史國(guó)英 曾泉 葉雪蓮 馬明亮 胡春錦

摘要：【目的】篩選對(duì)甘蔗葉有降解效果的細(xì)菌菌株，為其在蔗葉還田中的應(yīng)用及甘蔗葉田間高效生物腐解劑和纖維素酶制劑產(chǎn)品的研發(fā)提供參考?！痉椒ā坑靡愿收崛~粉為唯一碳源的培養(yǎng)基對(duì)田間腐解甘蔗葉樣品中的降解菌進(jìn)行富集，通過(guò)剛果紅培養(yǎng)基初篩和羧甲基纖維素酶（CMCase）活性測(cè)定復(fù)篩纖維素降解菌，結(jié)合形態(tài)特征和16S rDNA序列分析，明確篩選菌株的系統(tǒng)分類地位；分析經(jīng)菌株發(fā)酵處理后甘蔗葉的失重率，利用透射電鏡和掃描電鏡觀察甘蔗葉超微組織結(jié)構(gòu)變化，明確菌株對(duì)甘蔗葉的降解效果?！窘Y(jié)果】經(jīng)過(guò)初篩和復(fù)篩，獲得1株高效產(chǎn)CMCase菌株XW005，其纖維素酶活力為80.51 U/mL，經(jīng)16S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育分析，將XW005菌株鑒定為Brucella intermedia細(xì)菌（NCBI登錄號(hào)：MW538324.1）。電鏡觀察甘蔗葉顯微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)菌株發(fā)酵處理的甘蔗葉表皮層開(kāi)裂，維管束和質(zhì)膜解體，受損的葉片呈疏松狀態(tài)，平坦表面受到破壞，致密結(jié)構(gòu)變得松散。甘蔗葉降解試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵處理20 d后，菌株處理的甘蔗葉失重率達(dá)45.09%?！窘Y(jié)論】菌株XW005是1株具有降解纖維素能力的細(xì)菌，在常溫條件下可對(duì)甘蔗葉進(jìn)行有效降解，具有潛在的開(kāi)發(fā)價(jià)值和良好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：甘蔗葉；纖維素降解菌；Brucella intermedia；組織微結(jié)構(gòu)

中圖分類號(hào)：S646.099? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2023）02-0488-09

Abstract：【Objective】To screen bacteria with degradation effects on sugarcane leaves， and to provide reference for application of bacteria in sugarcane leaf returning and development of efficient biological decomposition agents and cellulase preparation products for sugarcane leaf in field. 【Method】Medium with sugarcane leaf powder as the only carbon source was used to enrich cellulose-degrading bacteria of sugarcane leaf decomposition in field. Cellulose-degrading bacteria were preliminarily screened using Congo red medium and rescreened via determination of carboxymethyl cellulose（CMCase） activity， and according to analysis of morphological characteristics and 16S rDNA sequences， systematic taxonomic classification position of the screened bacteria were made clear. Weight loss rate of sugarcane leaves after fermentation treatment was analyzed and transmission electron microscope and scanning electron microscope were used to observe the change of sugarcane leaf ultrastructure， so as to make clear effects of the strain on sugarcane leaf degradation. 【Result】Through preliminary screening and rescreening， a strain of CMCase-producing strain XW005 with cellulase activity of 80.51 U/mL was obtained. According to analysis of 16S rDNA gene sequence and phylogenetic analysis， XW005 strain was identified as bacterium Brucella intermedia（NCBI accession number： MW538324.1）. Electron microscopic observation of sugarcane leaf microstructure showed that epidermis of sugarcane leaves under fermentation treatment of the strain cracked， while vascular bundles and plasma membrane disintegrated， the damaged leaves were loosened， the flat surface was destroyed， and the dense structure became loose. The results of sugarcane leaf degradation test showed that after 20 d of fermentation treatment， the weight loss rate of sugarcane leaves under the strain treatment reached 45.09%. 【Conclusion】XW005 is a bacterium capable of degrading cellulose and it can effectively degrade sugarcane leaves at room tempera-ture，which has potential of development and prospect for application.

