胡澤超,鄒孝翠,孫 健,邊晨晨,吉 紅

( 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,陜西 楊凌 712100 )

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)已成為分子生物學(xué)領(lǐng)域開(kāi)展基因定量表達(dá)分析的重要手段[1-2]。然而,RNA質(zhì)量、基因擴(kuò)增效率等因素均會(huì)影響qRT-PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性[3-4]。因此,通常需要引入合適的內(nèi)參基因?qū)υ囼?yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和校正,以減少試驗(yàn)誤差。理想情況下,內(nèi)參基因應(yīng)在任何條件下均具有恒定的表達(dá)水平。試驗(yàn)常用的內(nèi)參基因有18S核糖體RNA(18S rRNA)基因、3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)基因、延伸因子1α(EF1α)基因、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)基因等。研究發(fā)現(xiàn),一些內(nèi)參基因表現(xiàn)出不同程度的表達(dá)穩(wěn)定差異性[5-6]。金屬鉻脅迫下的草魚(yú)(Ctenopharyngodonidella)肝胰臟組織18S rRNA、GAPDH、β-actin、β微球蛋白(β2m)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性研究表明,β-actin基因的表達(dá)水平與其他基因有顯著差異[7]。這與嗜水氣單胞菌(Aeromonasehydrophila)感染的肝臟和頭腎組織18S rRNA、GAPDH、β-actin、EF1α基因穩(wěn)定性研究結(jié)果類似,β-actin基因的表達(dá)極不穩(wěn)定[8]。草魚(yú)呼腸孤病毒感染后的草魚(yú)脾組織18S rRNA、GAPDH、β-actin、EF1α基因穩(wěn)定性研究顯示,EF1α基因表達(dá)穩(wěn)定性很差[9]。以18S rRNA基因作為內(nèi)參基因,會(huì)對(duì)草魚(yú)肌球蛋白重鏈基因的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果造成偏差[10]。因此,需要篩選出特定條件下穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因或其組合,以保證qRT-PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性。而對(duì)營(yíng)養(yǎng)干預(yù)條件下草魚(yú)內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

筆者以不同脂肪水平日糧所飼養(yǎng)草魚(yú)的腹腔脂肪組織及不同濃度油酸處理的草魚(yú)脂肪細(xì)胞為試驗(yàn)材料,利用qRT-PCR技術(shù)并結(jié)合GeNorm[11]、NormFinder[12]、BestKeeper[13]軟件對(duì)β-actin、EF1α、GAPDH、18S rRNA內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估,以篩選出穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因或其組合,從而為今后在脂肪營(yíng)養(yǎng)干預(yù)條件下的草魚(yú)脂肪組織及脂肪細(xì)胞中基因表達(dá)分析研究提供理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)草魚(yú)購(gòu)自廣州金沙水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng);選取90尾體質(zhì)量為(15.0±0.5) g的草魚(yú),隨機(jī)分配,共3個(gè)試驗(yàn)組,每組設(shè)3個(gè)平行,每個(gè)平行10尾。試驗(yàn)開(kāi)始前用4%脂肪含量的草魚(yú)日糧飼喂暫養(yǎng)1周,使其適應(yīng)新環(huán)境和飼料;暫養(yǎng)1周后,3個(gè)組隨機(jī)分配用脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%、8%、12%的草魚(yú)日糧飼喂,并將其飼養(yǎng)在室內(nèi)9個(gè)1.0 m×0.5 m×0.6 m的魚(yú)缸中;按魚(yú)體質(zhì)量的1%～3%飼喂,每日8:00、12:00、18:00投喂,養(yǎng)殖期間充氣泵24 h充氧,保證充足溶解氧,開(kāi)關(guān)室內(nèi)日光燈模擬室外晝夜交替,每隔3 d更新1/3～1/2水體,飼養(yǎng)4周。試驗(yàn)期間養(yǎng)殖水溫26.5～27.5 ℃,pH 7.5～8.5,溶解氧質(zhì)量濃度>5.0 mg/L。

1.2 樣品采集

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后,禁食24 h,再用麻醉劑間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽麻醉草魚(yú),采集草魚(yú)的腹腔脂肪組織,液氮處理后-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 脂肪細(xì)胞培養(yǎng)及油酸處理

