李云輝 朱博文 崔鑫

1洛陽市中心醫(yī)院婦科，洛陽 471000；2洛陽市第三人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，洛陽 471002；3洛陽市中心醫(yī)院病理科，洛陽 471000

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，好發(fā)于圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后女性。中國每年有接近8 萬的新發(fā)病例，致死率僅次于卵巢癌和宮頸癌［1］，嚴(yán)重危害女性的健康。雖然子宮內(nèi)膜癌的診治已進入分子檢測時代，但是由于基層醫(yī)院條件限制，分子實驗室以及人才梯隊尚未成熟，往往更多地依賴于傳統(tǒng)組織學(xué)分型，傳統(tǒng)組織學(xué)分為Ⅰ型和Ⅱ型［2］。I型子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生主要與雌激素（ER）相關(guān)，在I 型子宮內(nèi)膜癌中最常見的組織學(xué)類型為子宮內(nèi)膜樣腺癌。子宮內(nèi)膜樣腺癌的病因及發(fā)病機制尚未明確。目前，研究發(fā)現(xiàn)PTEN、PAX-2、P53等基因突變及微衛(wèi)星不穩(wěn)定性均與其發(fā)病密切相關(guān)［3-5］。

小泛素相關(guān)修飾物（small ubiquitin related modifier，SUMO）是一種主要位于真核生物中高度保守的能夠參與蛋白質(zhì)小泛素化相關(guān)修飾的一類蛋白［6］，把SUMO蛋白通過與底物蛋白的共價結(jié)合調(diào)節(jié)靶蛋白的功能這一過程稱為SUMO 化修飾［7］。SUMO 化修飾是一個動態(tài)可逆的過程。逆反應(yīng)是指把SUMO 蛋白和靶蛋白分離的過程，在這個逆反應(yīng)過程中SUMO 特異性蛋白酶（SUMO-specific proteases，SENPs）發(fā)揮著關(guān)鍵作用。SENPs 參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展［8］。在SENPs 家族中，SENP1 是最重要也是目前研究最多的一種，它能夠催化大量SUMO 和靶蛋白分離。研究發(fā)現(xiàn)：SENP1 在結(jié)直腸癌、前列腺癌、膀胱癌等組織中高表達(dá)［9-11］，但其在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)以及是否和ER 的表達(dá)存在相關(guān)性尚無相關(guān)報道。因此，本研究擬通過相關(guān)試驗研究分析SENP1 和ER 在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的表達(dá)和兩者之間的關(guān)系，探討SUMO 化修飾在子宮內(nèi)膜樣腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，進一步探索子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機制，為患者的治療提供依據(jù)。

材料與方法

1.主要材料和試劑

正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞株，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株（ishikawa），DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基，（Gibco 公司，美國），胎牛血清（Gibco 公司，美國），F(xiàn)ast SYBR Green 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）試劑盒（天根生化科技有限公司，中國），BCA 蛋白定量試劑盒和增強型RIPA 裂解液（博士徳公司，中國），SENP1 抗體（EPR3844；Abcam，英國），GAPDH 抗體（Abcam，英國），DAB（威佳科技，中國），山羊血清封閉液（浩然生物科技，中國），蘇木素（博谷生物科技，中國），F(xiàn)ulvestrant（氟維司群，MCE）。

2.方法

2.1.臨床樣本收集 選取2018 年10 月至2020 年10 月在洛陽市中心醫(yī)院行手術(shù)切除的子宮內(nèi)膜樣腺癌組織和正常子宮內(nèi)膜組織各80 份，把收集到的標(biāo)本分別進行SENP1（工作濃度1∶700）和ER（工作濃度1∶400）免疫組化染色。收集患者病例信息，對患者進行長期隨訪，詳細(xì)了解患者的治療情況及預(yù)后情況。所有標(biāo)本的病理診斷及免疫組化的判讀均由洛陽市中心醫(yī)院病理科2 位副主任醫(yī)師獨立證實。

