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        白藜蘆醇影響金黃色葡萄球菌生物被膜形成的分子機(jī)制

        2023-07-22 07:25:50唐曉華彭琦袁文常
        關(guān)鍵詞:生物

        唐曉華 彭琦 袁文常

        1廣州醫(yī)科大學(xué)金域檢驗(yàn)學(xué)院,廣州 510180;2廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院檢驗(yàn)科,廣州 510145

        金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)除了可引起輕微的淺表皮膚感染外,還可引起危及生命的全身感染,如肺炎、敗血癥、心內(nèi)膜炎和中毒性休克綜合征,由于其對(duì)多種藥物的耐藥性,已成為一個(gè)重大的全球健康問(wèn)題[1-2]。金黃色葡萄球菌生物被膜是由菌落和胞外聚合物(exopolysaccharide,EPS)粘附形成的微生物群落[3]。多糖細(xì)胞內(nèi)粘附素(polysaccharide intercellular adhesin,PIA)是金黃色葡萄球菌生物被膜中的主要EPS[4]。PIA 介導(dǎo)細(xì)胞間粘附并形成緊密連接的生物被膜,由細(xì)胞內(nèi)粘附(icaADBC)操縱子產(chǎn)生[5]。除了PIA,細(xì)胞外DNA(eDNA)和一些表面蛋白也有助于生物被膜的穩(wěn)定性[6]。此外,eDNA 可能在生物被膜的早期粘附和成熟階段充當(dāng)靜電聚合物[7],并通過(guò)將PIA 與生物被膜相關(guān)蛋白和生物被膜的其他成分連接來(lái)穩(wěn)定生物被膜的結(jié)構(gòu)[8]。由于生物被膜的形成,可導(dǎo)致金黃色葡萄球菌感染持續(xù)存在,同時(shí),生物被膜保護(hù)的細(xì)菌細(xì)胞比浮游細(xì)胞對(duì)大多數(shù)抗生素和宿主防御系統(tǒng)更有抵抗力[9]。據(jù)報(bào)道,生物被膜可使抗微生物耐藥性增加100~1 000倍[10]。因?yàn)槭苌锉荒けWo(hù)的細(xì)菌比浮游細(xì)菌需要更多的抗生素去根除,所以很難在體內(nèi)達(dá)到最低的抗生素濃度來(lái)根除生物被膜下的細(xì)菌。此外,一旦建立了生物被膜,就很難根除[11]。

        白藜蘆醇是葡萄屬植物產(chǎn)生的一種結(jié)構(gòu)類(lèi)似于雌激素乙菧酚的植物抗毒素[12]。研究顯示,白藜蘆醇具有良好的抗炎、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤等多種生物學(xué)活性[13]。同時(shí),白藜蘆醇也有較好的抗菌活性[14]。白藜蘆醇可以抑制金黃色葡萄球菌生長(zhǎng),并且通過(guò)下調(diào)SaeRS 來(lái)減少金黃色葡萄球菌分泌α-溶血素[13]。然而,白藜蘆醇在金黃色葡萄球菌生物被膜形成中的作用機(jī)制尚不清楚,也沒(méi)有系統(tǒng)的研究。因此,2023 年1 月至4 月,本研究旨在探討白藜蘆醇對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜形成的影響及其分子機(jī)制。

        材料與方法

        1.菌株及主要儀器試劑

        黏液型金黃色葡萄球菌SYN菌株分離自廣州市某三甲醫(yī)院1 例腎結(jié)石患者的腎臟膿液,是一株強(qiáng)生物被膜生成金黃色葡萄球菌。酶標(biāo)儀(美國(guó)Biotek 公司)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(美國(guó)BIO-RAD 公司)、TE 緩沖溶液、TEN 緩沖液(中國(guó)酷萊博公司);RNAiso Plus、TB Green Premix Ex Taq、PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(中國(guó)TaKaRa公司);白藜蘆醇(美國(guó)SIGMA 公司);胰酶大豆肉湯(tryptic soy broth,TSB)培養(yǎng)基、MH 培養(yǎng)基(中國(guó)環(huán)凱公司),熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物合成(中國(guó)深圳華大基因),引物序列見(jiàn)表1。

