張光晨,王 洋,2,孫學亮,2,羅云龍,王競?cè)?劉凡湘,季延濱,2

( 1.天津農(nóng)學院 水產(chǎn)學院,天津 300392; 2.天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室,天津 300392 )

《2020中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》[1]顯示,2019年我國淡水養(yǎng)殖總產(chǎn)量超3.0×107t,如此高的產(chǎn)量,高密度養(yǎng)殖模式功不可沒[2]。但高密度養(yǎng)殖面臨著水質(zhì)劣化挑戰(zhàn)[3],如富營養(yǎng)化引發(fā)水華,底棲生物多樣性降低,魚類細菌和寄生蟲病頻發(fā),危害養(yǎng)殖動物的健康。同時養(yǎng)殖排放的氨氮、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮、磷等,導致水質(zhì)惡化[4]。為保證養(yǎng)殖魚類的健康以及綠色養(yǎng)殖的可持續(xù)性,必須進行養(yǎng)殖尾水的凈化。傳統(tǒng)凈化水質(zhì)的方法有固化、蒸發(fā)、反滲透、化學處理等[5],但這些方法價格昂貴、易造成二次污染。生物修復法是一種利用生物的自然生物學機制凈化水質(zhì)的方法,具有經(jīng)濟、環(huán)保、持續(xù)有效的特點。植物可吸收水體中的氮、磷[6];微生物可降解有機物[7],也可作為水產(chǎn)動物餌料,影響?zhàn)B殖動物腸道菌群[8]、生理、消化免疫系統(tǒng)[9]等。近年來,研究人員通過高通量測序技術揭示了多種水產(chǎn)動物養(yǎng)殖環(huán)境的微生物結(jié)構及變化規(guī)律[10-15],以探求不同環(huán)境微生物參與養(yǎng)殖水質(zhì)調(diào)控的作用機制,發(fā)現(xiàn)不同生境的微生物構成的差異[2,16-18]。同時發(fā)現(xiàn),微生物的豐度也會受環(huán)境因子的影響[5]。

大口黑鱸(Micropterussalmoides)是我國普遍養(yǎng)殖的魚類之一,其高密度養(yǎng)殖模式存在水質(zhì)劣化問題。生態(tài)養(yǎng)殖模式可有效改善大口黑鱸養(yǎng)殖水質(zhì),如:黃鶴忠等[19]采用網(wǎng)隔技術構建的大口黑鱸-河蚌-菱、藕、蝦生態(tài)養(yǎng)殖系統(tǒng),顯著降低了水體中氨氮和亞硝態(tài)氮含量,并提高了水體透明度及溶解氧含量,并提高了魚體抗病能力,促進其生長的效果;王海華等[20]構建的大口黑鱸-野雜魚-食碎屑動物-無脊椎動物-水生植物生態(tài)系統(tǒng),年固定碳、氮、磷量分別為7.08、1.18、0.57 t,減輕了湖水富營養(yǎng)化程度;劉梅等[21]設計的大口黑鱸-鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙(Aristichthysnobilis)-水生植物-浮游動植物養(yǎng)殖模式的相對和絕對磷利用率均顯著高于傳統(tǒng)養(yǎng)殖池塘。微生物作為生態(tài)養(yǎng)殖中重要的凈水單元,對氮、磷循環(huán)有重要影響[7]。然而目前關于微生物的水質(zhì)調(diào)控作用的研究多聚焦于單個或少數(shù)益生菌的分析,宏觀微生物組與理化指標的相關性尚未完全闡明。探明大口黑鱸生態(tài)養(yǎng)殖模式中微生物宏觀群落結(jié)構及其與水體理化因子的相關性,有利于進一步提高大口黑鱸生態(tài)養(yǎng)殖模式的凈水效率。

