王雪 邱婷 呂頤菲 高淑娟 郭雪艷

結直腸癌(CRC)是多發(fā)于老年人群的惡性腫瘤,具有病情進展快、侵襲轉移迅速等特點,發(fā)病率及死亡率居于惡性腫瘤第5位[1]。肝臟作為CRC血行轉移的主要靶器官,部分CRC病人會出現肝轉移,增加死亡風險[2]。因此,早期診斷及治療CRC肝轉移對改善病人預后、延長生存期尤為重要。IL-18作為多功能細胞因子,能促進腫瘤細胞生長,在食管癌、胃癌等多種惡性腫瘤中過表達[3]。促肝再生磷酸酶-3(PRL-3)能促進惡性腫瘤細胞增殖及遷移,與惡性腫瘤侵襲有關[4]。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)是經典的促存活及抗凋亡的信號轉導通路,該通路中上游信號分子PI3K在多種細胞因子及生長因子刺激作用下會被異?；罨?從而對下游底物AKT進行激活,導致AKT磷酸化[5-6]。近年來的研究顯示,PI3K/AKT信號通路不僅能調控細胞周期,參與腫瘤細胞增殖和凋亡的調節(jié),還與腫瘤轉移密切相關[7]。目前臨床關于老年CRC肝轉移病人IL-18、PRL-3與PI3K/AKT信號通路關系的研究較少。本研究通過免疫組化法檢測IL-18、PRL-3、PI3K/AKT信號通路相關蛋白在老年CRC肝轉移病人癌組織中的表達情況,分析其相關性,為CRC診療提供參考,現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2019年6月至2021年6月收治的100例老年CRC病人,年齡60～79歲,平均(69.23±4.98)歲;男58例(58.00%),女42例(42.00%)。納入標準:(1)滿足《中國結直腸癌診療規(guī)范》[8]中CRC診斷標準,經組織病理學確診;(2)年齡≥60歲;(3)病人簽署知情同意書;(4)首次確診,3個月內未接受免疫治療、放化療;(5)臨床及病理資料完整。排除標準:(1)合并除肝臟外的遠處轉移病灶;(2)既往腹部手術史者;(3)合并胰腺炎、感染性疾病、炎癥性腸炎、自身免疫性疾病者;(4)其他惡性腫瘤者;(5)預計生存時間<6個月;(6)腎、腦、心等重要臟器嚴重損傷者。根據是否發(fā)生肝轉移分為肝轉移組(n=34)及非肝轉移組(n=66),肝轉移診斷以《中國結直腸癌肝轉移診斷和綜合治療指南》為標準[9]。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集:查詢電子病歷系統(tǒng)收集所有病人臨床資料,包括性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、分化程度、癌灶浸潤深度及淋巴結轉移情況等。

1.2.2 蛋白免疫印跡法檢測IL-18、PRL-3、PI3K、AKT蛋白表達:收集CRC病人癌組織和癌旁正常組織(距離腫瘤邊緣>5 cm)標本,分別取癌組織及癌旁正常組織各200 mg置于1.5 mL的離心管內,并加入裂解液1000μL對組織進行裂解,低溫離心機離心(溫度4℃,離心力12 000 r/min)20 min后收集蛋白上清液,用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度,于-80℃環(huán)境保存。每個樣品取總蛋白50μg,加入10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉移至聚偏二氟乙烯膜,加入5%脫脂牛奶于37 ℃封閉2 h,再分別加入兔抗人IL-18單克隆抗體(1∶500稀釋)、兔抗PRL-3單克隆抗體(1∶500稀釋)、兔抗人PI3K單克隆抗體(1∶500稀釋)及兔抗人AKT單克隆抗體(1∶500稀釋),于4 ℃環(huán)境過夜。電化學發(fā)光法顯色,內參照選擇3-磷酸甘油醛脫氫酶(G3PDH)(1∶5000稀釋)。采用Quantity One軟件計算灰度值,用每一個樣本的條帶灰度值與相應樣本G3PDH的條帶灰度值相比,求出其相對值。

2 結果

2.1 癌組織及癌旁組織中IL-18、PRL-3、PI3K及AKT蛋白表達比較 癌組織中IL-18、PRL-3、PI3K及AKT蛋白表達水平均高于癌旁組織,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 癌組織及癌旁組織中IL-18、PRL-3、PI3K及AKT蛋白表達比較

2.2 影響老年CRC肝轉移的單因素分析 肝轉移組癌組織中IL-18、PRL-3、PI3K及AKT蛋白表達水平均高于非肝轉移組(P<0.05)。肝轉移組癌灶浸潤深度T3～T4、低中分化、淋巴結轉移比例均高于非肝轉移組(P<0.05)。見表2。

表2 影響老年CRC肝轉移的單因素分析(n,%)

2.3 影響老年CRC肝轉移的多因素分析 以老年CRC病人是否發(fā)生肝轉移為因變量,將IL-18、PRL-3、PI3K、AKT、癌灶浸潤深度、分化程度、淋巴結轉移等單因素分析中存在統(tǒng)計學意義的因素作為自變量,進行Logistic回歸分析,結果顯示,IL-18、PRL-3、PI3K、AKT、癌灶浸潤深度、分化程度、淋巴結轉移均為老年CRC肝轉移的獨立危險因素。見表3。