        表1 熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物及其序列

        2.方法

        2.1.白藜蘆醇最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定 采用肉湯微量稀釋法測(cè)定MIC。將細(xì)菌SYN 接種至血平板,37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取血平板上單克隆菌落在生理鹽水中調(diào)成0.5 麥?zhǔn)蠞岫染海肕H 液體培養(yǎng)基按1∶100 比例稀釋菌液。DMSO 溶解白藜蘆醇,稀釋至4 096 mg/L 母液濃度,后續(xù)實(shí)驗(yàn)再進(jìn)行倍比稀釋。在96 孔板每孔中先加入稀釋后的菌液100 μl,再分別加入100 μl 藥物,采用二倍稀釋法使白藜蘆醇的終濃度分別為2 048、1 024、512、256、128、64、32、16、8 mg/L。設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照孔(200 μl 菌液)和陰性對(duì)照孔(200 μl MH 培養(yǎng)基)。37 ℃培養(yǎng)24 h,觀察結(jié)果,以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度為MIC。

        2.2.不同濃度白藜蘆醇下細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 在6孔板中按照1∶100比例加入菌液及含512、256、128、64 mg/L白藜蘆醇的TSB培養(yǎng)基,放置于37 ℃恒溫?fù)u床,200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)。設(shè)置3 個(gè)重復(fù)孔,以不加任何藥物的孔作為陽(yáng)性對(duì)照。每隔1 h測(cè)量OD600吸光度值,繪制金黃色葡萄球菌SYN的生長(zhǎng)曲線。

        2.3.結(jié)晶紫法不同濃度白藜蘆醇對(duì)生物被膜形成的影響 取96 孔板,加入含不同亞抑菌濃度白藜蘆醇的TSB 培養(yǎng)基200 μl。將過(guò)夜培養(yǎng)的SYN 菌液以1∶100 比例加入到含有不同濃度白藜蘆醇的96 孔板中,37 ℃培養(yǎng)24 h 后,棄去菌液,用無(wú)菌PBS 輕柔洗滌3 次去除浮游菌,自然晾干。每孔加入200 μl 99%甲醇溶液,固定10 min,自然晾干。每孔加入200 μl 0.5%結(jié)晶紫溶液,染色15 min,用去離子水輕柔洗滌每孔直至流水無(wú)色,放入37 ℃培養(yǎng)箱烘干。每孔加入200 μl 33%冰乙酸,放入水平旋轉(zhuǎn)儀上緩慢震蕩,使孔中的結(jié)晶紫染液充分溶解,放入酶標(biāo)儀測(cè)定OD590吸光度值。

        2.4.苯酚濃硫酸法檢測(cè)亞抑菌濃度白藜蘆醇對(duì)生物被膜胞外多糖產(chǎn)生的影響 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:分別吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.8 ml 葡萄糖溶液(40 mg/L),各以ddH2O 補(bǔ)充至2.0 ml。加入1.0 ml 6%苯酚及5.0 ml濃硫酸,搖勻靜置30 min,于490 nm測(cè)量光密度,根據(jù)葡萄糖濃度與光密度值計(jì)算繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。于6 孔板中按1∶100 比例將SYN 接種于終濃度為128 mg/L 白藜蘆醇的TSB 培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)24 h。舍棄浮游菌,無(wú)菌PBS 輕柔洗滌2 次,去除浮游態(tài)細(xì)菌。用3.0 ml PBS重懸生物被膜,70 ℃水浴加熱1 h后,11 500 r/min 離心(離心半徑10.37 cm)12 min,收集沉淀。沉淀中加入3.0 ml 3% EDTA 溶液,混勻,11 500 r/min 離心(離心半徑10.37 cm)12 min。上清液用孔徑為0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾,濾液為待測(cè)多糖樣品。取樣品1.0 ml,加入1.0 ml ddH2O,加入1.0 ml 6%苯酚,加入濃硫酸5 ml,充分混勻后靜置30 min,測(cè)量A490吸光度值。