自楊凌康樂(lè)市場(chǎng)購(gòu)得體質(zhì)量約1 kg健康無(wú)病草魚(yú)6尾。麻醉后剪斷鰓弓放血,用洗潔精清洗魚(yú)體3遍至潔凈后待用。草魚(yú)前體脂肪細(xì)胞分離和培養(yǎng)參考實(shí)驗(yàn)室建立的培養(yǎng)體系[14]:分離出腹腔脂肪組織,用磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 7.4)對(duì)組織進(jìn)行4次洗滌,在0.1% I型膠原酶(Sigma,美國(guó))與2% BSA(Sigma,美國(guó))中于室溫下剪碎30 min。細(xì)胞懸浮液通過(guò)200 μm尼龍過(guò)濾器過(guò)濾,于2305 r/min(離心半徑10 cm)下離心10 min。離心后沉淀的細(xì)胞顆粒在紅細(xì)胞裂解緩沖液中室溫孵育6 min,然后洗滌2次,再懸浮于由DMEM/F12培養(yǎng)基、10% FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素組成的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(GM)中。以10 g/25 cm2的密度接種在明膠預(yù)處理的24孔板中。生長(zhǎng)7 d后,用添加10 μg/mL胰島素、10 nmol/L三碘甲狀腺原氨酸、1 μmol/L地塞米松和0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)的含GM的成脂培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分化。培養(yǎng)基每2 d更換1次。在分化第6天,用濃度0、40、80、120 mmol/L的油酸生長(zhǎng)培養(yǎng)基孵育細(xì)胞,24 h后收集細(xì)胞,于-80 ℃條件下儲(chǔ)存?zhèn)溆?。?duì)照組和處理組各設(shè)置4個(gè)平行。

1.4 總RNA提取及cDNA合成

依照RNeasy?Plus Mini Kit試劑盒(QIAGEN,德國(guó))說(shuō)明書(shū)進(jìn)行草魚(yú)脂肪組織和脂肪細(xì)胞的總RNA提取?？俁NA質(zhì)量檢測(cè)采用質(zhì)量體積1.5%瓊脂糖凝膠電泳法,RNA濃度和純度則使用NanoDropTMLite (Thermo Scientific,美國(guó))核酸濃度測(cè)定儀檢測(cè)。遵循PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser (TaKaRa, 日本)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)的指導(dǎo)將提取的RNA合成單鏈cDNA,再用60 μL的滅菌水稀釋混勻,于-20 ℃保存,用于qRT-PCR分析。

1.5 引物設(shè)計(jì)及合成

β-actin、EF-1α、GAPDH、18S rRNA 4個(gè)候選內(nèi)參基因的引物由北京擎科生物科技有限公司合成,引物序列[9]見(jiàn)表1。

表1 候選內(nèi)參基因的引物序列Tab.1 Primer sequences for the candidate reference genes

1.6 內(nèi)參基因擴(kuò)增效率檢驗(yàn)

將所合成的脂肪組織和細(xì)胞cDNA進(jìn)行每份10 μL等量混合,制成2種cDNA混合液,按照5倍比例稀釋6個(gè)梯度(1、1/5、1/25、1/125、1/625、1/3125),以其為模板進(jìn)行qRT-PCR分析;每個(gè)稀釋梯度的起始模板濃度與循環(huán)閾值間呈線性關(guān)系,根據(jù)循環(huán)閾值進(jìn)行自然對(duì)數(shù)作圖做線性回歸分析,得出相關(guān)系數(shù)r2和回歸直線斜率k,再根據(jù)E=(10-1/k-1)×100%計(jì)算擴(kuò)增效率E。

1.7 qRT-PCR分析

以所制備的cDNA為模板,采用所合成的引物,對(duì)包含上、下游引物各0.6 μL(0.5 μmol/L),1.0 μL cDNA,10 μL ChamQ TM SYBR?qPCR Master Mix(諾唯贊生物科技有限公司,中國(guó))和7.8 μL滅菌雙蒸水的20 μL擴(kuò)增體系利用CFX96TM實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad,美國(guó))進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增。PCR的擴(kuò)增程序:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性10 s,60 ℃退火及延伸共60 s,40個(gè)循環(huán)。熔曲程序:95 ℃變性15 s,以 0.05 ℃/s 速度由60 ℃升至 95 ℃;記錄熒光信號(hào)的變化。每個(gè)樣品3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