筆者監(jiān)測天津某大口黑鱸生態(tài)塘7—9月養(yǎng)殖區(qū)與毛刷微生態(tài)區(qū)微生物多樣性以及水理化指標的變化情況,并分析同一區(qū)域水理化指標與微生物間的關聯(lián)性,以期為大口黑鱸生態(tài)塘7—9月水質(zhì)理化因子和微生物結(jié)構的調(diào)控、生物修復法中有益菌的篩選,及后續(xù)深入解析生態(tài)養(yǎng)殖模式中的水質(zhì)指標與水體微生物的變化機制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 養(yǎng)殖池塘

天津武清區(qū)海樂水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司的大口黑鱸生態(tài)養(yǎng)殖池塘,養(yǎng)殖區(qū)域300 m2,配套生態(tài)水處理過濾區(qū)域100 m2(圖1)。養(yǎng)殖尾水通過水生蔬菜處理后,表層水進入以毛刷為基質(zhì)的微生態(tài)過濾區(qū)域,之后底層水進入下一個水生蔬菜處理區(qū),處理后進入養(yǎng)殖池塘循環(huán)利用。在300 m2的養(yǎng)殖區(qū)域內(nèi),大口黑鱸初始放養(yǎng)4000尾。

圖1 大口黑鱸生態(tài)養(yǎng)殖池塘示意Fig.1 System diagram of an ecological culture pond for largemouth bass M. salmoides

1.2 樣本采集

在大口黑鱸快速生長期,即2019年7月17日、8月6日、9月6日的10:00—12:00,分別收集大口黑鱸生態(tài)養(yǎng)殖池塘表層水(0～10 cm),養(yǎng)殖池塘的底泥和微生態(tài)區(qū)用于附著微生物的毛刷。每個采樣點采集3個樣本,均勻混合后作為1個樣本,按照樣本系列和采集時間命名。底泥樣本:HLID717、HLID806、HLID906;毛刷樣本:HLIM717、HLIM806、HLIM906;水樣:HLIS717、HLIS806、HLIS906。其中水樣首先采用雙層紗布濾除雜質(zhì),隨后分別采用0.45 μm和0.22 μm濾膜抽濾,以無菌生理鹽水洗滌濾膜,離心收集水中的細菌。毛刷為隨機剪取的刷毛片段。以上樣本處理完畢后立即于-80 ℃凍存,并盡快送至測序公司,用于微生物多樣性分析。同時在養(yǎng)殖池塘的3個位置取表層水樣(40～50 cm),抽濾去除雜質(zhì)后混合冷藏,用于理化指標測定。

1.3 養(yǎng)殖池塘水質(zhì)理化指標

采用過硫酸鉀氧化-紫外分光光度法測總氮[22]、酸性高錳酸鉀法測高錳酸鹽指數(shù)[23]、納氏試劑法測氨氮[24]、N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法測亞硝態(tài)氮[25]、酚二磺酸分光光度法測硝態(tài)氮[26]、過硫酸鉀-鉬酸銨分光光度法測總磷[27]、鉬酸銨分光光度法測磷酸鹽[27]、pH計法測pH[28]、103～105 ℃烘干法測固體懸浮物[29]、酸堿指示劑滴定法測總堿度[30]、EDTA滴定法測硬度[31]、精密鹽度計測鹽度。每個樣品測定3個平行數(shù)據(jù),結(jié)果以平均值±標準差表示。

1.4 微生物多樣性測定

采用E.Z.N.A.?soil DNA試劑盒(美國奧美嘉生物技術公司)提取樣本總 DNA,使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質(zhì)量,使用NanoDrop 2000測定DNA濃度和純度;采用338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) 對 16S rRNA基因V3～V4可變區(qū)進行 PCR 擴增。利用因美納的Miseq PE300平臺進行測序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。使用fastp軟件對原始測序序列進行質(zhì)控,使用FLASH軟件進行拼接。拼接序列采用UPARSE 軟件(version 7.1 http://drive5.com/uparse/),根據(jù)97%的相似度對序列進行運算分類單元聚類并剔除嵌合體。利用RDP classifier (http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/)對每條序列進行物種分類注釋,比對SILVA數(shù)據(jù)庫(Release132 http://www.arb-silva.de),設置比對閾值為70%。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 24軟件對理化指標數(shù)據(jù)進行方差分析。并通過ORIGIN 2018軟件對理化指標數(shù)據(jù)進行處理,繪制散點圖。微生物多樣性采用美吉生物云平臺分析處理和繪圖。熱圖由Adobe Acrobat軟件整理繪制。

