崔琳,肖洪賀,李賀,田雨,田晉明,趙宇萌,楊靜嫻

(遼寧中醫(yī)藥大學藥學院,遼寧 大連 116000)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是一種由多因素引起的,最常見的中樞神經退行性疾病,以記憶力減退和認知障礙為主要表現。隨著當今社會人口結構的不斷變化,老齡化人口不斷增加,該病的發(fā)病率逐年增加,給人類帶來了沉重的經濟及社會負擔[1-2]。迄今為止,該病的發(fā)病機制并不十分明確,普遍認為tua蛋白過度磷酸化形成神經纖維纏結(NFT)、β-淀粉樣蛋白沉積形成老年斑和突觸丟失是其主要病理特征。目前,國內外現有藥物只能部分緩解AD早期癥狀,無法阻止或逆轉AD病情進展。因此,我們需要在更廣闊的領域尋找并開發(fā)能夠修復、替代受損神經元的藥物,對治療AD等神經退變性疾病具有重要的社會意義和經濟價值[3-4]。

淫羊藿(EpimediumbrevicornuMaxim.)屬小檗科草本植物,又名仙靈脾,始載于《神農本草經》,性溫,味辛、甘,歸肝、腎經,具有神經保護、補腎壯陽、祛風除濕、強筋骨等功效[5-6]。近年研究發(fā)現,傳統(tǒng)醫(yī)學中補腎益精的中藥如淫羊藿、人參、獨活等,能夠抑制Aβ沉積,促進神經再生,發(fā)揮神經保護作用[7-9]。大量研究證實,淫羊藿及其活性成分具有廣泛的神經保護作用[10],但是否能通過激活環(huán)磷酸腺苷效應元件結合蛋白/腦源性神經營養(yǎng)因子(CREB/BDNF)信號通路來改善APP/PS1雙轉基因小鼠的認知功能尚未見報道。本研究擬采用筑巢試驗和Morris水迷宮試驗探究淫羊藿能否改善APP/PS1雙轉基因小鼠的認知功能,然后采用H&E染色、Nissl染色、免疫熒光等方法評價其作用途徑,最后采用Western bot方法檢測CREB/BDNF信號通路關鍵蛋白表達情況,明確淫羊藿的作用機制,以期為淫羊藿用于治療AD提供進一步的科學依據。

1 材料

1.1 主要儀器 MS-1型水迷宮分析系統(tǒng)(成都儀器廠);Ti-S型熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司);HM525NX型冷凍切片機(賽默飛世爾儀器有限公司);DW-86L386型超低溫冰箱(青島海爾公司);PowerPac Universal Power Supply型通用電泳儀(美國Bio-Rad公司);Trans-Blot SD型半干式蛋白轉膜儀(美國Bio-Rad公司);Tanon-5200Multi凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

1.2 主要藥品與試劑 淫羊藿(陽光大藥房);Nissl染色試劑盒、蘇木素伊紅染色試劑盒(碧云天生物技術有限公司,批號分別為C0117、C0105S);兔抗Aβ多克隆抗體(Signalway Antibody,批號:#40587);兔抗BDNF多克隆抗體、兔抗GAPDH多克隆抗體(萬類生物科技有限公司,批號分別為WL0999、WL01114);FITC標記山羊抗兔IgG、兔抗CREB多克隆抗體、兔抗磷酸化CREB(p-CREB)多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司,批號分別為bs-0295G、bs-0035R、bs-0036R);辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗(武漢賽維爾生物科技有限公司,批號:GB23303)。

