夏玉吉，陳華鳳，竇明理，武首薰，何 楠，王 毅*

（1.四川省食品檢驗研究院，四川成都 610097；2.國家市場監(jiān)管重點實驗室（白酒監(jiān)管技術(shù)），四川成都 610097；3.四川大學(xué)，四川成都 610000）

獸藥殘留是目前食品安全監(jiān)管的重要內(nèi)容，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏度高，能夠快速識別動物源性食品中的獸藥殘留，已廣泛應(yīng)用于食品安全監(jiān)管。沙羅拉納[1]是一類作用于γ-氨基丁酸受體的新型驅(qū)蟲藥[2]，與其他驅(qū)蟲藥相比，這類藥物具有吸收迅速、作用時間長（可持續(xù)12 周）[3]、代謝率低的特點（半衰期為10～14 d[4]），容易在肉及肉制品中殘留。肝臟是這類藥物的主要代謝器官，且肝臟基質(zhì)復(fù)雜，常規(guī)凈化效果不佳，因此選擇肝臟作為代表基質(zhì)研究樣品的前處理，建立液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，并對方法的耐用性進行考察。

分析方法的耐用性是指分析方法對實驗室一般不易控制或不能保持完全一致的微小條件變化的敏感性[5]?！痘瘜W(xué)分析方法驗證確認和內(nèi)部質(zhì)量控制術(shù)語和定義》（GB/T 32467—2015）和《合格評定 化學(xué)分析方法確認和驗證指南》（GB/T 27417—2017）都對分析方法建立時開展耐用性試驗有嚴(yán)格的要求，但這些標(biāo)準(zhǔn)中并未給出具體的試驗方案，僅有的幾篇文獻也只報道了耐用性試驗在重金屬檢測[6-8]以及氣相色譜測定環(huán)境污染物等領(lǐng)域的應(yīng)用，未見耐用性試驗在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析領(lǐng)域的報道。本試驗首先建立沙羅拉納的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，再以W.J.尤登教授的耐用性試驗為基礎(chǔ)，利用PASW Statistics 18 軟件設(shè)計正交表，考察10 個微小影響因素對試驗結(jié)果的影響，再運用t檢驗、因素差值與標(biāo)準(zhǔn)差比較等兩種統(tǒng)計方法對耐用性試驗結(jié)果進行評價。研究結(jié)果將為液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜領(lǐng)域開展耐用性試驗的因素選擇、方案設(shè)計提供參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

安捷倫1290/6460 液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜儀，電子天平XS105DU，高速離心機HERAEUS MULTIFUGE X3R，渦旋混合儀 IKA MS 3。

沙羅拉納標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為100 μg·mL-1；甲醇、乙腈、甲酸銨均為色譜純；PRiME HLB 固相萃取柱150 mg/3 mL；陰性豬肝樣品。

1.2 色譜條件

色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse plus C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流 動 相A 為5 mmol·L-1甲酸銨水，流動相B 為甲醇，洗脫程序梯度為0 ～2.0 min，體積分數(shù)為70%的甲醇；5.0 ～7.0 min，體積分數(shù)為90%的甲醇；7.1 ～10.0 min，體積分數(shù)為70%的甲醇，流速為0.3 mL·min-1，柱溫為30 ℃，進樣體積為2 μL。

質(zhì)譜參數(shù)如下。大氣壓電噴霧離子源（API-ESI）；MRM 模式；干燥氣溫度：350 ℃； 干燥氣流量：5 L·min-1；霧化氣壓力：45 psi；鞘氣溫度：300 ℃；鞘氣流量：11 L·min-1；毛細管電壓：3.5 kV；噴嘴電壓：500 V；增益電壓：300 V。MRM 測定參數(shù)為正模式，母離子（m/z）581，定量離子（m/z）444，定性離子（m/z）416，去簇電壓均為150 V，碰撞能量均為15 V。

1.3 試驗方法

準(zhǔn)確稱取均質(zhì)后的樣品2.00 g 至50 mL 具塞離心管內(nèi)，加入10 mL 乙腈，渦旋1 min，超聲15 min，10 000 r·min-1離心5 min，取上層清液過PRiME HLB 固相萃取小柱，收集流出液，40 ℃氮吹至近干，1 mL 甲醇定容，過0.22 μm 有機微孔濾膜，直接注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，在儀器工作條件下進行測定。