2 結(jié) 果

2.1 高通量測序基礎數(shù)據(jù)和物種維恩圖

大口黑鱸養(yǎng)殖池塘的水、底泥和毛刷樣本經(jīng)過高通量測序,共測得有效序列470 035條,有效堿基數(shù)195 452 334個,與數(shù)據(jù)庫比對注釋到54門134綱365目649科1338屬2776種。

各樣本的運算分類單元集合情況見圖2。全部樣本共有運算分類單元 67個,各月底泥樣本微生物運算分類單元數(shù)均最多,而水樣運算分類單元數(shù)最少。同一樣本各月運算分類單元數(shù)不同,底泥在8月,毛刷和水樣在7月時運算分類單元總數(shù)和獨有數(shù)較高。

圖2 大口黑鱸養(yǎng)殖池塘各樣本微生物運算分類單元維恩圖Fig.2 Venn diagram of OTUs in samples from Largemouth bass M. salmoides culture pond

2.2 大口黑鱸池塘微生物α多樣性

大口黑鱸生態(tài)池塘各樣本的微生物α多樣性見圖3。香農(nóng)指數(shù)越大,辛普森指數(shù)越小,群落多樣性越高;Ace指數(shù)和Chao指數(shù)越高,群落組成越豐富。與毛刷和水樣相比,各月底泥的微生物多樣性和豐富度均更高,其中8月底泥的α多樣性最高;毛刷的微生物α多樣性在7—9月各不相同,其多樣性(香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù))在7月和9月低于水樣,豐富度(Ace指數(shù)和Chao指數(shù))在7和8月高于水樣;各月水樣的微生物豐富度和多樣性均不高,且變化幅度較小。

圖3 大口黑鱸池塘微生物α多樣性Fig.3 Alpha diversity of metrics in different samples

2.3 大口黑鱸養(yǎng)殖池塘微生物群落組成變化

大口黑鱸池塘各樣本的微生物群落組成見圖4。不同種類和取樣時間樣本的微生物組成有所不同。變形菌門是各樣本共有的優(yōu)勢物種(相對豐度>8%)(圖4a)。底泥各月的優(yōu)勢微生物變化較小,門水平上主要為變形菌門、放線菌門、厚壁菌門和綠彎菌門。水樣中存在大量的藍細菌門微生物,且其所占比例呈上升趨勢,7月為10.13%,8月為32.40%,9月上升為最優(yōu)勢菌門(35.62%)。7—9月毛刷的微生物組成差別較大,7月以綠彎菌門為最優(yōu)勢門,8月變形菌門在微生物群落中所占比例最高,9月厚壁菌門則成為絕對優(yōu)勢微生物(73.60%)。從毛刷樣本屬水平的微生物群落組成可知,9月優(yōu)勢物種動性球菌屬(Planococcus,39.87%)和微小桿菌屬(Exiguobacterium,25.27%)(圖4b)均屬于厚壁菌門。

圖4 各樣本的微生物組成Fig.4 Microbial composition in the samples

2.4 大口黑鱸池塘微生物的主成分分析

各樣本主成分的異同見圖5。主成分1特征值的貢獻率為47.01%,主成分2特征值的貢獻率為27.53%,兩者之和為74.54%,說明這2個主成分可代表大口黑鱸池塘微生物多樣性。各月份底泥樣本微生物主成分相似度很高,表明底泥微生物組成較為恒定;各月份水樣的主成分1相近,主成分2有一定差別;而各月份毛刷樣本的主成分1和主成分2均相差很大,表明毛刷微生物在7—9月變化較大。

