殷金玲，馬 亮

（1.吉林磐石經(jīng)濟開發(fā)區(qū)投資促進局，吉林磐石 132300；2.吉林省維伊康生物科技有限公司，吉林磐石 132300）

金耳為擔子菌門、銀耳科、銀耳屬的一種金黃色可食用真菌，別稱黃木耳、金黃耳、腦耳等[1]。金耳主要分布于我國云貴高原、四川、西藏等地，含有蛋白質(zhì)、多糖、多酚、黃酮類和膠質(zhì)等多種營養(yǎng)成分，具有抗氧化、抗血栓、降血糖、降血脂以及提高身體免疫力等功效[2]。

近年來，微波萃取技術(shù)在食品加工領(lǐng)域中得到了廣泛應用[3]。與其他新型萃取方式如超聲波萃取、超高壓萃取、超臨界萃取和電磁裂解萃取等相比，微波萃取技術(shù)在物料控制、溶劑選擇、時間效率和生產(chǎn)操作上具有低成本優(yōu)勢。響應面分析法是目前使用廣泛的實驗分析方法，通過將各種實驗影響因素和響應值整合成二次回歸方程，確定各因素影響程度大小，進而為實際工業(yè)生產(chǎn)提供理論指導依據(jù)[4]。

目前，關(guān)于金耳的主要研究方向多為藥理活性、多糖結(jié)構(gòu)等。例如，劉光珍等[5]研究了金耳糖肽膠囊的技術(shù)藥理學，張雯等[6]分析了金耳菌絲體多糖的降血糖功效，汪虹[7]概述了金耳藥理活性研究及其多糖結(jié)構(gòu)進展研究。黃酮類化合物具有延緩衰老、防癌抗癌、提高心血管功能的作用，但其無法在人體內(nèi)直接合成，需要從植物中萃取[8]。本實驗采用微波萃取技術(shù)對金耳中總黃酮類物質(zhì)進行萃取，以單因素實驗為基礎(chǔ)，結(jié)合響應面實驗探究金耳中總黃酮類物質(zhì)的最佳提取工藝，深度挖掘金耳潛在營養(yǎng)價值，為金耳作為功能性食品原料的整體開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

金耳鮮品采購于四川廣元；蘆丁對照品，江西佰草源生物科技有限公司；硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；微波爐；粉碎機；電子分析天平；烘箱；UV-9600 型紫外/可見分光光度計。

1.2 實驗方法

1.2.1 金耳預處理

將金耳鮮品清洗干凈，除去表面泥沙雜質(zhì)后，切成1 ～2 cm 均勻的塊狀，放入65 ℃的烘箱內(nèi)烘干，干燥至恒重，然后用粉碎機粉碎處理，過100 目篩，備用。

1.2.2 蘆丁標準曲線繪制

精密稱取4.0 mg 蘆丁標準品，置于10 mL 容量瓶中，加入70%乙醇定容至刻度線，配制成濃度為0.4 mg·mL-1的標準品溶液，搖勻備用。用移液槍分別吸取蘆丁標準品溶液0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL 和0.7 mL，然后補加70%乙醇，使溶液總體積為1.2 mL，搖勻。然后加入5.0%亞硝酸鈉溶液0.2 mL，再加入10.0%硝酸鋁溶液0.2 mL，兩次混合均需靜置6 min。最后再加入4%氫氧化鈉溶液2 mL，充分混合后靜置15 min，于510 nm 處測定吸光值。蘆丁標準系列溶液濃度分別為0 mg·mL-1、0.01 mg·mL-1、0.02 mg·mL-1、0.03 mg·mL-1、0.04 mg·mL-1、0.06 mg·mL-1、0.07 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1。以蘆丁濃度為橫坐標（x），以吸光值為縱坐標（y），繪制標準曲線，得到的標準曲線線性回歸方程為y=0.518x-0.005 4（R2=0.999 5）。

1.2.3 金耳總黃酮的萃取

稱取金耳細粉1.0 g，置于250 mL 燒瓶中，加乙醇溶液定容至指定刻度，在適宜的微波功率下加熱一段時間，過濾，即可得到金耳萃取液[9]。準確稱取5.00 mL 萃取液于50 mL 容量瓶中，稀釋10 倍，作為待測樣品，備用。

1.2.4 單因素實驗

（1）料液比（金耳細粉質(zhì)量與乙醇溶液體積的比例）的確定。固定微波時間為4 min、微波功率為300 W、乙醇濃度為50%，研究料液比（1∶10、1∶20、1 ∶30、1 ∶40 和1 ∶50，mg ∶mL）對金耳總黃酮萃取率的影響。

（2）微波時間的確定。固定料液比為1 ∶20、微波功率為300 W、乙醇濃度為50%，考察微波時間（1 min、2 min、3 min、4 min 和5 min）對金耳總黃酮萃取率的影響。

（3）微波功率的確定。固定料液比為1 ∶20、微波時間為4 min、乙醇濃度為50%，考察微波功率（100 W、200 W、300 W、400 W 和500 W）對金耳總黃酮萃取率的影響。

（4）乙醇濃度的確定。固定料液比為1 ∶20、微波時間為4 min、微波功率為300 W，考察乙醇濃度（50%、60%、70%、80%和90%）對金耳總黃酮萃取率的影響。

1.2.5 響應面實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以料液比、微波時間、微波功率和乙醇濃度為因素，以金耳總黃酮萃取率為考察指標，采用Design-Expert 13.1.0 軟件對金耳總黃酮的萃取工藝進行CCD 響應面設(shè)計[10-11]。實驗方案見表1。