1.3 動物 3月齡SPF級APP/PS1小鼠(雄性)[合格證號:SCXK(蘇)2020-0009,江蘇華創(chuàng)信諾醫(yī)藥科技有限公司];SPF級C57BL/6小鼠[雌性,合格證號:SCXK(遼)2017-0001,遼寧長生生物有限公司]。飼養(yǎng)于溫度20～25 ℃,相對濕度 40%～60%環(huán)境中,每天12 h光照維持,晝夜循環(huán),自由攝食、飲水。雄性APP/PS1小鼠和雌性C57BL/6小鼠合籠繁殖,鑒定APP/PS1陽性小鼠,飼養(yǎng)至7月齡用于試驗,同窩出生的陰性C57BL/6小鼠作為空白對照組。本研究已通過遼寧中醫(yī)藥大學動物倫理審查,批號:21000042021133。

2 方法

2.1 動物分組與給藥 取7月齡雄性APP/PS1雙轉基因小鼠30只,按體重隨機分為模型對照組和淫羊藿組,每組15只;另取15只同齡的雄性C57BL/6小鼠作為空白對照組。淫羊藿組灌胃給予3 g·kg-1的藥物溶液,每天1次,連續(xù)28 d;空白組和模型組給予等體積0.3% CMC-Na。

2.2 筑巢試驗 淫羊藿給藥第17天后,將小鼠按不同組別進行單籠飼養(yǎng),墊料換為玉米芯,適應2 d后,試驗當天下午更換新的玉米芯墊料,并在投料口處放置兩疊衛(wèi)生紙片(5 cm×5 cm),每疊10張。觀察各小鼠筑巢,參照5分法進行評分,連續(xù)觀察3 d,并拍照記錄。評分標準為:紙片沒有明顯觸碰和撕咬(1分):部分紙片被撕碎(2分):大部分紙片被撕成碎片,但沒有形成明顯的巢狀(3分);紙巾被撕成碎片,并聚集形成一個比較成扁平的巢狀結構(4分);紙片被撕成碎片,并聚集形成一個完整或接近完整的巢狀結構(5分)。

2.3 Morris水迷宮試驗 Morris水迷宮(Morris water maze,MWM)裝置由一個黑色內壁的圓桶(直徑120 cm×高60 cm)、攝像頭及自動圖像采集分析系統(tǒng)組成。將桶內分成東、西、南、北4個象限,將逃生平臺(直徑10 cm)置于其中一個象限內,水面沒過平臺0.5 cm,溫度控制在(20±1)℃。給藥第22天后采用水迷宮試驗檢測小鼠學習和記憶能力。MWM試驗歷時6 d,試驗前5 d進行定位航行實驗,第6天進行空間探索實驗。①定位航行實驗:訓練時將小鼠從任一象限1/2弧度處面朝池壁、沿池壁邊緣輕放于水中,如果小鼠在60 s內未找到平臺,則引至平臺停留20 s,每天4個象限各訓練一次。連續(xù)訓練5 d,每只小鼠的學習能力等相關數據經拍攝系統(tǒng)采集、分析,以每天小鼠的平均逃避潛伏期來評估小鼠的學習能力。②空間探索實驗:第6天,撤去平臺,將小鼠由原平臺所在的對側象限面朝池壁放入水中,根據小鼠在60 s內的穿越原平臺次數、平臺所在象限停留時間百分比和第1次穿越平臺前的游泳距離,評估小鼠的空間記憶能力。

2.4 取材 行為學實驗結束后,各組小鼠腹腔注射4%水合氯醛深度麻醉小鼠并處死,取腦組織,部分置于預冷的磷酸鹽緩沖液中暫時保存,備用。另一部分置于30%蔗糖溶液,4 ℃沉降過夜。次日,冰凍包埋劑包埋,-80 ℃放置過夜,采用冰凍切片機對腦組織進行連續(xù)冠狀切片(厚度為10 μm),-20 ℃凍存,備用。

2.5 H&E染色 取“2.4”項下腦組織冰凍切片,室溫平衡5 min后,用4%多聚甲醛固定15 min,ddH2O潤洗3次,置于50 ℃的蘇木素染液中染色5 min,ddH2O潤洗3次;置于1%鹽酸-乙醇分化液中分化10～15 s,ddH2O潤洗3次,置于0.5% 氨水反藍液中10 s,ddH2O潤洗;依次經70%、80%、95%乙醇脫水,二甲苯透化5 min,中性樹脂膠封片,在顯微鏡下觀察皮層和海馬組織形態(tài)變化情況。