        2.5.苯酚氯仿抽提法檢測(cè)亞抑菌濃度白藜蘆醇對(duì)eDNA釋放的影響 于6 孔板中加入終濃度為128 mg/L 白藜蘆醇的TSB 中,按1∶100 比例加入過(guò)夜培養(yǎng)的菌液,以不加白藜蘆醇的孔作為對(duì)照組,37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)液,無(wú)菌PBS 輕柔洗滌,每孔加入1.0 ml TEN 緩沖液,重懸黏附于孔板底的生物被膜,轉(zhuǎn)入EP 管中,12 000 r/min 離心(離心半徑10.37 cm)5 min。取上清500 μl 于預(yù)冷EP 管,加入300 μl TE 緩沖液,加入300 μl 苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)進(jìn)行萃取,4 ℃,12 000 r/min 離心(離心半徑10.37 cm)10 min。取500 μl 上清液于預(yù)冷EP 管,加入500 μl 氯仿∶異戊醇(24∶1)再次萃取,4 ℃,12 000 r/min離心(離心半徑10.37 cm)10 min。取上層水相于預(yù)冷EP管,加入3倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇,1/10體積的預(yù)冷乙酸鈉,混勻,20 ℃放置過(guò)夜。取出過(guò)夜后EP 管,4 ℃,15 000 r/min離心(離心半徑10.37 cm)30 min后棄上清,70%預(yù)冷乙醇洗滌沉淀,在空氣中晾干殘余乙醇。加入20 μl TE 緩沖液充分溶解管底沉淀。Nanodrop 2000 分光光度計(jì)檢測(cè)測(cè)量eDNA濃度,eDNA含量以ng/μL表示。

        2.6.實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)生物被膜形成相關(guān)基因細(xì)菌總RNA 的提取根據(jù)Takara RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)并稍加改進(jìn)進(jìn)行,cDNA 合成使用PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa),主要操作步驟:取1.0 ml 對(duì)數(shù)期培養(yǎng)物于離心管,8 000 r/min 離心(離心半徑10.37 cm)2 min,棄上清。加入100 μl TE Buffer,100 μl溶菌酶(20 g/L),10 μl 溶葡萄球菌素(1 mg/L),重懸菌體,37 ℃處理30 min。余下總RNA 提取根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)提供的步驟進(jìn)行。cDNA 的合成及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 定量分析參考試劑盒說(shuō)明書(shū)提供的步驟進(jìn)行。

        3.統(tǒng)計(jì)分析

        實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用GraphPad Prism 8.0 軟件作圖及進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,符合正態(tài)分布的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示;兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA);P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        結(jié)果

        1.白藜蘆醇MIC及最低殺菌濃度的測(cè)定

        采用96 孔板法檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)金黃色葡萄球菌SYN的抑菌活性,結(jié)果顯示,1 024 mg/L 白藜蘆醇濃度下的孔板溶液為澄清狀態(tài),濃度梯度8 mg/L 到512 mg/L 的孔板溶液為渾濁狀態(tài),結(jié)果表明白藜蘆醇對(duì)SYN 的MIC 為1 024 mg/L。

        2.白藜蘆醇的動(dòng)態(tài)抑菌曲線

        為測(cè)定不同濃度白藜蘆醇對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響,因此評(píng)估了1/2MIC(512 mg/L)、1/4MIC(256 mg/L)、1/8MIC(128 mg/L)濃度的白藜蘆醇對(duì)SYN 生長(zhǎng)和生存能力的影響,結(jié)果如圖1 所示,DMSO 對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)幾乎沒(méi)有影響,128 mg/L 白藜蘆醇作用下的菌株的生長(zhǎng)曲線基本與未加入藥物的對(duì)照組一致,隨著白藜蘆醇藥物濃度的增加,對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用也在增強(qiáng)。后續(xù)研究亞抑菌濃度白藜蘆醇對(duì)金黃色葡萄球菌SYN生物被膜形成的影響選擇128 mg/L的白藜蘆醇處理細(xì)菌。