圖5 各樣本的主成分分析Fig.5 Principal component analysis of the samples

2.5 大口黑鱸養(yǎng)殖池塘水理化指標的變化

大口黑鱸養(yǎng)殖池塘微生態(tài)區(qū)水理化指標見表1。7—9月,水體氨氮質(zhì)量濃度先升后降,最高值為8月的(0.99±0.02) mg/L;亞硝態(tài)氮、總磷質(zhì)量濃度則先降后升,最高值分別為9月的(0.24±0.01) mg/L和7月的(4.15±1.32) mg/L;硝態(tài)氮含量逐漸升高,最高值為(4.12±0.01) mg/L。與8月相比,9月水樣的總氮、正磷酸鹽、固體懸浮物質(zhì)量濃度、高錳酸鹽指數(shù)、pH和總堿度顯著升高(P<0.05),而硬度和鹽度顯著下降(P<0.05)。

表1 大口黑鱸生態(tài)養(yǎng)殖池塘微生態(tài)區(qū)7—9月水體理化指標Tab.1 Physical-chemical properties of aquatic water in microecological zone of ecological pond for largemouth bass M. salmoides from July to September

大口黑鱸生態(tài)養(yǎng)殖池塘養(yǎng)殖區(qū)的水理化指標見表2。7—9月,亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮質(zhì)量濃度逐漸上升,最高值分別為(0.33±0.01) mg/L和(4.03±0.01) mg/L;總磷質(zhì)量濃度先降后升,最高值為7月的(5.12±0.24) mg/L;氨氮質(zhì)量濃度先升后降,最大值為8月的(1.56±0.03) mg/L。與8月相比,9月的總氮、正磷酸鹽、固體懸浮物質(zhì)量濃度、高錳酸鹽指數(shù)、pH、總堿度以及硬度均顯著上升(P<0.05)。

表2 大口黑鱸生態(tài)養(yǎng)殖池塘養(yǎng)殖區(qū)7—9月水理化指標Tab.2 Physical-chemical properties of aquatic water in farming area of ecological pond for largemouth bass M. salmoides from July to September

2.6 大口黑鱸養(yǎng)殖池塘微生物和水體理化指標的相關性

2.6.1 大口黑鱸養(yǎng)殖區(qū)微生物和水體理化指標相關性

大口黑鱸養(yǎng)殖區(qū)水體理化指標與養(yǎng)殖區(qū)池塘水和底泥中主要微生物豐度的相關性見圖6。水溫與伯克氏菌科呈顯著正相關(P<0.05), 總磷與水體中魚孢菌科存在極顯著正相關(P<0.001), 與熒光桿菌科、微桿菌科、根瘤菌科、圓桿菌科顯著正相關(P<0.05)(圖6a);總磷與底泥中 Family_XII_o__Clostridiales極顯著正相關(P<0.01),亞硝態(tài)氮與底泥紅桿菌科豐度呈顯著負相關(P<0.05)(圖6b)。

圖6 養(yǎng)殖區(qū)水體(a)、底泥(b)以及微生態(tài)區(qū)毛刷(c)微生物與相應水體理化因子的皮爾遜相關性Fig.6 Correlation between microorganisms in aquaculture water (a), sediment (b) and brush in microecology zone (c) with their corresponding aquatic water physical-chemical factors“*”代表顯著相關(P<0.05),“**”和“***”代表極顯著相關(P<0.01和P<0.001).“*” in the figure represent significant correlation (P<0.05), “**” and “***” represent significant correlation (P<0.01 and P<0.001).