1.8 內(nèi)參基因穩(wěn)定性軟件分析及綜合評(píng)估

按照文獻(xiàn)所介紹的方法,采用GeNorm、NormFinder、BestKeeper軟件分析所獲取的qRT-PCR結(jié)果[15]。簡(jiǎn)單而言,利用GeNorm和NormFinder軟件分析前,需要對(duì)數(shù)據(jù)預(yù)處理,首先用每組基因的所有樣品中的循環(huán)閾值減去該組基因樣品中最小的循環(huán)閾值,得到差值(△Ct)并轉(zhuǎn)換成相對(duì)表達(dá)量2-△Ct。GeNorm軟件通過(guò)每組基因樣品的相對(duì)表達(dá)量2-△Ct來(lái)計(jì)算4個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值,若表達(dá)穩(wěn)定值越小則該基因表達(dá)穩(wěn)定性越高,相反則越差;其次,以標(biāo)準(zhǔn)化因子的配對(duì)變異值(Vn/Vn+1)來(lái)判斷最適的內(nèi)參基因個(gè)數(shù),當(dāng)Vn/Vn+1<0.15時(shí),最適內(nèi)參基因數(shù)是n個(gè),當(dāng)Vn/Vn+1>0.15時(shí),則最適內(nèi)參基因數(shù)是n+1個(gè)。NormFinder軟件利用2-△Ct值來(lái)得到表達(dá)穩(wěn)定值,其表達(dá)穩(wěn)定值越小表明穩(wěn)定性越高,反之越低。而B(niǎo)estKeeper軟件則是直接利用qRT-PCR檢測(cè)的結(jié)果循環(huán)閾值來(lái)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù),并將其作為評(píng)估標(biāo)準(zhǔn),且以標(biāo)準(zhǔn)偏差為第一標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)越小,內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性越好,反之越差;而當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)偏差>1時(shí),則該內(nèi)參基因表達(dá)極不穩(wěn)定。最后根據(jù)GeNorm、NormFinder和BestKeeper軟件的分析結(jié)果,對(duì)內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行綜合排名,綜合排名是根據(jù)候選內(nèi)參基因在各個(gè)軟件中的表達(dá)穩(wěn)定性排序給予得分(第1得4分,第2得3分,以此類推),計(jì)算總分,根據(jù)總分由高到低進(jìn)行綜合排名,以此篩選出穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因或組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因擴(kuò)增效率分析

4個(gè)候選內(nèi)參基因qRT-PCR擴(kuò)增效率分析結(jié)果見(jiàn)表1,以梯度稀釋的cDNA為模板制作標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算擴(kuò)增效率,結(jié)果表明,4個(gè)內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率均為95%～105%,符合qRT-PCR對(duì)擴(kuò)增效率的要求,且相關(guān)系數(shù)r2均接近1,具有高線性擬合度,結(jié)果可靠,可進(jìn)行后續(xù)的研究分析。

2.2 候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析

2.2.1 GeNorm軟件分析

候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性GeNorm分析結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。結(jié)果顯示,在脂肪組織中,4個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值排序?yàn)?18S rRNA=EF1α

圖1 候選內(nèi)參基因GeNorm分析穩(wěn)定值排序Fig.1 Stability value ranking in GeNorm of candidate reference genesa.脂肪組織;b.脂肪細(xì)胞.a.adipose tissue; b.adipocytes.

圖2 GeNorm分析最適內(nèi)參基因數(shù)目Fig.2 Analysis of the optimal number of reference genes by GeNorma.脂肪組織;b.脂肪細(xì)胞.a.adipose tissue; b.adipocytes.

2.2.2 NormFinder軟件分析

候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性NormFinder分析結(jié)果見(jiàn)圖3,結(jié)果顯示,在脂肪組織中,4個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值排序?yàn)?18S rRNA<β-actin

圖3 候選內(nèi)參基因Normfinder分析的穩(wěn)定值排序Fig.3 Stability value ranking in Normfinder of candidate reference genesa.脂肪組織;b.脂肪細(xì)胞.a.adipose tissue; b.adipocytes.