1.4 耐用性實驗方案

1.4.1 因素選擇

本次試驗主要考察10 個微小因素（用A～J表示），每個因素設(shè)計了兩個水平，利用PASW Statistics 18 軟件設(shè)計正交表（表1）。

表1 耐用性試驗因素水平設(shè)計

1.4.2 檢測編號組合

將考察的10 個因素，按表2 的編號組合進行安排。

表2 檢測編號組合

1.4.3 具體檢測方案

按照表2 的測試編號組合，共做12 次檢測。每次檢測的條件見表3。

表3 檢測編號及條件組合

1.4.4 檢測分工

實際檢測樣品是在陰性豬肝中添加固定濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)品制得，上機測試液中沙羅拉納濃度約為100 ng·mL-1（10 倍定量限水平）。兩個人員的檢測分工見表4。

表4 測試人員分工安排

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品預(yù)處理條件的選擇

2.1.1 超聲提取時間

提取環(huán)節(jié)，試驗考察了超聲提取10 min、15 min、20 min 3 種情況，考察結(jié)果以陰性樣品在定量限水平的加標(biāo)回收率表示，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，超聲提取15 min，沙羅拉納加標(biāo)回收率最高。

表5 不同超聲提取時間優(yōu)化結(jié)果

2.1.2 固相萃取小柱選擇

針對復(fù)雜基質(zhì)豬肝，前處理凈化環(huán)節(jié)重點考察了固相萃取小柱及提取液，有3 種組合形式見表6，考察結(jié)果以陰性樣品在定量限水平的加標(biāo)回收率表示，結(jié)果見表6。

表6 固相萃取小柱及配套取液優(yōu)化結(jié)果

結(jié)果表明，以乙腈作提取液過PRiME HLB 小柱，提取凈化效果最佳。

2.2 液相色譜條件優(yōu)化

本文主要考察了3 種色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse plus C18、Waters ACQUITY UPLC HSS T3和Waters ACQUITY BEH C18，結(jié)果如圖1 所示。其中，沙羅拉納采集的兩對特征離子對（m/z）為581/416、581/444。流動相體系主要考察了液相色譜-質(zhì)譜分析中的常見流動相體系，即甲醇-5 mmol·L-1乙酸銨、甲醇-5 mmol·L-1甲酸銨、甲醇-0.1%甲酸水，結(jié)果見圖2?？疾旖Y(jié)果表明，3 種色譜柱目標(biāo)物均能實現(xiàn)較好的分離，且峰形較好；3 種流動相體系中甲醇-5 mmol·L-1甲酸銨流動相梯度洗脫峰形最佳，分離效果最好?？紤]到Agilent ZORBAX Eclipse plus C18色譜柱在實驗室中較為常備，液相色譜條件最終選取Agilent ZORBAX Eclipse plus C18色譜柱、甲醇-5 mmol·L-1甲酸銨流動相梯度洗脫。

圖1 不同色譜柱條件下的MRM 質(zhì)譜圖

圖2 不同流動相體系的MRM 質(zhì)譜圖

2.3 檢出限和定量限

標(biāo)準(zhǔn)曲線采用空白基質(zhì)溶液配制，在0 ～200 ng·mL-1線性關(guān)系良好，y=22.09x+28.32，r2=0.999。檢出限是通過在空白樣品中添加低濃度水平目標(biāo)組分的方法確定，依據(jù)其定性離子色譜峰的信噪比（S/N）＞3 而測定的，為2.0 μg·kg-1；定量限是其定性離子色譜峰的信噪比（S/N）＞10 而測定的，為5.0 μg·kg-1。