2.6.2 毛刷微生物和微生態(tài)區(qū)水體理化指標相關性

毛刷的微生物與微生態(tài)區(qū)水體理化指標相關性見圖6c。水溫與Norank_o__Chloroplast顯著負相關,與Blastocatellaceae顯著正相關(P<0.05);Norank_o__norank_c__Nitrospira與亞硝態(tài)氮、根瘤菌科和硝態(tài)氮均顯著負相關(P<0.05);而氨氮與Norank_o__norank_c__Subgroup_6極顯著正相關(P<0.01),與Rubritaleaceae顯著正相關(P<0.05)。

3 討 論

3.1 7—9月大口黑鱸生態(tài)養(yǎng)殖池塘微生物多樣性的變化

3.2 7—9月大口黑鱸池塘微生物組成的異同

本試驗結(jié)果表明,大口黑鱸養(yǎng)殖池塘各部位微生物組成有一定的相似性,底泥、池塘水和毛刷中共有優(yōu)勢微生物為變形菌門,水環(huán)境中的各月份共有優(yōu)勢微生物為變形菌門、藍細菌門、擬桿菌門。其中變形菌門占優(yōu)勢與其他大口黑鱸池塘微生物的報道一致,但是其他次優(yōu)勢門卻不相同。Zheng等[16]研究的大口黑鱸池塘水門水平的優(yōu)勢種依次為變形菌門、放線菌門和擬桿菌門;劉梅等[17]報道的池塘內(nèi)循環(huán)流水養(yǎng)殖模式下水樣優(yōu)勢微生物依次為變形菌門和放線菌門;王朋等[18]研究報道大口黑鱸工程化循環(huán)水養(yǎng)殖中7—11月門水平的豐度前4的微生物門類分別為變形菌門、放線菌門、擬桿菌門和藍細菌門,屬水平優(yōu)勢菌為假單胞菌、黃桿菌和聚球菌屬。已有研究顯示,變形菌門在不同水產(chǎn)動物的養(yǎng)殖池塘中廣泛存在,且通常為最優(yōu)勢微生物群類, 而其他優(yōu)勢微生物則隨養(yǎng)殖品種不同存在較大差異[35-37]。變形菌門有降解污染物[38]、修復污染土壤[37]等作用,對于養(yǎng)殖環(huán)境微生態(tài)平衡有重要意義。

試驗結(jié)果顯示,大口黑鱸養(yǎng)殖池塘各部位微生物組成在7月、8月和9月有差異。9月毛刷樣本中的厚壁菌門豐度較7月和8月有大幅度增加,主要是微小桿菌屬和動性桿菌屬微生物比例增加。微小桿菌屬具有分解有機污染物、緩解重金屬污染和改善水質(zhì)等功能[35],但也可促進藍藻的生長[39]。本試驗結(jié)果顯示,大口黑鱸養(yǎng)殖池塘水中8月和9月的藍細菌門比例較高,同時水體各月的總氮質(zhì)量濃度大于0.2 mg/L、總磷質(zhì)量濃度大于0.02 mg/L,表明水體富營養(yǎng)化[40]。因此大口黑鱸在養(yǎng)殖到8月和9月時,應注意監(jiān)控池塘水質(zhì)和藻相變化,控制池塘內(nèi)藍藻的生長。

3.3 7—9月大口黑鱸池塘水理化因子變化及其與微生物組成的相關性關系

本試驗中各月份大口黑鱸養(yǎng)殖池塘水體理化指標隨養(yǎng)殖的月份改變而改變?？偭?、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮、氨氮、水溫等是被廣泛使用的水質(zhì)理化參數(shù),綜合地影響著水質(zhì)[41]。7—9月水體總磷含量的顯著降低與硝態(tài)氮的顯著升高,可知水體的水質(zhì)狀態(tài)可能發(fā)生了改變。水體中營養(yǎng)物質(zhì)的富集會導致藻類或水生植物加速生長,造成水華,并污染水質(zhì)[42]。而硝態(tài)氮則是氮循環(huán)的主要產(chǎn)物之一[43],一般硝態(tài)氮沒有危害,但在過量時,在厭氧條件下會生成對生物體有害的亞硝態(tài)氮,亞硝態(tài)氮含量的升高直接威脅著水生動物的生存[44]。所以在7—9月的大口黑鱸生態(tài)養(yǎng)殖中調(diào)控水體氮、磷水平非常重要。

