宋曉霞 田金 劉玉玲 姜秋慧 劉曉妍 王倩倩 張麗麗 周曉麗趙曉麗

1河南中醫(yī)藥大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院 鄭州人民醫(yī)院婦科，鄭州 450000；2鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科，鄭州 450000

子宮內(nèi)膜癌是最常見的婦科惡性腫瘤。隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，用于子宮內(nèi)膜癌治療的方法在不斷提高，但晚期子宮內(nèi)膜癌患者的治愈率仍然很低。對于有腫瘤轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的患者，無論其分級或分期，預(yù)后均較差；這些患者的死亡風(fēng)險顯著增高，通常生活質(zhì)量較差，中位總生存時間明顯較低［1-2］。目前，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病和轉(zhuǎn)移機(jī)制尚不清楚。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長度大于200 個核苷酸，不編碼蛋白質(zhì)的功能性RNA 分子［3-4］。雖然lncRNA 不具有編碼蛋白質(zhì)的功能，但是能夠通過調(diào)節(jié)mRNA剪切、降解和翻譯等生理過程發(fā)揮作用［5］。序列相似性家族83成員H 反義RNA 1（FAM83H-AS1）是一種與癌癥進(jìn)展密切相關(guān)的lncRNA，其異常的高表達(dá)水平與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。目前，F(xiàn)AM83H-AS1 在子宮內(nèi)膜癌中的作用及其機(jī)制和FAM83H-AS1 對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用仍不清楚。本研究主要通過檢測人子宮內(nèi)膜癌組織及癌旁組織中LncRNA FAM83H-AS1 的表達(dá)水平，并通過細(xì)胞學(xué)試驗驗證LncRNA FAM83H-AS1 對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響。

資料與方法

1.主要資料

收集2018年10月至2020年10月就診于鄭州人民醫(yī)院的39 例子宮內(nèi)膜癌患者的腫瘤組織以及配對的癌旁組織，其中包括子宮內(nèi)膜樣癌20 例（其中G1 5 例，G2 7 例，G3 8例），非內(nèi)膜樣癌19例（其中包括漿液性癌10例，黏液性癌5 例，透明細(xì)胞癌4 例）。組織標(biāo)本于手術(shù)期間取得，并立即在-80 °C 下冷凍直到下一步使用。在樣本收集之前，從每個參與者處獲得了書面知情同意，研究方案經(jīng)鄭州人民醫(yī)院臨床研究倫理委員會批準(zhǔn)備案。

納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡范圍25～75 歲；符合《子宮內(nèi)膜癌診斷與治療指南》中子宮內(nèi)膜癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］；經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診者；入院前3 個月無性激素類藥物治療史者；術(shù)前未接受過放療、化療等抗腫瘤治療方案者；依從性良好者。

排除標(biāo)準(zhǔn)：腦外傷、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染引起的癡呆等；精神疾病患者；有酗酒或藥物濫用史的患者；心肝腎嚴(yán)重功能障礙患者；合并其他腫瘤性疾病者；血液性系統(tǒng)疾病患者。

4 種子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系（HEC-1B、HEC-1A、ishikawa 以及RL-952）和1株正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞系（hEEC）購自湖南豐暉生物科技有限公司。

2.主要方法

2.1.逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR） 采用qRT-PCR 檢測臨床上收集的39 例子宮內(nèi)膜癌患者的腫瘤組織以及配對的癌旁組織中FAM83H-AS1的表達(dá)水平。具體步驟：通過TRIzol 試劑（Thermofisher Scientific，美國）提取，并且使用NanoDrop 1000 分光光度計（Thermofisher Scientific，美國）測定蛋白質(zhì)濃度。使用Agilent 2100生物分析儀（Agilent Technologies，美國）評估提取的RNA 的質(zhì)量，使用PrimeScript synthesis cDNA kit（Takara Biotechnology，日本）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，SYBR Green PCR Master Mix（Takara Biotechnology，日本）進(jìn)行qPCR，將GAPDH mRNA 含量標(biāo)準(zhǔn)化 。 引 物 序 列 如 下 。 FAM83H-AS1：（R） 5’-AGCTCCACCTCCCGGGTTCACG-3’、 （F）5’-CGTGAACCCGGGAGGTGGAGCT3’。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

2.2.構(gòu)建低表達(dá)FAM83H-AS1 的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系靶向FAM83H-AS1 的shRNA 由生工生物科技有限公司合成，并插入pLKO.1-TRC 克隆載體（Addgene）中，靶向序列分別為：5’-CTTGCGATCGGGTCGATCGATCTTAGCTTTGCGA-3’（shRNA1）和5’-GTCCGTAGCTAGCTAAAGTCGATTCGATCGTACAAGA-3’（shRNA-2）。另外，將pLKO.1-TRC 對照載體用作對照的空載體（命名為sh-NC）。