        圖1 不同亞抑菌濃度白藜蘆醇下金黃色葡萄球菌SYN的生長(zhǎng)曲線

        3.不同濃度白藜蘆醇對(duì)生物被膜形成的影響

        通過(guò)微量稀釋法和結(jié)晶紫染色法檢測(cè)2~512 mg/L 白藜蘆醇對(duì)SYN 生物被膜形成的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2 所示,白藜蘆醇可以顯著增強(qiáng)SYN生物被膜的形成,且呈濃度依賴性,濃度越高,生物被膜形成量越多。

        圖2 白藜蘆醇對(duì)SYN 菌株生物被膜的增強(qiáng)作用。A:不同濃度白藜蘆醇對(duì)SYN 菌株生物被膜影響的吸光度值;B:不同濃度白藜蘆醇對(duì)SYN菌株生物被膜的結(jié)晶紫染色

        4.亞抑菌濃度白藜蘆醇對(duì)胞外多糖生成及eDNA 釋放的影響

        胞外多糖是生物被膜EPS 中最主要的成分,通過(guò)苯酚濃硫酸法測(cè)定亞抑菌濃度白藜蘆醇對(duì)SYN 胞外多糖的影響。亞抑菌濃度白藜蘆醇可促進(jìn)SYN 中的胞外多糖生成。生物被膜形成過(guò)程中,膜內(nèi)死亡的細(xì)菌會(huì)釋放eDNA,eDNA對(duì)細(xì)菌附著于載體表面及細(xì)菌之間的黏附起重要作用。結(jié)果如圖3 所示,與對(duì)照組相比,亞抑菌濃度白藜蘆醇可以增強(qiáng)eDNA釋放。

        圖3 亞抑菌濃度白藜蘆醇對(duì)SYN菌株生物被膜的影響。A:亞抑菌濃度白藜蘆醇對(duì)胞外多糖生成的影響;B:亞抑菌濃度白藜蘆醇對(duì)eDNA釋放的影響

        5.qRT-PCR 檢測(cè)亞抑菌濃度白藜蘆醇對(duì)生物被膜相關(guān)基因表達(dá)量的影響

        我們測(cè)定了亞抑菌濃度白藜蘆醇作用下生物被膜相關(guān)基因的差異表達(dá),結(jié)果如圖4 所示。亞抑菌濃度白藜蘆醇作用下icaA、fnbA、clfA表達(dá)水平無(wú)明顯差異,但是saeR、saeS、nuc、lrgA表達(dá)水平顯著降低。

        圖4 亞抑菌濃度白藜蘆醇對(duì)SYN菌株生物被膜形成和調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)的影響

        討論

        細(xì)菌生物被膜是細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中為適應(yīng)生存環(huán)境的變化而附著于生物或非生物表面而形成的一種由自身產(chǎn)生的胞外聚合物及基質(zhì)網(wǎng)包裹的有三維結(jié)構(gòu)的菌細(xì)胞群體[6]。金黃色葡萄球菌形成生物被膜的能力是其引起復(fù)合型感染的重要特征,尤其是導(dǎo)管和移植物相關(guān)的體外材料[6]。生物被膜的生長(zhǎng)使得細(xì)菌在醫(yī)院環(huán)境中和宿主感染時(shí)更好地存活,是導(dǎo)致金黃色葡萄球菌反復(fù)感染,難以治療的重要原因之一[6]。金黃色葡萄球菌生物被膜由復(fù)雜的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)組成,包括PIA、eDNA和蛋白質(zhì)[17]。