2.4 耐用性試驗

2.4.1 耐用性試驗的因素選擇

實驗室在檢測中，不能刻意控制的或不能保持完全一致的微小條件很多，包括前處理各環(huán)節(jié)溫度控制、人員、存放時間、試劑耗材等。在進行耐用性試驗時，應(yīng)根據(jù)方法的特點，結(jié)合使用的具體情況，合理安排需要考察的微小因素。超聲溫度因素分別為從室溫開始（水溫約15 ℃），超聲15 min 后水溫升高至約30 ℃；將超聲儀水溫設(shè)為30 ℃，待溫度平衡后開始超聲。濾膜因素：主要考察不同的濾膜是否對目標(biāo)分析物有吸附，選擇的因素分別為兩個來源的濾膜。時間因素：主要考察批量處理了樣品后，放在進樣盤上待進樣時是否會影響定量分析的準(zhǔn)確性，分別及時檢測和間隔3 d 檢測（安捷倫液質(zhì)聯(lián)用儀最多容許432 個樣品，每針進樣10 min，第一個樣品與最后一個樣品間隔72 h，因此定為3 d）。凈化柱批次：批次1 為012839092A，批次2 為013239242B。

2.4.2 耐用性試驗結(jié)果

W.J.尤登教授采用差值排序的方法來判別試驗中需要嚴(yán)格控制的因素，并規(guī)定差值排在前面一位或兩位的因素要引起重視，梳理沙羅拉納中排名前4的因素差值為檢測時間（15.6）、人員（-3.2）、乙腈開瓶時間（-2.69）、進樣瓶顏色（2.63），檢測時間的差值最大，其余差值相差均不大。沙羅拉納各個因素的平均結(jié)果及其差值，結(jié)果見表7 ～表9。

表7 沙羅拉納耐用性試驗結(jié)果統(tǒng)計（水平1） 單位：ng·mL-1

表8 沙羅拉納耐用性試驗結(jié)果統(tǒng)計（水平2） 單位：ng·mL-1

表9 沙羅拉納耐用性試驗不同水平結(jié)果統(tǒng)計分析

2.4.3 耐用性試驗結(jié)果的統(tǒng)計分析

（1）t檢驗。分別對排名前4 的因素差值進行t檢驗[9]。結(jié)果表明，檢測時間P＜0.05 差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其余均無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果顯示，檢測時間對結(jié)果的影響較大，檢測時應(yīng)當(dāng)及時檢測，其他因素對檢測結(jié)果的影響可以忽略，無需嚴(yán)格控制。

（2）各因素差值與標(biāo)準(zhǔn)差比較。E．H．Steiner 介紹了另外一種評價方法，即計算12 次檢測結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差，將各個因素的差值與標(biāo)準(zhǔn)差s進行比較，定量評價各個因素變化對檢測結(jié)果的影響程度。如果差值的絕對值大于（置信概率P=95%），則可認為存在實際的影響，檢測中應(yīng)有控制措施。反之則認為該因素對檢測結(jié)果無影響。計算出12 次檢測結(jié)果的平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，平均數(shù)=83.56，s=10.47，=14.80。結(jié)果顯示，檢測時間（差值=15.60）大于其，即對檢測結(jié)果影響較大，需要嚴(yán)格控制檢測時間這一影響因素。

運用上述兩種統(tǒng)計學(xué)方法對耐用性結(jié)果進行定量評價是對W.J.尤登教授的差值排序方法的一個有效補充，在實際操作時二者任選其一就能將試驗結(jié)果準(zhǔn)確量化，可以在簡單的差值排序后，從眾多因素中準(zhǔn)確找出需要嚴(yán)格控制的影響因素，為檢測方法開展協(xié)同試驗提供技術(shù)支撐。同時，也為液相色譜領(lǐng)域開展耐用性試驗在因素選擇、方案設(shè)計和結(jié)果評價等方面提供一些參考。

3 結(jié)論

豬肝基質(zhì)復(fù)雜，色譜干擾較大，前處理條件考察了超聲提取時間、提取溶劑及固相萃取小柱，最終選擇用乙腈超聲提取15 min，PRiME HLB 固相萃取柱進行凈化，凈化效果好，色譜干擾較??；液相色譜條件優(yōu)化主要考察了色譜柱、流動相體系，最終選擇Agilent ZORBAX Eclipse plus C18色譜柱、甲醇-5 mmol·L-1甲酸銨流動相梯度洗脫，實現(xiàn)色譜分離完全。該方法操作過程簡單，檢測速度快，選擇性強，靈敏度高，可作為豬肝中沙羅拉納殘留量的檢測方法。