2.3.細(xì)胞增殖試驗［細(xì)胞計數(shù)試劑盒8（CCK-8）］ 轉(zhuǎn)染后24 h 收集細(xì)胞并進(jìn)行重懸，將細(xì)胞密度為1×106個/ml、濃度為2×105個/ml 的單細(xì)胞懸液接種到96 孔板中，并在細(xì)胞接種后96 h 進(jìn)行CCK-8 測定（Beyotime，中國）。96 h 后取出孔板，將10 μl CCK-8 溶液添加到每個孔中并在37 ℃下孵育2 h后，使用酶標(biāo)儀（Bio-Rad Laboratories，美國）在450 nm波長下分析細(xì)胞的增殖活性。將來自3 個獨(dú)立試驗的結(jié)果取平均值進(jìn)行分析。

2.4.TUNEL 染色 首先用PBS 或HBSS 洗滌1 次。如果細(xì)胞貼得不牢，可以干燥樣品，使細(xì)胞貼得更牢；用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min；用PBS 或HBSS 洗滌1 次；加入含0.3% Triton X-100的PBS，室溫孵育5 min；在樣品上加50 μl TUNEL 檢測液，37 ℃避光孵育60 min；PBS 或HBSS 洗滌3 次。最后，用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察?？梢允褂玫募ぐl(fā)波長450～500 nm，發(fā)射波長515～565 nm。

2.5.EdU 染色 顯微鏡下觀察細(xì)胞，配制2×EdU 工作液，加入2×EdU 工作液，孵育-固定-棄去培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛溶液來固定，固定時間20 min。洗滌-滲透劑-洗滌，EdU檢測。

2.6.流式細(xì)胞術(shù) 使用胰酶消化細(xì)胞，1 000 轉(zhuǎn)/min 離心收集所有細(xì)胞；使用4 ℃預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞2 次；將0.5 ml PBS 懸浮細(xì)胞緩慢加入到預(yù)冷的70%乙醇溶液中（用PBS 配制，-20 ℃預(yù)冷），快速混勻，使用封口膜封口，-20 ℃固定過夜；將固定過的細(xì)胞以4 ℃、1 000 轉(zhuǎn)/min 離心5 min，棄上清液，轉(zhuǎn)移到EP 管中，用PBS 洗滌2 次。計數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個細(xì)胞/ml，取1 ml 進(jìn)行試驗。4 ℃，1 000 轉(zhuǎn)/min 離心5 min，取細(xì)胞沉淀；加入900 μl PBS緩沖液重懸細(xì)胞；加入100 μl RNaseA 溶液，使RNaseA 終濃度為100 mg/L，37 ℃孵育30 min；4 ℃，1 000 轉(zhuǎn)/min 離心5 min，棄去上清液；加入450 μl PBS 懸浮細(xì)胞，加入450 μl PI 染液，避光冰置20 min；上流式細(xì)胞儀檢測，分析記錄結(jié)果。

2.7.Transwell 試驗 Transwell 試驗檢測HEC-1A 和HEC-1B 的遷移和侵襲能力。Matrigel 膠4 ℃過夜，提前開制冰機(jī)，槍盒預(yù)冷。Matrigel 膠的原液為8.6 g/L。用無血清培養(yǎng)基將Matrigel 膠分別配制成100 mg/L 和30 mg/L 的溶液；向24 孔板的每孔中加入400 μl 30 g/L 的Matrigel 膠溶液，將transwell小室置于溶液內(nèi)，再滴加200 μl濃度為30 g/L的Matrigel 膠溶液，冰上放置1.0 h 后吸棄溶液、晾干；將100 μg/L 的Matrigel膠溶液吹打均勻后，吸取100 μl緩慢滴加于transwell上室基底膜上。晃動均勻后置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)放置0.5 h；將細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜；將小室放入含有600 μl 無血清培養(yǎng)基的24 孔板小孔中后，放在孵育箱中活化30 min 以上；消化細(xì)胞，將其制成單細(xì)胞懸液，吸取1.0 ml 至標(biāo)記好的1.5 ml EP 管內(nèi)，離心后用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個/ml 的單細(xì)胞懸液；取200 μl細(xì)胞懸液加入到小室上室中，在小室的下室中加入600 μl 含15% FBS 的RPMI-1640 培養(yǎng)基，放在孵育箱中培養(yǎng)24.0 h；棄培養(yǎng)基，用含4%多聚甲醛的固定液室溫固定細(xì)胞20 min，接著用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，然后用棉簽擦去小室上層細(xì)胞，沖洗晾干小室；于倒置顯微鏡下采集圖像（×100），隨機(jī)選取6個不同視野計數(shù)分析。