        白藜蘆醇具有多種生物活性,包括抗癌活性、免疫調(diào)節(jié)、預(yù)防心血管疾病、抗氧化、抗病毒作用及抗菌活性[13]。白藜蘆醇對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抗菌活性大于對(duì)革蘭氏陰性菌的抗菌活性[14]。本研究中,我們發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可顯著增強(qiáng)金黃色葡萄球菌生物被膜的形成,并且隨著藥物濃度的增加,生物被膜形成能力增強(qiáng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇通過(guò)增加eDNA 釋放來(lái)誘導(dǎo)生物被膜的形成。Whitchurch等[17]首次在銅綠假單胞菌中研究了eDNA 在生物被膜形成中的作用。eDNA 在細(xì)菌生物被膜的形成、粘附和穩(wěn)定性中起著關(guān)鍵作用[18]。金黃色葡萄球菌eDNA 形成過(guò)程中涉及的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)十分復(fù)雜,金黃色葡萄球菌穿孔素CidA、抗穿孔素LrgAB、自溶酶Yycl 等參與eDNA 的釋放,雙組分系統(tǒng)(Agr、SaeRS、WalKR、SrrAB)和全局調(diào)節(jié)因子(SigB、SarA、MgrA)也直接和/或間接調(diào)節(jié)eDNA 的釋放[16]。金黃色葡萄球菌SaePQRS 調(diào)控系統(tǒng)由組氨酸激酶SaeS、應(yīng)答調(diào)節(jié)因子SaeR、膜蛋白SaeP 和脂蛋白SaeQ 組成[19]。SaeRS 調(diào)控溶血素、白細(xì)胞殺傷素、蛋白酶、核酸酶和纖連蛋白結(jié)合蛋白等多種毒力因子的表達(dá)。金黃色葡萄球菌eDNA 可由耐熱核酸酶降解,編碼耐熱核酸酶的基因nuc突變后,金黃色葡萄球菌生物被膜形成能力增強(qiáng)[20]。nuc基因的表達(dá)受SaePQRS 調(diào)控系統(tǒng)的調(diào)控,在SaeRS 敲除菌株中,nuc基因的表達(dá)水平明顯下降。EMSA 實(shí)驗(yàn)證明。SaeR 能直接與nuc啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合,從而正調(diào)控nuc的表達(dá)[21]。研究顯示,亞抑菌濃度白藜蘆醇作用下,金黃色葡萄球菌lrgA、saeR表達(dá)顯著下調(diào),且saeR基因在不同亞抑菌濃度白藜蘆醇作用下受到抑制,并且隨著藥物濃度的增加,抑制能力增強(qiáng)[13]。細(xì)胞裂解和DNA 釋放在生物被膜發(fā)育的初始階段對(duì)生物被膜附著至關(guān)重要,并且eDNA在生物被膜成熟過(guò)程中仍然是重要的基質(zhì)成分。金黃色葡萄球菌抗穿孔素lrgAB操縱子由2個(gè)共轉(zhuǎn)錄的基因lrgA和lrgB組成。LrgA可以抑制細(xì)菌水解酶,減少eDNA 的釋放,從而抑制生物被膜的形成。LrgAB基因突變可增加的生物被膜粘附性和基質(zhì)相關(guān)的eDNA[22]。本研究顯示,在亞抑菌濃度白藜蘆醇作用下,saeR、saeS以及l(fā)rgA基因表達(dá)顯著下調(diào),與文獻(xiàn)研究一致。同時(shí),受SaeRS 調(diào)控的nuc基因表達(dá)也顯著性下調(diào),而這些結(jié)果提示,白藜蘆醇可能通過(guò)下調(diào)SaeRS 進(jìn)而導(dǎo)致nuc的低表達(dá),同時(shí)lrgA的低表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞裂解和eDNA釋放加速,進(jìn)一步增強(qiáng)生物被膜的形成。

        總之,本研究表明,白藜蘆醇可能通過(guò)抑制二元調(diào)控系統(tǒng)SaeRS 降低耐熱核酸酶的表達(dá)以及降低LrgA 的水平,從而增加eDNA的釋放,強(qiáng)烈促進(jìn)金黃色葡萄球菌生物被膜的產(chǎn)生。這提示白藜蘆醇應(yīng)用于臨床,可能會(huì)促進(jìn)金黃色葡萄球菌慢性持續(xù)性感染的風(fēng)險(xiǎn)。

        利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

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