2.2.3 BestKeeper軟件分析

候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性BestKeeper分析結(jié)果見(jiàn)表2和圖4。結(jié)果顯示,在脂肪組織中,4個(gè)候選內(nèi)參基因表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)偏差排序?yàn)?β-actin<18S rRNA

圖4 候選內(nèi)參基因Bestkeeper分析的穩(wěn)定性排序Fig.4 Stability ranking in Bestkeeper of candidate reference genesa.脂肪組織;b.脂肪細(xì)胞.a.adipose tissue; b.adipocytes.

表2 候選內(nèi)參基因Bestkeeper軟件的穩(wěn)定性分析Tab.2 Stability analysis of candidate reference genes by Bestkeeper software

2.2.4 候選內(nèi)參基因綜合分析及排序

一般認(rèn)為,結(jié)合多種算法的分析結(jié)果而篩選出來(lái)的穩(wěn)定內(nèi)參基因或組合可以達(dá)到準(zhǔn)確校正數(shù)據(jù)結(jié)果的目的。綜合3種算法得出的結(jié)果見(jiàn)表3。在脂肪組織中,4個(gè)候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的綜合排名為:18S rRNA>β-actin>GAPDH>EF1α,18S rRNA基因是表達(dá)穩(wěn)定性最佳的內(nèi)參基因;在脂肪細(xì)胞中,4個(gè)候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的綜合排名為:18S rRNA=β-actin>GAPDH>EF1α,18S rRNA、β-actin基因是表達(dá)穩(wěn)定性最佳的內(nèi)參基因;另外,GeNorm的標(biāo)準(zhǔn)化因子配對(duì)差異分析結(jié)果均顯示,最適內(nèi)參基因數(shù)至少是2個(gè),所以選取表達(dá)穩(wěn)定性靠前的18S rRNA、β-actin基因作為最佳內(nèi)參基因組合(表3)。

表3 候選內(nèi)參基因綜合分析及排序Tab.3 Comprehensive analysis and sequencing of candidate reference genes

3 討 論

qRT-PCR技術(shù)是基因表達(dá)分析的常規(guī)手段。研究表明, 內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性會(huì)隨試驗(yàn)條件的變化而產(chǎn)生差異性[9,16]。因此,篩選在具體試驗(yàn)條件下理想的內(nèi)參基因的研究至關(guān)重要。

3.1 18S rRNA內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性分析

目前,有關(guān)魚(yú)類內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的研究結(jié)果不盡相同。在大西洋鮭(Salmosalar)[17]、斑馬魚(yú)(Daniorerio)[18]和黃鱔(Monopterusalbus)[19]中,不同組織間最為穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因?yàn)镋F1α;而在青鳉(Oryziaslatipes)[20]、草魚(yú)[9]和泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)[21]中,不同組織間穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因是18S rRNA。18S rRNA在機(jī)體各組織中表達(dá)量都很高,是由最為保守的基因之一18S rDNA轉(zhuǎn)錄而來(lái),故18S rRNA基因通常都能穩(wěn)定存在,受因素調(diào)控較小,是一種常用的內(nèi)參基因[22]。本試驗(yàn)顯示,18S rRNA基因是脂肪組織及脂肪細(xì)胞中表達(dá)穩(wěn)定性最高的內(nèi)參基因。在褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)不同發(fā)育階段及低溫處理的胚胎中發(fā)現(xiàn),18S rRNA基因較β-actin、GAPDH及EF1α 3個(gè)基因更適合作為內(nèi)參基因[23]。這樣的現(xiàn)象也在草魚(yú)的9個(gè)組織及在草魚(yú)呼腸孤病毒感染后的不同時(shí)間點(diǎn)的草魚(yú)脾組織中均有發(fā)現(xiàn),18S rRNA基因同樣穩(wěn)定表達(dá)[9]。在重金屬鎘脅迫下的草魚(yú)肝胰臟的相關(guān)研究中再一次被證明,18S rRNA基因在所選內(nèi)參基因中擁有最高的表達(dá)穩(wěn)定性[7]。這些研究結(jié)果與本試驗(yàn)類似,均顯示18S rRNA基因在各自的試驗(yàn)條件下穩(wěn)定表達(dá);有研究表明,rRNA合成的調(diào)控與mRNA無(wú)關(guān),并在影響mRNA表達(dá)的各種條件下,rRNA的表達(dá)幾乎沒(méi)有變化,在各種試驗(yàn)條件下均相對(duì)穩(wěn)定[24]。所以可以推測(cè),18S rRNA基因的表達(dá)在本試驗(yàn)涉及的脂肪營(yíng)養(yǎng)條件下不易被干預(yù),至少其優(yōu)于其他3種候選內(nèi)參基因。但在采用18S rRNA基因作為草魚(yú)肌球蛋白重鏈基因mRNA 在發(fā)育階段的內(nèi)參基因時(shí),其表達(dá)量呈不穩(wěn)定狀態(tài)[10];并且一些研究證實(shí),核糖體RNA確實(shí)會(huì)受到某些藥物和生物因素的影響[25]。所以將18S rRNA基因作為理想內(nèi)參基因不能成為普適性規(guī)律。總之,18S rRNA基因在本試驗(yàn)條件下可作為一種理想的內(nèi)參基因。