Key words： sugarcane leaf； cellulose-degrading bacterium； Brucella intermedia； tissue microstructure

Foundation items：Guangxi Natural Science Foundation（2020GXNSFAA297096）；Guangxi Science and Technology Plan Project（Guike AB18221048）；Basic Research Project of Guangxi Academy of Agricultural Science（Guinongke 2021JM89，Guinongke 2021YT098）

0 引言

【研究意義】甘蔗作為制糖業(yè)的主要原料，廣泛種植于我國(guó)廣東、廣西、云南、海南等熱帶亞熱帶地區(qū)。甘蔗為宿根多年生作物，生長(zhǎng)期長(zhǎng)，需肥量大，長(zhǎng)期連作會(huì)消耗大量土壤養(yǎng)分，對(duì)地力的消耗高于其他作物，甚至引起營(yíng)養(yǎng)元素失調(diào)（樊仙等，2014）。單一依賴化肥補(bǔ)償土壤地力難以有效解決問(wèn)題，還會(huì)造成甘蔗種植成本上升、蔗區(qū)土壤質(zhì)量下降等一系列問(wèn)題。研究表明，甘蔗葉中含有大量的碳、氮、磷、鉀及微量元素，是一種數(shù)量多、可就地利用的優(yōu)質(zhì)有機(jī)肥源，蔗葉還田能改善土壤理化性狀、保持土壤生產(chǎn)力，同時(shí)又能提高土壤微生物物種總數(shù)和群落多樣性（趙麗萍，2014；張才芳，2019）。蔗葉還田是當(dāng)前集約化、機(jī)械化生產(chǎn)的甘蔗產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然選擇。然而，由于甘蔗葉含有大量的纖維素，在田間自然條件下很難降解。2016年之前，甘蔗葉大多在采收后直接進(jìn)行焚燒處理。近年來(lái)，隨著國(guó)家對(duì)環(huán)境保護(hù)的重視，已嚴(yán)禁進(jìn)行秸稈焚燒。目前，每年有大量甘蔗葉棄于田間地頭，不僅造成資源浪費(fèi)，而且由于甘蔗葉在田間降解速度緩慢，不及時(shí)處理會(huì)嚴(yán)重影響新植蔗的耕整地、開(kāi)溝和宿根蔗的破壟松蔸、培土等后續(xù)作業(yè)（樊保寧等，2020；葛暢等，2020）。篩選獲得具有較好環(huán)境適應(yīng)性的高效秸稈降解菌是利用外源微生物促進(jìn)秸稈原位腐化的關(guān)鍵。從添加外源微生物促進(jìn)甘蔗葉原位腐解角度篩選適合的甘蔗葉降解菌，開(kāi)發(fā)新型甘蔗葉降解菌劑，促進(jìn)甘蔗葉原位腐解，對(duì)我國(guó)糖料甘蔗葉的有效處理與利用及促進(jìn)蔗糖產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來(lái)，研究人員已陸續(xù)分離得到一些對(duì)秸稈具有降解能力的微生物，包括細(xì)菌、真菌和放線菌。由于細(xì)菌繁殖快、發(fā)酵周期短，關(guān)于纖維素降解菌的研究已引起較多關(guān)注（李冠杰等，2015；賈輝等，2016）。自然界中廣泛存在纖維素降解菌，特別是在一些降解菌較活躍的特定環(huán)境中，可分離獲得能高效降解纖維素的微生物，如從腐爛秸稈、食草動(dòng)物糞便、蚯蚓腸道及特定作物秸稈（胡海紅等，2016；張?zhí)N琦等，2017；王麗萍等，2018）、特定環(huán)境（王旭輝等，2017）和特定溫度（黃亞麗等，2020；江高飛等，2020）中篩選獲得纖維素降解菌。研究表明，添加外源微生物有利于縮短秸稈發(fā)酵時(shí)間。曲繼松等（2019）研究表明，向枸杞枝條粉添加粗纖維降解菌、鋸末專用復(fù)合益菌后，枸杞枝條粉堆體整體溫度提升，在發(fā)酵周期內(nèi)，其堆體內(nèi)部溫度超過(guò)50 ℃的時(shí)間達(dá)9 d，有助于加快基質(zhì)化進(jìn)程、縮短發(fā)酵時(shí)間、提高發(fā)酵效率。宋春麗（2019）研究發(fā)現(xiàn)，添加微生物菌劑能顯著提高蔬菜廢棄物堆肥溫度、延長(zhǎng)堆肥高溫時(shí)間、加快有機(jī)物質(zhì)分解、縮短堆肥發(fā)酵周期，添加微生物菌劑處理比未添加微生物菌劑處理完成發(fā)酵的時(shí)間縮短13 d；同時(shí)添加微生物菌劑可促進(jìn)堆肥腐熟，降低堆肥產(chǎn)品對(duì)植物發(fā)芽和生長(zhǎng)的不良影響。李雯等（2020）研究表明，玉米秸稈中添加纖維素降解菌X11-1（Luteimonas sp.）菌株，堆肥腐熟時(shí)間可提前5 d；Wang等（2022）研究發(fā)現(xiàn)，外源纖維素降解菌（ECDB）作為生物活性劑可促進(jìn)玉米秸稈和牛糞混合堆肥中腐殖質(zhì)的形成，提高玉米秸稈堆肥的效率和質(zhì)量?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前已報(bào)道具有產(chǎn)纖維素酶活性的細(xì)菌種屬較多（臧超群等，2018；Surachaia et al.，2020；Danso et al.，2021；Mohammadipour et al.，2021），但可培養(yǎng)秸稈降解菌種類不多，尤其是適合甘蔗葉腐解的功能菌鮮見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】用以甘蔗葉粉為唯一碳源的培養(yǎng)基對(duì)田間腐解甘蔗葉樣品中的降解菌進(jìn)行富集，通過(guò)剛果紅培養(yǎng)基初篩和羧甲基纖維素酶（CMCase）活性測(cè)定復(fù)篩纖維素降解菌，結(jié)合形態(tài)特征和16S rDNA序列分析，明確篩選菌株的系統(tǒng)分類地位；分析經(jīng)菌株發(fā)酵處理后甘蔗葉的失重率，電鏡觀察甘蔗葉超微組織結(jié)構(gòu)變化，明確菌株對(duì)甘蔗葉的降解效果，為其在蔗葉還田中的應(yīng)用及甘蔗葉田間高效生物腐解劑和纖維素酶制劑產(chǎn)品的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