本 研 究 經(jīng) 醫(yī) 學(xué) 倫 理 委 員 會 審 批 通 過（LWLL-20230216）。

2.2.細(xì)胞培養(yǎng)與篩選 正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和ishikawa 分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5% CO2，且飽和濕度。根據(jù)細(xì)胞生長情況，約每3 d 按1∶2 比例進行細(xì)胞傳代，分為試驗組和對照組，試驗組加入氟維司群（儲備液濃度10 μmol/L，每毫升DMEM培養(yǎng)基加入1 μl儲備液），作用時間48 h。

2.3.RNA 提取和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測SENP1 和ER 的mRNA 的表達(dá)量 將培養(yǎng)24 h 后的細(xì)胞使用Trizol 裂解提取總RNA。通過Nano Drop 2000 分光光度計測定總RNA 的濃度和純度。使用天根生物試劑盒逆轉(zhuǎn)錄總RNA 合成cDNA，并添加去DNA 試劑以消除基因組DNA 污染。采用SYBR Green Ⅰ熒光染料法進行PCR，擴增條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min，隨后94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s 和72 ℃ 30 s，共40 個循環(huán)。通過熔解曲線分析驗證PCR 的擴增效率。使用2-ΔΔCt 方法計算靶基因的相對表達(dá)水平，PCR 引物序列如下。 ER 引物序列：正向引物GGGAAGTATGGCTATGGAATCTG， 反向引物TGGCTGGACACATATAGTCGTT。SENP1引物序列：正向引物 AAGATTCCCAGACTCCAACTCCCA， 反 向 引 物TGAATGTTCCCGCTCCTGCAAT。

2.4. 蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blotting）檢測SENP1 和ER 蛋白表達(dá)水平 按照試驗分組和對照組分別給予相應(yīng)藥物濃度處理；48 h 后用加有200 mmol/L N-乙基馬來酰亞胺的裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度，用4%～20%分離膠進行蛋白分離，冰浴下120 V 轉(zhuǎn)膜90 min，室溫下將膜置于5%脫脂奶粉中封閉1 h，然后分別加入抗體SENP1（1∶1 000）、ER（1∶2 000），4 ℃環(huán)境下孵育過夜，次日以1∶500稀釋的二抗孵育1 h，以超信號蛋白檢測試劑盒檢測蛋白表達(dá)，凝膠成像系統(tǒng)掃描光密度值，Image J 軟件進行定量分析。以GAPDH（1∶1 000）為內(nèi)對照，以目的蛋白條帶GAPDH 蛋白條帶的比值計量各蛋白表達(dá)水平。

3.統(tǒng)計學(xué)分析

運用GraphPad Prism 9 軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)系數(shù)，計量資料符合正態(tài)分布，所有實驗均重復(fù)3 次，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1.SENP1和ER在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中高表達(dá)

子宮內(nèi)膜樣腺癌組織SENP1 和ER 蛋白表達(dá)高于正常子宮內(nèi)膜組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖1、圖2、表1。

圖1 小泛素相關(guān)修飾物特異性蛋白酶1在正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)（免疫組織化學(xué)染色 ×100倍）

圖2 小泛素相關(guān)修飾物特異性蛋白酶1 在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)（免疫組織化學(xué)染色 ×100倍）

2.RT-PCR檢測結(jié)果

子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞SENP1 和ER 表達(dá)均高于正常子宮內(nèi)膜上皮。通過采用ER特異性抑制劑（氟維司群）抑制ER的表達(dá)后，SENP1 在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中mRNA 的表達(dá)量明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3、圖4。

圖3 SENP1、ER 在正常子宮內(nèi)膜上皮、子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中的表達(dá)

圖4 子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中加入ER 抑制劑前后SENP1、ER的表達(dá)

3.Western blotting結(jié)果

SENP1 和ER 在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中的蛋白表達(dá)均高于正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中［（0.11±0.04）比（1.04±0.06）、（0.67±0.10）比（1.57±0.5）］；加入氟維司群抑制ER 的表達(dá)后，SENP1在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中的蛋白表達(dá)明顯下降，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞組SENP1 和ER 蛋白相對水平高于子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞+抑制劑組［（1.11±0.06）比（0.14±0.04）、（0.65±0.06）比（0.18±0.05）］，兩者之間具有正相關(guān)性，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見圖5、圖6。