3.2 β-actin內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性分析

β-actin在維持細(xì)胞生理活動(dòng)方面如細(xì)胞結(jié)構(gòu)、運(yùn)動(dòng)、分裂等都發(fā)揮著十分重要的作用,是一種編碼肌動(dòng)蛋白的高度保守基因,是微絲的結(jié)構(gòu)成分,也是細(xì)胞骨架的主要成分[22]。因表達(dá)穩(wěn)定,已被廣泛應(yīng)用于qRT-PCR研究中,正如PubMed搜索結(jié)果所示,超過(guò)50%的qRT-PCR研究是使用β-actin基因作為參考基因[25]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,β-actin基因在草魚(yú)脂肪組織中的表達(dá)穩(wěn)定性僅次于18S rRNA基因,而在脂肪細(xì)胞中同18S rRNA基因一樣也能穩(wěn)定表達(dá)。與本試驗(yàn)選擇一致的候選內(nèi)參基因(18S rRNA、β-actin、EF1a、GAPDH)的研究發(fā)現(xiàn),在草魚(yú)的9個(gè)組織及被草魚(yú)呼腸孤病毒感染的CIK細(xì)胞中,β-actin基因表達(dá)穩(wěn)定性均較差,而在草魚(yú)呼腸孤病毒感染后不同時(shí)間點(diǎn)的脾組織中β-actin基因表達(dá)穩(wěn)定性僅次于18S rRNA基因[9]。而關(guān)于羅非魚(yú)(Oreochromis)[26]、異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)[27]、斑馬魚(yú)[28]等的研究顯示,β-actin基因分別在繁殖、病毒感染和細(xì)菌感染等特定條件下是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。然而,越來(lái)越多的證據(jù)表明,β-actin基因在某些情況下有表達(dá)差異,其表達(dá)會(huì)受生長(zhǎng)、分化,甚至一些生物刺激的影響[29]。筆者設(shè)計(jì)的不同脂肪營(yíng)養(yǎng)水平處理會(huì)導(dǎo)致脂代謝差異,組織及細(xì)胞的生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)水平密切相關(guān),理論上β-actin基因的表達(dá)水平存在差異性,本試驗(yàn)結(jié)果顯示,脂肪組織的β-actin基因表達(dá)穩(wěn)定性雖不是最佳,但其穩(wěn)定性接近18S rRNA基因。脂肪細(xì)胞β-actin和18S rRNA基因表達(dá)穩(wěn)定性一致,這可能與脂代謝復(fù)雜的調(diào)控過(guò)程有關(guān),β-actin可能較小程度受到脂肪代謝的調(diào)節(jié)。所以,最終建議將兩者結(jié)合作為基因表達(dá)分析中的雙內(nèi)參,這樣可以避免單一內(nèi)參基因校正的局限性(如內(nèi)參基因與目的基因的擴(kuò)增效率差異等),還能使試驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確。