2.6 Nissl染色 取“2.4”項下腦組織冰凍切片,室溫平衡5 min后,用4%多聚甲醛固定15 min;ddH2O潤洗3次,放入Nissl染液中,待尼氏體清晰后終止反應,ddH2O洗滌3次;快速在70%、100%乙醇中脫水5 s,二甲苯透化5 min,中性樹膠進行封片。顯微鏡下觀察皮層、海馬CA3和海馬DG區(qū)尼氏體數量。

2.7 小鼠腦組織中氧化應激指標水平的檢測 取“2.4”項下各組小鼠的腦組織,去除嗅球、小腦和腦干部分,保留大腦皮層和海馬組織,合并后制成組織勻漿液,再根據試劑盒說明書方法操作,檢測小鼠腦組織中SOD、MDA水平。

2.8 免疫熒光化學法檢測β-淀粉樣蛋白的表達 取腦組織冰凍切片,室溫平衡5 min后,用4%多聚甲醛固定30 min;PBS清洗3次;0.5% Triton X-100透化30 min;PBS清洗3次;5% BSA溶液室溫封閉1 h,加入兔抗Aβ1-42一抗稀釋液(1∶300),4 ℃避光孵育過夜,PBS清洗3次,然后加FITC標記的山羊抗兔二抗稀釋液(1∶300),室溫避光孵育1～2 h,DAPI染細胞核3 min,PBS清洗3次,滴加抗熒光淬滅劑,封片,倒置顯微鏡下觀察并拍照。

2.9 Western blot法檢測CREB、BDNF通路相關蛋白表達情況 取小鼠腦組織,剝離海馬組織,加入RIPA裂解液、1% PMSF和50×蛋白酶-磷酸酶抑制劑提取總蛋白,BCA法檢測蛋白濃度。蛋白樣品按4∶1體積比加入5×Loading buffer,煮沸5 min,進行凝膠電泳,2 h后轉膜,室溫條件下5% 脫脂奶粉封閉2 h,PBST緩沖液清洗3次,分別加入兔抗CREB、p-CREB、BDNF一抗稀釋液(1∶300),和兔抗GAPDH一抗稀釋液(1∶500),4 ℃孵育過夜,次日加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗(1∶500),室溫孵育2 h;滴加ECL工作液,并以凝膠成像系統(tǒng)成像。采用Image J軟件分析灰度值。

3 結果

3.1 筑巢試驗檢測APP/PS1雙轉基因小鼠的生活能力 如圖1所示,空白對照組小鼠在投放紙片的24 h內即出現筑巢行為,在72 h之內紙片被撕成小碎片,并筑成完整的巢狀結構(見圖1A),而模型組APP/PS1雙轉基因小鼠沒有將紙片撕成碎片,在72 h內紙片散落在鼠籠里,沒有筑成完整的巢狀結構(見圖1A),筑巢評分明顯低于空白對照組(見圖1B,P<0.01);淫羊藿組小鼠在24 h 內出現筑巢行為,72 h內大部分紙片被撕成碎片,形成較為完整的巢狀結構(見圖1A),筑巢評分與模型組比較明顯提高(見圖1B,P<0.01)。以上結果表明,淫羊藿能夠明顯改善APP/PS1雙轉基因小鼠生活能力。

A.筑巢行為經典圖;B.筑巢評分統(tǒng)計圖圖1 筑巢試驗檢測淫羊藿對APP/PS1雙轉基因小鼠生活能力的影響(n=10) 注:與空白組比較,##P<0.01;與模型組比較,**P<0.01

