0.000 1；說明萌發(fā)指數(shù)的離散程度最大，品種間的差異也越大。正常根干質(zhì)量變異系數(shù)最大，是0.393 4，萌發(fā)率變異系數(shù)最小，是0.051 6。

2.2 水稻種子水淹低氧萌發(fā)表現(xiàn)

低氧條件處理200 份自然群體材料，對群體材料的芽鞘長、芽鞘直徑、苗長、總根長、苗鮮質(zhì)量、根鮮質(zhì)量、苗干質(zhì)量以及根干質(zhì)量進(jìn)行調(diào)查并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。其中總根長標(biāo)準(zhǔn)誤差最大，是0.106 7，苗干質(zhì)量和低氧根干質(zhì)量最小，接近零說明低氧總根長的離散程度最大，品種間的差異也越大。根干質(zhì)量變異系數(shù)最大，是0.457 6，芽鞘直徑變異系數(shù)最小，是0.073 2。

表1 正常萌發(fā)與水淹低氧萌發(fā)數(shù)據(jù)對比Tab.1 Comparison of normal germination and waterlogged hypoxic germination data

2.3 關(guān)聯(lián)位點(diǎn)分析

使用Plink 軟件，將等位基因頻率MAF＞0.05 和缺失率＜0.1作為閾值，對所選擇的200份自然群體材料的SNP數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選。群體分層分析主要分為群體進(jìn)化樹分析和主成分分析，兩者的結(jié)果可以進(jìn)行相互驗(yàn)證[4，5]。距離矩陣采用TreeBest 軟件計(jì)算，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。引導(dǎo)值經(jīng)過達(dá)1 000 次計(jì)算獲得；此群體主要可分為兩個(gè)亞群，第一個(gè)亞群共6個(gè)材料，另外一個(gè)亞群包括其他194材料。

利用200 份水稻自然群體品種進(jìn)行簡化基因組測序，基因組大小為374424240bp，群體樣本平均比對率為96.17%，對基因組的平均測序深度為14.16X，平均覆蓋度為11.24%，至少有4 四個(gè)堿基的覆蓋度為5.99%。SAMTOOLS 軟件檢測共獲 得 了652 457 個(gè)SNP 位 點(diǎn)，經(jīng) 過 條 件 為dp2、Miss0.9、Maf0.01 的過濾后，最后共獲得了161 657 個(gè)高質(zhì)量的SNP 位點(diǎn)用于后續(xù)分析。對200份材料的耐淹苗干質(zhì)量進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，共檢測到了10 個(gè)與耐淹苗干質(zhì)量相關(guān)的SNP位點(diǎn)，基于水稻基因組注釋，依據(jù)LD 衰退水平，本研究在關(guān)聯(lián)SNP 位點(diǎn)上下游區(qū)域，共檢測到227 個(gè)基因，對其中9 個(gè)與本研究相關(guān)的基因進(jìn)行注釋。在關(guān)聯(lián)位點(diǎn)Chr01_35309315 附近找到了一個(gè)與WRKY24 轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的基因；在Chr08_20219220 位點(diǎn)附近找到了3 個(gè)基因，分別為編碼含CCHC 型結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白基因，編碼含PHD 型結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白基因以及編碼含CAH1 結(jié)構(gòu)域碳酸酐酶基因；在Chr08_19427880 位點(diǎn)附近找到了4 個(gè)基因，分別是編碼乙醇脫氫酶基因，編碼亮氨酰-tRNA 合成酶基因和兩個(gè)編碼含PHD 型結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白基因；在Chr12_10787959 位點(diǎn)附近找到了一個(gè)編碼熱休克蛋白DnaJ 的基因。

3 結(jié)論

對200 份水稻品種的萌發(fā)耐淹性檢測結(jié)果表明，水稻群體內(nèi)耐淹萌發(fā)性狀存在廣泛的表型變異。主要成分分析說明水稻群體內(nèi)部存在明顯的群體結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)對于關(guān)聯(lián)分析有著較強(qiáng)的影響。利用主要成分作為關(guān)聯(lián)分析的協(xié)變量，可以提高關(guān)聯(lián)分析的準(zhǔn)確度。對200份材料的耐淹水稻干重進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，共檢測到了10個(gè)與耐淹水稻干重相關(guān)的SNP 位點(diǎn)，基于水稻基因組注釋，通過LD 衰減水平，在的關(guān)聯(lián)SNP 位點(diǎn)上下游區(qū)域檢測到227 個(gè)基因，對其中9 個(gè)為關(guān)聯(lián)候選基因。在對更有代表性的核心種質(zhì)進(jìn)行評價(jià)時(shí)，發(fā)現(xiàn)粳稻萌發(fā)耐淹能力并不是單純的較強(qiáng)，而是表現(xiàn)出較大的差異，這不同于侯名語（2004）等人的研究，他們提出了粳稻和粳稻萌發(fā)耐淹能力不同，粳稻的萌發(fā)耐淹能力也不同，而且可能表現(xiàn)出較強(qiáng)的缺氧萌發(fā)能力[6]。這很可能是因?yàn)樗x擇的實(shí)驗(yàn)材料的差異。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)胚芽鞘長為2.0～2.3 cm 的種質(zhì)資源占比最多，達(dá)到48.2%，群體變異率為27.9%這說明粳稻品種的萌發(fā)耐淹性存在著廣泛的遺傳變異，這與王洋等（2009）研究結(jié)果相一致[7]。在該研究中，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)QTL位點(diǎn)控制兩個(gè)或多個(gè)性狀的現(xiàn)象，曾長英（2006）指出QTL 的“多效性”是指同一QTL 位點(diǎn)同時(shí)作用于兩個(gè)或多個(gè)數(shù)量性狀，并對多個(gè)性狀起調(diào)控作用[8]，而前期工作也證實(shí)了該現(xiàn)象。