表3 影響老年CRC肝轉移的多因素Logistic回歸分析

2.4 老年CRC肝轉移病人IL-18、PRL-3與PI3K/AKT信號通路的關系 Pearson相關分析顯示,老年CRC肝轉移病人癌組織中IL-18、PRL-3蛋白表達與PI3K(r=0.653、0.670,均P<0.001)、AKT(r=0.521、0.546,均P<0.001)蛋白表達均呈正相關(P<0.05)。

3 討論

CRC細胞可由門靜脈系統(tǒng)回流至肝臟后經全身擴散,肝轉移是引起CRC病人死亡的重要因素[10]。由于早期無典型癥狀,CRC肝轉移診斷相對困難,易錯失最佳救治時機[11]。因此,探尋腫瘤標志物診斷CRC肝轉移已成為臨床研究的熱點。

IL-18主要由巨噬細胞、免疫細胞、自然殺傷細胞及樹突狀細胞等產生,屬于免疫調控細胞因子,其結構類似于IL-1β。臨床研究發(fā)現,IL-18對惡性腫瘤免疫具有兩面性,一方面能通過提高免疫功能發(fā)揮抗腫瘤作用;另一方面能促進腫瘤免疫逃逸及轉移,加快惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展[12]。IL-18不僅能與IL-15通過協同作用影響機體免疫細胞活性,還能協同IL-12以活化自然殺傷細胞及CD4+/CD8+T細胞,從而促進INF-γ等殺傷性細胞因子的釋放[13]。有報道顯示,胃癌病人IL-18過度表達,IL-18通過上調CD44、促進血管內皮生長因子釋放等途徑增加惡性腫瘤細胞免疫逃逸及轉移能力[14]。PRL-3與腫瘤侵襲轉移存在聯系,在不同腫瘤組織中過表達。臨床研究發(fā)現,胃癌組織中PRL-3陽性表達率遠高于正常胃黏膜組織[15]。國外報道發(fā)現,PRL-3可以誘導結腸癌細胞轉移,增加不良預后風險[16]。本研究結果顯示,癌組織中IL-18、PRL-3蛋白表達均高于癌旁組織,提示IL-18、PRL-3可能參與了CRC的發(fā)生發(fā)展。分析原因為:IL-18能促進NK細胞膜上PD-1表達上調,引起T細胞程序性死亡,導致腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸,從而出現擴散及轉移;PRL-3對血管內皮生長因子及受體產生刺激作用,導致其異常表達,從而刺激腫瘤血管形成,促進惡性腫瘤生長及侵襲。

既往研究發(fā)現,PI3K/AKT信號通路與腫瘤細胞增殖、侵襲密切相關,在乳腺癌、胃癌及CRC等惡性腫瘤中異常激活[17-18]。PI3K作為胞內關鍵的磷脂激酶,能影響多種生長因子的活化過程;AKT具有絲蘇氨酸激酶活性,主要通過轉錄因子磷酸化調節(jié)生命活動進程[18]。本研究發(fā)現,癌組織中PI3K、AKT蛋白表達水平均高于癌旁組織,表明PI3K、AKT在CRC病人癌組織中呈高表達,PI3K/AKT信號通路與CRC發(fā)生有關。究其原因:二磷酸磷脂酰肌醇在PI3K作用下轉化為三磷酸磷脂酰肌醇,與AKT氨基末端的PH結構域相互作用,導致底物蛋白磷酸化,縮短G1周期,加速腫瘤細胞周期,引起腫瘤細胞大量繁殖,促進腫瘤發(fā)生發(fā)展。本研究還發(fā)現,肝轉移組癌組織中IL-18、PRL-3、PI3K、AKT蛋白表達水平均高于非肝轉移組,說明IL-18、PRL-3、PI3K、AKT與老年CRC肝轉移的發(fā)生有關。對影響老年CRC肝轉移的危險因素進行分析發(fā)見,IL-18、PRL-3、PI3K及AKT是老年CRC肝轉移的獨立危險因素,進一步提示IL-18、PRL-3、PI3K及AKT表達與老年CRC肝轉移的關系密切。臨床可以通過檢測IL-18、PRL-3、PI3K及AKT表達情況,評估老年CRC肝轉移情況。進一步相關性分析顯示,老年CRC肝轉移病人癌組織中IL-18、PRL-3蛋白表達與PI3K、AKT蛋白表達呈正相關,提示IL-18、PRL-3可能通過激活PI3K/AKT信號通路促進CRC肝轉移。臨床研究發(fā)現,IL-18可能通過調控PI3K/AKT與NF-κB信號通路激活腫瘤免疫,從而發(fā)揮抑制結腸癌的作用[19]。另有研究顯示,PRL-3通過其磷酸酶活性下調第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN),激活PI3K/Akt信號通路,上調基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9,促進腹膜轉移[20]。

綜上所述,老年CRC肝轉移病人IL-18、PRL-3呈高表達狀態(tài),兩者與PI3K/AKT信號通路蛋白存在聯系,共同作用導致CRC發(fā)生肝轉移。