3.2 淫羊藿對APP/PS1雙轉基因小鼠學習記憶能力影響 如圖2所示,從訓練的第3天開始,與空白組比較,APP/PS1雙轉基因小鼠的逃避潛伏期明顯增加(見圖2B,第5天時P<0.01),目標象限停留時間減少(見圖2F,第5天時P<0.01),游泳距離增加(見圖2D,第5天時P<0.01),而穿越平臺次數顯著降低(見圖2E,第5天時P<0.01)。與模型組比較,淫羊藿組逃避潛伏期和游泳距離顯著縮短,目標象限停留時間百分比和穿越平臺次數顯著增加。各組小鼠的游泳速度無明顯差異(見圖2C,P<0.01),說明以上指標的改變并不是游泳速度不同導致的。以上結果提示,淫羊藿能夠改變APP/PS1雙轉基因小鼠學習和記憶能力。

A.定位航行軌跡圖;B.逃避潛伏期;C.游泳速度;D.游泳距離;E.穿越平臺次數;F.第三象限停留時間百分比圖2 Morris 水迷宮試驗檢測淫羊藿對APP/PS1雙轉基因小鼠學習記憶能力的影響(n=10) 注:與空白組比較,#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01

3.3 淫羊藿對APP/PS1雙轉基因小鼠腦組織病理損傷的影響 如圖3A所示,空白組小鼠皮層、海馬CA3區(qū)和DG區(qū)的神經細胞數量多,層次清晰,胞質豐富,細胞核大而圓,胞漿、胞核染色均勻,組織形態(tài)結構正常;模型組小鼠皮層、海馬CA3區(qū)和DG區(qū)的神經細胞數目明顯減少,且排列松散,形態(tài)不規(guī)則,細胞核深染、固縮,神經細胞空泡化明顯,說明模型組小鼠腦組織明顯受損;經淫羊藿治療后,神經細胞數目較模型組明顯增多,層次較為清晰,胞漿、胞核染色均勻,細胞核固縮明顯減輕,說明淫羊藿可減輕APP/PS1雙轉基因小鼠腦組織損傷。

A.H&E染色;B.Nissl染色;C～E.尼氏體數量統(tǒng)計圖圖3 淫羊藿對APP/PS1雙轉基因小鼠腦組織結構的影響(n=3) 注:與空白組比較,#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01

如圖3B所示,與空白組比較,模型組小鼠皮層、海馬CA3區(qū)和DG區(qū)的尼氏體模糊不清,排列疏松,數量明顯減少(圖3C～E,皮層:P<0.01,海馬CA3區(qū):P<0.01,海馬DG區(qū):P<0.01);經淫羊藿治療后小鼠皮層、海馬CA3區(qū)和DG區(qū)的尼氏體顏色加深,排列緊密,數量明顯增多(圖3C～E,皮層:P<0.01,海馬CA3區(qū):P<0.01,海馬DG區(qū):P<0.05)。以上結果表明,淫羊藿能夠明顯改善APP/PS1雙轉基因小鼠腦組織結構損傷。

3.4 淫羊藿對APP/PS1雙轉基因小鼠腦組織中氧化應激指標水平的影響 如圖4所示,與空白組比較,模型組小鼠腦組織中MDA水平顯著升高(P<0.01),SOD水平顯著降低(P<0.01);與模型組比較,淫羊藿組小鼠腦組織中上述指標水平均顯著逆轉(P<0.01)。

圖4 淫羊藿對APP/PS1雙轉基因小鼠腦組織中MDA和SOD水平的影響(n=8) 注:與空白組比較,##P<0.01;與模型組比較,**P<0.01

3.5 淫羊藿對APP/PS1小鼠腦內β-淀粉樣蛋白沉積的影響 如圖5所示,與空白組比較,模型組小鼠腦內β-淀粉樣蛋白沉積明顯增多,而經淫羊藿治療后,小鼠腦內斑塊數量明顯減少。以上結果表明,淫羊藿能夠減少小鼠腦內β-淀粉樣蛋白沉積。