從大口黑鱸生態(tài)養(yǎng)殖池塘微生物組成及理化因子相關性可知,該生態(tài)養(yǎng)殖池塘微生物與水體理化因子有關。這與羅金飛等[45-46]所報道的微生物群落的組成與養(yǎng)殖水體理化因子有密切關系觀點相同。本試驗結(jié)果表明,Norank_o__norank_c__Nitrospira和紅桿菌科的相對豐度與養(yǎng)殖區(qū)水體亞硝態(tài)氮含量呈顯著負相關(P<0.05)。Norank_o__norank_c__Nitrospira是一類常見的硝化細菌,常被用作微生態(tài)制劑,其主要作用是參與硝化作用的第二步,將環(huán)境中的亞硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮[47]。紅桿菌科的菌株LZB033的代謝產(chǎn)物二甲基磺酰丙酸(DSMP)可使硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為氮氣[48]?？梢奛orank_o__norank_c__Nitrospira與紅桿菌科微生物可能在大口黑鱸生態(tài)池塘中發(fā)揮降亞硝態(tài)氮的積極作用。筆者還發(fā)現(xiàn),根瘤菌科與硝態(tài)氮顯著負相關(P<0.05)。而Jia等[49]發(fā)現(xiàn),根瘤菌科與水體硝態(tài)氮正相關,認為根瘤菌科不同屬的細菌功能可能完全相反,有些具有硝化功能,有些具有反硝化功能。進一步分析池塘微生態(tài)系統(tǒng)功能基因的組成,更有利于深入解析養(yǎng)殖池塘中微生物構成與理化因子的關聯(lián)性。

筆者僅在8月和9月的一個時間點進行了部分理化指標的取樣測量,如開展長時間連續(xù)性的監(jiān)測將更有利于反映水質(zhì)的動態(tài)變化情況。另外筆者僅對微生物與理化因子的相關性進行了初步分析,無法確定二者之間的因果關系。若后續(xù)開展機理研究,將有助于揭示特定微生物在大口黑鱸生態(tài)養(yǎng)殖池塘中的作用,并為微生態(tài)環(huán)境的評估以及水質(zhì)調(diào)節(jié)型益生菌資源的開發(fā)提供依據(jù)。

4 結(jié) 論

采用16S rRNA基因高通量測序法研究發(fā)現(xiàn),7—9月大口黑鱸生態(tài)養(yǎng)殖池塘微生物組成和水體理化指標隨月份發(fā)生變化。微生態(tài)區(qū)水體中硝態(tài)氮含量與毛刷中的根瘤菌科豐度顯著負相關;生態(tài)區(qū)和養(yǎng)殖區(qū)亞硝態(tài)氮含量分別與毛刷中的Norank_o__norank_c__Nitrospira和底泥中的紅桿菌科豐度顯著負相關。研究結(jié)果提示,紅桿菌科、Norank_o__norank_c__Nitrospira和根瘤菌科細菌有作為大口黑鱸生態(tài)養(yǎng)殖水體中亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮含量指示或者調(diào)節(jié)功能菌的潛力。本試驗結(jié)果初步解釋了微生物組成與水體理化指標的關聯(lián)性,可為今后大口黑鱸生態(tài)養(yǎng)殖池塘7—9月水質(zhì)理化因子調(diào)控、生物修復法改善水質(zhì),及后續(xù)探究更深層次的生態(tài)養(yǎng)殖模式中水質(zhì)理化指標與水體微生物的變化機制提供參考,從而實現(xiàn)大口黑鱸水質(zhì)的生態(tài)化調(diào)控。