表1 響應面實驗因素水平表

1.2.6 金耳總黃酮含量測定

將測得的吸光值代入蘆丁回歸方程中，測得萃取液中總黃酮濃度（C），按公式（1）計算樣品中金耳總黃酮萃取率[12]。

式中：c為萃取液中金耳總黃酮的濃度，mg·mL-1；v為萃取液體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；m為金耳細粉樣品質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 料液比對金耳總黃酮萃取率的影響

由圖1 可知，隨著提取液體積的增加，金耳總黃酮的萃取率呈先增大后降低的趨勢。當料液比為1 ∶20 時，金耳總黃酮萃取率達到最大值，進一步增加提取液體積，金耳總黃酮萃取率呈現(xiàn)下降趨勢。因此，最佳料液比為1 ∶20。

圖1 料液比對金耳總黃酮萃取率的影響

2.1.2 微波時間對金耳總黃酮萃取率的影響

由圖2 可知，當微波時間為4 min 時，金耳總黃酮萃取率最高，超過4 min 總黃酮萃取率開始下降。初步分析，微波通過高頻振動，從內(nèi)向外發(fā)散高能熱量，升溫速度極快。增加微波時間，溶液溫度迅速升高，細胞內(nèi)分子運動頻率加快，細胞壁結(jié)構(gòu)被延展、撕裂，加速了黃酮的釋放。但黃酮在微波時間過長、溫度過高的條件下，其組織結(jié)構(gòu)會遭到破壞，導致萃取率降低。所以確定最佳微波時間為4 min。

圖2 微波時間對金耳總黃酮萃取率的影響

2.1.3 微波功率對金耳總黃酮萃取率的影響

由圖3 可知，隨著微波功率的增大，金耳總黃酮萃取率呈先增大后減小的趨勢。當微波功率為400 W 時總黃酮萃取率達到最大值，繼續(xù)增大微波功率，總黃酮萃取率開始下降，可能是因為微波功率過高時會快速裂解黃酮分子結(jié)構(gòu)，造成含量下降。故確定最適宜的微波功率為400 W。

圖3 微波功率對金耳總黃酮萃取率的影響

2.1.4 乙醇濃度對金耳總黃酮萃取率的影響

由圖4 可知，金耳總黃酮萃取率在乙醇濃度為60%時達到最大值，進一步增加乙醇濃度，總黃酮提取率呈下降趨勢。黃酮易溶于乙醇，乙醇濃度過高會加速金耳中其他極性物質(zhì)的分解，進而影響金耳總黃酮的釋放。故確定最佳乙醇濃度為60%。

圖4 乙醇濃度對金耳總黃酮萃取率的影響

2.2 響應面優(yōu)化實驗結(jié)果

2.2.1 回歸方程的建立與分析

響應面實驗結(jié)果及方差分析結(jié)果見表2、表3。利用Design-Expert 13.1.0 對實驗結(jié)果進行擬合，得到的回歸方程為Y=0.672 2+0.004 6A-0.013 6B-0.016 2C+0.016 3D-0.008 5AB+0.014AC-0.018 7AD-0.01BC+0.004 3BD+0.014 5CD-0.034 5A2-0.041 2B2-0.026 6C2-0.032 1D2。

表2 響應面實驗條件與結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果表

由表3 可知，模型中F=16.14，P＜0.000 1，表明確立的回歸模型有統(tǒng)計學意義；R2=0.941 6，表明該模型的擬合度較好，實驗誤差較小。一次項B、C、D、交互項AD以及二次項A2、B2、C2、D2對金耳總黃酮萃取率的影響極顯著（P＜0.01）；二次項AC、CD對金耳總黃酮萃取率有顯著影響（P＜0.05）；一次項A與交互項AB、BC、BD對金耳總黃酮萃取率的影響不顯著（P＞0.05）。金耳總黃酮萃取率受4個單因素的影響程度依次為乙醇濃度＞微波功率＞微波時間＞料液比。

2.2.2 最優(yōu)工藝參數(shù)的確定和驗證

經(jīng)過Design-Expert 13.1.0 軟件對實驗結(jié)果進行擬合，得到金耳總黃酮微波萃取的最佳工藝參數(shù)為料液比1 ∶19.8、微波時間3.75 min、微波功率376 W，乙醇濃度62%。在此條件下得到的金耳總黃酮萃取率為0.676 5%。

考慮到實際工業(yè)化生產(chǎn)條件及成本，確定最佳工藝參數(shù)為料液比1 ∶20、微波時間4 min、微波功率400 W、乙醇濃度60%，該條件下金耳總黃酮萃取率為0.671 2%。該數(shù)值與模型最佳工藝參數(shù)所得結(jié)果基本吻合，表明優(yōu)化后的工藝參數(shù)具有較好的指導性和實際操作性。

3 結(jié)論

將新鮮金耳干燥粉碎處理后，采用微波輔助方法萃取金耳總黃酮，并結(jié)合單因素實驗和響應面實驗優(yōu)化提取工藝，最終得到金耳總黃酮微波萃取的最佳工藝參數(shù)為料液比1 ∶20（mg ∶mL）、微波時間4 min、微波功率400 W、乙醇濃度60%，該條件下金耳總黃酮萃取率為0.671 2%。該實驗能為萃取金耳總黃酮的后續(xù)研究及生產(chǎn)操作提供參考。