圖5 SENP1、ER 在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞組和正常子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞組中的表達(dá)

圖6 SENP1、ER 在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞組和子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞+抑制劑組中的表達(dá)

討論

蛋白質(zhì)的翻譯后修飾（post-translational modifications，PTMs）是蛋白質(zhì)功能調(diào)控的重要方式，在多種細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和生物學(xué)發(fā)育過程種發(fā)揮著重要作用。PTMs 方式多樣，主要包括甲基化、磷酸化、乙?；⒎核鼗?、類泛素化等［12］。SUMO 是一種在真核生物中廣泛存在且高度保守的類泛素蛋白，通過與底物蛋白共價結(jié)合動態(tài)可逆性修飾靶蛋白，這一動態(tài)可逆的過程稱為SUMO 化修飾［7］。SUMO 化修飾作為一種重要的類泛素化蛋白修飾，參與調(diào)節(jié)靶蛋白細(xì)胞定位和功能，調(diào)節(jié)細(xì)胞核內(nèi)蛋白的定位和轉(zhuǎn)錄因子的活性。SUMO 修飾的異常調(diào)控與腫瘤性疾病、病毒感染性疾病、代謝性疾病等密切相關(guān)［8］。去SUMO 化的過程是指通過去SUMO化酶的作用把SUMO亞基從底物蛋白上解離的過程。在去SUMO 化酶中，SENPs 家族是最重要的一類，發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在SENPs 家族成員中，SENP1 是最先被引用和報道的，也是研究最多的一種。SENP1參與修飾廣泛的底物，能夠催化大量SUMO化蛋白去SUMO化［13-14］。

子宮內(nèi)膜癌傳統(tǒng)分型包括世界衛(wèi)生組織組織學(xué)分型及Bokhman分型。Bokhman分型根據(jù)是否與雌激素相關(guān)，將子宮內(nèi)膜癌分為Ⅰ型和Ⅱ型［2］。Ⅰ型為雌激素依賴性，主要是由雌激素長期刺激導(dǎo)致，在圍絕經(jīng)期或絕經(jīng)后女性中發(fā)病率較高。I型子宮內(nèi)膜樣癌早期常缺乏明顯的臨床癥狀，容易被忽視，致使一部分患者確診時已錯過最佳的治療時機。目前，研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的高危因素主要包括雌激素用藥史、他莫昔芬用藥史、不孕癥、肥胖、惡性腫瘤病史或家族史等［15］，但是具體發(fā)病機制仍存在很多爭議。研究比較多的靶點主要有PTEN 的缺失、TP53突變、DNA 錯配修復(fù)（MMR）蛋白缺失、POLE突變等［16-18］。

SENP1 與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。在不同的腫瘤中，SENP1的靶點也存在多樣性：在前列腺癌中的靶點主要是作用于前列腺素受體和剪接因子相關(guān)蛋白；在睪丸癌中主要調(diào)節(jié)生殖干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子OCT4 的蛋白活性［19-20］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)：SENP1在子宮內(nèi)膜樣腺癌中高表達(dá)，但是具體機制尚未深入探究。我們推測：在子宮內(nèi)膜樣腺癌中，SENP1 和ER 存在相關(guān)性，共同促進了腫瘤的發(fā)生。本研究通過氟維司群抑制ER的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SENP1無論是蛋白水平還是mRNA 水平均顯著下降，故證實SENP1 在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的作用與ER 有關(guān)，并且可能發(fā)揮著協(xié)同作用。下一步我們將繼續(xù)探究SENP1對子宮內(nèi)膜樣腺癌生物學(xué)功能的影響，以期能夠更深入地了解SENP1 在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的作用機制。

綜上所述，SENP1 在子宮內(nèi)膜樣腺癌中高表達(dá)，并且SENP1對子宮內(nèi)膜樣腺癌的作用與ER 是正相關(guān)的，但其具體的作用機制仍需進一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突