3.統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析用GraphPad Prism 8.0 軟件，對于臨床樣本分析，使用配對t檢驗檢測數(shù)據(jù)間差異有無統(tǒng)計學(xué)意義，對于細(xì)胞試驗，使用單向方差分析或者雙向方差分析，方差分析后使用Tukey’s multiple comparison test 進(jìn)行獨(dú)立檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1.lncRNA FAM83H-AS1 在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)水平明顯增高

癌組織lncRNA FAM83H-AS1 表達(dá)水平明顯高于癌旁組織（圖1）。為了進(jìn)一步分析FAM83H-AS1 的表達(dá)水平與患者的臨床表型的相關(guān)性，研究分析了FAM83H-AS1 表達(dá)水平與患者年齡、腫瘤大小、FIGO 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤組織學(xué)分級以及組織學(xué)類型的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM 83H-AS1 的表達(dá)水平與患者的年齡、腫瘤大小無明顯相關(guān)性（均P＞0.05）。但是，在FAM83H-AS1 陽性的患者中，具有更高的FIGO 分期；此外，研究還發(fā)現(xiàn)，非內(nèi)膜樣癌FAM83H-AS1 的表達(dá)水平更高，且腫瘤的組織學(xué)分級越高越有轉(zhuǎn)移的可能，預(yù)示著預(yù)后更不佳（表1）。

表1 子宮內(nèi)膜癌患者腫瘤組織中FAM83H-AS1的表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌患者臨床病理特征相關(guān)性[例（%）]

圖1 FAM83H-AS1在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)水平明顯提高

2.低表達(dá)FAM83H-AS1的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系構(gòu)建成功

為了驗證FAM83H-AS1 在子宮內(nèi)膜癌中的作用，我們將shRNA 靶向FAM83H-AS1 轉(zhuǎn)染至子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1A 和HEC-1B 中，通過qRT-PCR 檢測細(xì)胞中FAM83H-AS1 的表達(dá)水平，確認(rèn)敲低效率，發(fā)現(xiàn)shRNA-1 與shRNA-2 均具有良好的敲低效應(yīng)，并且shRNA-1的效率更高（圖2）。

圖2 shRNA對FAM83H-AS1敲低效率的檢測。A：逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測在shRNA 靶向FAM83H-AS1 轉(zhuǎn)染至子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1A和HEC-1B中之后FAM83H-AS1的表達(dá)水平；B：熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中綠色熒光表達(dá)以確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功

3.敲低FAM83H-AS1削弱子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖活性

采用CCK-8 試劑盒在敲低FAM83H-AS1 之后檢測HEC-1A 和HEC-1B 的增殖活性，結(jié)果顯示，在敲低FAM83H-AS1 的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1A 和HEC-1B 中，24 h 后細(xì)胞活性顯著低于轉(zhuǎn)染Scr-shRNA 的細(xì)胞（圖3A）；進(jìn)一步將子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系HEC-1A 和HEC-1B 接種在瓊脂糖凝膠平皿中，用于分析細(xì)胞的克隆形成數(shù)量，接種后7 d，對平板進(jìn)行結(jié)晶紫染色，研究結(jié)果顯示，敲低FAM83H-AS1 的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1A 和HEC-1B 在平板中形成的細(xì)胞克隆數(shù)量顯著減少（圖3B）。采用EdU染色檢測細(xì)胞中的增殖細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果顯示，EdU 陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少（圖3C）。

圖3 敲低FAM83H-AS1 削弱子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖活性。A：細(xì)胞計數(shù)試劑盒8 檢測HEC-1A 與HEC-1B 在敲減FAM83H-AS 前后細(xì)胞增殖情況；B：細(xì)胞克隆形成試驗檢測HEC-1A與HEC-1B在敲減FAM83H-AS前后細(xì)胞增殖情況；C：EdU染色檢測細(xì)胞的DNA復(fù)制能力

4.敲低FAM83H-AS1促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的凋亡

采用TUNEL 染色檢測敲低FAM83H-AS1 的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1A 和HEC-1B 的凋亡小體的形成數(shù)量，觀察到在sh-NC 的細(xì)胞中，平均每個視野有2～3 個綠色熒光基團(tuán)（凋亡小體），然而在敲低FAM83H-AS1 的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中，平均每個視野的凋亡小體數(shù)量明顯增加（圖4A）。進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞中的凋亡比例，我們觀察到敲低FAM83H-AS1 會顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡（圖4B）。以上結(jié)果均充分說明：敲低FAM83H-AS1 會導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞活性降低，并且促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

圖4 敲低FAM83H-AS1 促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡。A：TUNEL 染色檢測細(xì)胞中的凋亡小體數(shù)量；B：流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞比例