3.3 GAPDH內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性分析

GAPDH也是較常見(jiàn)的管家基因之一,常被用于基因表達(dá)數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化,在DNA復(fù)制、細(xì)胞外分泌和細(xì)胞骨骼結(jié)構(gòu)研究方面至關(guān)重要[30]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,GAPDH基因表達(dá)穩(wěn)定性相對(duì)弱于18S rRNA和β-actin基因。Su等[9]在對(duì)草魚(yú)的鰓、頭腎、心臟、腸道、肝臟、肌肉、皮膚、脾臟和體腎等9個(gè)不同組織及用草魚(yú)呼腸弧病毒感染了不同時(shí)間的脾組織進(jìn)行內(nèi)參基因篩選的研究中發(fā)現(xiàn),GAPDH基因在所選4個(gè)內(nèi)參基因中的表達(dá)穩(wěn)定性均排名第3,穩(wěn)定性相對(duì)較差,這和本試驗(yàn)有著相似的研究結(jié)果。有研究顯示,GAPDH易受到試驗(yàn)條件的影響,并因?yàn)樗翘墙徒夂吞钱惿^(guò)程中的關(guān)鍵酶,容易不穩(wěn)定[31]。因此,GAPDH基因作為內(nèi)參基因也存在一定的爭(zhēng)議。而本試驗(yàn)涉及不同脂肪含量飼料投喂,不同脂肪量攝入的試驗(yàn)組脂肪代謝存在差異,結(jié)合脂肪代謝與糖代謝的緊密聯(lián)系,可預(yù)見(jiàn)GAPDH基因表達(dá)存在差異。因此,GAPDH基因不適合作為本試驗(yàn)條件下的理想內(nèi)參基因。

3.4 EF1α內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性分析

延伸因子1α(EF1α)參與了mRNA的翻譯,是細(xì)胞中表達(dá)比較多的蛋白質(zhì)之一[32]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,EF1α在脂肪組織及細(xì)胞中表達(dá)穩(wěn)定性最差,不及其他3個(gè)內(nèi)參基因。這與草魚(yú)呼腸孤病毒感染草魚(yú)脾組織的研究具有相似的結(jié)果,EF1α基因在4個(gè)內(nèi)參基因中表達(dá)穩(wěn)定性最差[9]。在鯉皰疹病毒Ⅱ型感染不同時(shí)間的脾臟中,EF1α基因穩(wěn)定性最佳[27],在達(dá)氏鱘(Acipenserdabryanus)[33]、藍(lán)點(diǎn)馬鮫(Scomberomorusniphonius)[34]的相關(guān)研究中均出現(xiàn)與之類似的研究結(jié)果。有研究表明,EF1α在生物的新陳代謝過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的作用,是蛋白質(zhì)合成過(guò)程的關(guān)鍵因子[35]。在本試驗(yàn)的不同脂肪營(yíng)養(yǎng)干預(yù)條件下,試驗(yàn)組脂代謝存在差異,結(jié)合蛋白質(zhì)代謝與脂代謝的緊密聯(lián)系,可預(yù)見(jiàn)EF1α表達(dá)存在差異,說(shuō)明該基因可能在脂代謝過(guò)程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。所以,EF1α基因不適合作為草魚(yú)脂肪組織和脂肪細(xì)胞的理想內(nèi)參基因。

以上結(jié)果表明,造成與本試驗(yàn)中脂肪組織和脂肪細(xì)胞的穩(wěn)定內(nèi)參基因種類異同性的因素可能一方面是樣品種類特性,另一方面是所選內(nèi)參基因數(shù)量和種類,但更多還是取決于試驗(yàn)處理?xiàng)l件。研究再次證明,基本上不存在具備普遍穩(wěn)定表達(dá)特性的內(nèi)參基因,一般而言,內(nèi)參基因均會(huì)受到不同因素的干擾。因此,在開(kāi)展qRT-PCR試驗(yàn)前,需要篩選合適的內(nèi)參基因,以確保研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。雖然在很多研究中都能篩選出穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因,但是也存在篩選失敗的情況,如被細(xì)菌感染后,條石鯛(Oplegnathusfasciatus)[36]、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[37]等都未能篩選出在所有組織中均能穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)條件下,在草魚(yú)脂肪組織和脂肪細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因是18S rRNA基因,而β-actin基因在脂肪細(xì)胞中與18S rRNA基因表達(dá)穩(wěn)定性一致。考慮到研究工作的復(fù)雜性、成本以及單一內(nèi)參校正的局限性,結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果,建議選擇18S rRNA、β-actin基因作為草魚(yú)脂肪組織和脂肪細(xì)胞的內(nèi)參基因組合。