圖5 淫羊藿對APP/PS1小鼠腦內β-淀粉樣蛋白沉積的影響 注:綠色代表Aβ斑塊;DG:Dentate gyrus,海馬齒狀回;Cortex:大腦皮層

3.6 淫羊藿對CREB、BDNF通路相關蛋白表達的影響 如圖6所示,與空白組比較,模型組小鼠腦組織中CREB蛋白磷酸化水平和BDNF蛋白表達水平均顯著下調(P<0.01);與模型組相比,淫羊藿組小鼠腦組織中CREB蛋白磷酸化水平和BDNF蛋白表達水平均顯著逆轉(P<0.01)。以上結果表明,淫羊藿通過激活CREB/BDNF信號通路改善APP/PS1雙轉基因小鼠的認知功能。

圖6 淫羊藿對APP/PS1雙轉基因小鼠CREB/BDNF信號通路相關蛋白表達的影響 注:與空白組比較,##P<0.01;與模型組比較,**P<0.01

4 討論

中醫(yī)將AD歸屬于“呆病”“癡呆”等范疇,其病位在腦,與腎密切相關?！鹅`樞·海論》曰:“腦為髓之海”“髓海有余,則輕勁多力,自過其度”“髓海不足,則腦轉耳鳴,脛酸眩冒,目無所見,懈怠安臥”。髓海不足則出現癡呆[11-12]。因此中醫(yī)認為治療AD應注重補腎填精、益髓養(yǎng)腦。淫羊藿是臨床上常用的補腎填精藥,《本草備要》載其“補命門,益精氣,堅筋骨”,可用于腎陽虛衰,陽痿遺精,風濕痹痛,筋骨痿軟[13]。本研究發(fā)現,給予模型動物淫羊藿治療后,小鼠逃避潛伏期減少和穿越平臺次數增加,這說明淫羊藿可改善APP/PS1雙轉基因小鼠的學習和記憶能力。

CREB-BDNF信號通路在神經細胞修復和神經功能的恢復中具有重要作用。CREB是神經系統(tǒng)中重要的核轉錄因子,在基因轉錄、促進神經元再生與保護、突觸形成、學習記憶及生活能力等方面發(fā)揮重要調節(jié)作用,可通過促進下游BDNF的分泌,發(fā)揮神經細胞的修復及保護作用。上述內容的發(fā)揮主要依賴于其磷酸化產物p-CREB,當轉錄因子CREB的Ser133位點被磷酸化后,與靶基因CRE答應元件(cAMP response element,CRE)結合,隨后p-CREB與BDNF啟動子區(qū)域的cAMP反應元件結合,調節(jié)BDNF的轉錄[14-15]。研究發(fā)現,隨著AD患者腦內Aβ神經毒性的釋放,CREB-BDNF信號轉導通路減弱,從而導致其下游信號分子p-CREB和BDNF表達降低。BDNF的低表達難以抵抗應激下神經元的損傷,這可導致記憶功能的缺陷,甚至海馬體積的縮小[16]。此外,有研究顯示,BDNF可抑制H2O2誘導的PC12細胞凋亡[17],腦室注射BDNF可減輕腦缺血再灌注引起的大鼠腦內氧化應激和神經細胞凋亡,過表達CREB可以減輕高濃度H2O2所致的內皮細胞氧化損傷[18],這說明CREB/BDNF信號通路可能與氧化應激存在某種內在聯系。

本實驗為探究淫羊藿的神經保護作用是否與CREB/BDNF信號通路有關,分別檢測了各組小鼠海馬組織中CREB和BDNF信號通路相關蛋白的表達。結果發(fā)現,與空白組比較,模型組小鼠海馬組織中CREB蛋白磷酸化水平和BDNF蛋白表達水平均顯著降低;給予淫羊藿治療后,小鼠海馬組織中上述指標均顯著逆轉,說明淫羊藿改善APP/PS1雙轉基因小鼠的認知功能,減輕小鼠腦組織病理損傷和氧化應激,其抗AD作用的潛在機制可能與激活CREB/BDNF信號通路有關。