5.敲低FAM83H-AS1 抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的遷移與侵襲

為了進(jìn)一步明確敲低FAM83H-AS1對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響，采用Transwell 試驗檢測HEC-1A 和HEC-1B細(xì)胞的遷移和侵襲能力，從結(jié)果中我們發(fā)現(xiàn)，敲低FAM83H-AS1 會顯著抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的遷移和侵襲（圖5A、B）。

圖5 敲低FAM83H-AS1 抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的遷移與侵襲。A：Tranwell 試驗檢測HEC1A 和HEC1B 的遷移能力；B：Tranwell 試驗檢測HEC1A和HEC1B的侵襲能力

討論

在人類基因組中大約只有2%的基因編碼蛋白質(zhì)；大多數(shù)基因組不會翻譯成蛋白質(zhì)，而是可以編碼一系列非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）［7-10］。在最近的幾十年中，已經(jīng)鑒出了一組稱為lncRNA 的ncRNA。大多數(shù)lncRNA 通常位于細(xì)胞核中，在那里它們可能在表觀遺傳調(diào)控中起關(guān)鍵作用，包括通過染色質(zhì)修飾；但是，越來越多的研究已經(jīng)確定了細(xì)胞質(zhì)中也存在lncRNA。這表明lncRNA 在基因的表達(dá)、翻譯以及翻譯后調(diào)控中都起著重要作用［11-14］。研究表明，具有序列相似性的FAM83H-AS1的lncRNA家族的異常表達(dá)與癌癥患者的預(yù)后不良有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，肝癌患者中FAM83H-AS1 高表達(dá)與總生存期（overall survival，OS）具有明顯相關(guān)性［15-17］。在胃癌中，F(xiàn)AM83H-AS1 高表達(dá)能夠影響胃癌患者的OS 和無病生存率（disease-free survival，DFS），F(xiàn)AM83H-AS1 在胃癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著癌基因的作用［18-19］。另一項研究表明，卵巢癌患者腫瘤組織中FAM83H-AS1 的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，并且FAM83H-AS1 高表達(dá)與卵巢癌的腫瘤分化程度、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（LNM）和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)［20］。

本研究主要采用qRT-PCR 檢測臨床收集的39 例子宮內(nèi)膜癌患者的腫瘤組織及其配對的癌旁組織中FAM83H-AS1的表達(dá)情況，為了進(jìn)一步分析FAM83H-AS1的表達(dá)水平與患者的臨床表型的相關(guān)性，研究分析了FAM83H-AS1 的表達(dá)水平與患者的年齡、腫瘤大小、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度以及組織學(xué)類型的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM83H-AS1的表達(dá)水平與患者的年齡、腫瘤大小無明顯相關(guān)性（均P＞0.05）；但是，高表達(dá)FAM83H-AS1的患者具有更高的FIGO 分期；此外，研究還發(fā)現(xiàn)，非內(nèi)膜樣癌FAM83H-AS1 的表達(dá)水平更高，且腫瘤的組織學(xué)分級越高越有轉(zhuǎn)移的可能，預(yù)示著預(yù)后更不佳。進(jìn)一步使用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑盒將靶向FAM83H-AS1 的shRNA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1A 和HEC-1B中，通過qRT-PCR 檢測shRNA 的轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示，敲低FAM83H-AS1 會顯著抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞在體外的增殖，其主要表現(xiàn)在低表達(dá)FAM83H-AS1 HEC-1A 和HEC-1B 的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖活性被顯著抑制，在平板上形成的克隆數(shù)量也顯著減少，EdU 陽性細(xì)胞數(shù)量也顯著降低；而且，進(jìn)一步通過TUNEL 染色以及流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，敲低FAM83H-AS1 會顯著促進(jìn)HEC-1A 與HEC-1B 中凋亡小體的形成；進(jìn)一步采用Transwell 試驗檢測HEC-1A 和HEC-1B 的遷移和侵襲能力，從結(jié)果顯示，敲低FAM83H-AS1 會顯著抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的遷移和侵襲，表明低表達(dá)FAM83H-AS1會明顯促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的凋亡。以上結(jié)果說明，F(xiàn)AM83H-AS1 在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和發(fā)展中具有重要的作用。

綜上所述，lncRNA FAM83H-AS1高表達(dá)可能與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。但是，由于樣本數(shù)量較少，lncRNA FAM83H-AS1在子宮內(nèi)膜癌發(fā)病機(jī)制中的作用以及表達(dá)和調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。此外，該基因是否可作為子宮內(nèi)膜癌患者的易感篩查指標(biāo)，以及如何找到有效下調(diào)lncRNA FAM83H-AS1 的方法，并能夠讓其應(yīng)用于臨床，是我們下一步研究的目標(biāo)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突