樣品來(lái)源：采集田間堆積腐爛的甘蔗葉裝入封口袋中，封口，冷藏備用。

主要培養(yǎng)基：（1）纖維素降解菌富集培養(yǎng)基：K2HPO4 2.0 g，（NH4）2SO4 1.4 g，MgSO2·7H2O 0.3 g，CaCl2·2H2O 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 5.0 mg，MnSO4·H2O 1.6 mg，ZnSO4 1.7 mg，甘蔗葉粉（過(guò)40目篩）2%，蒸餾水1000 mL；（2）甘蔗葉發(fā)酵培養(yǎng)基：去掉上述富集培養(yǎng)基中的蔗葉粉，加入尿素0.3 g/L，分裝成150 mL/瓶，每瓶加入于80 ℃烘干至恒重的2～3 cm長(zhǎng)蔗葉段5 g；（3）剛果紅培養(yǎng)基、細(xì)菌純化培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基參考馬欣雨等（2020）的方法配制。

主要試劑：（NH4）2SO4、MgSO4·7H2O、K2HPO4、NaCl、CMC-Na、剛果紅、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、ZnSO4和Tween-80（v/v）購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠；DNS試劑、瓊脂、蛋白胨和酵母提取物購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；DNA提取試劑盒及PCR反應(yīng)試劑購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

主要儀器設(shè)備：PCR儀（北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司）、全溫振蕩培養(yǎng)箱（上海知楚儀器有限公司）、紫外分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）、數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司）、H1850R 臺(tái)式冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 纖維素降解菌的富集培養(yǎng) 稱取10 g樣品，加入到裝有100 mL富集培養(yǎng)基的三角瓶中，于28 ℃、180 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)5 d。吸取10 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至新的富集培養(yǎng)基中繼續(xù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，重復(fù)以上操作，富集培養(yǎng)3代，進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1. 2. 2 纖維素降解菌的初步篩選 量取1 mL第3代富集液加入9 mL滅菌水，連續(xù)稀釋3次，取第3次的稀釋液100 μL在剛果紅纖維素培養(yǎng)基中涂布，于28 ℃下培養(yǎng)7 d，觀察透明圈的有無(wú)及大小，將有明顯透明圈的菌株接種到新的剛果紅纖維素培養(yǎng)基上，連續(xù)點(diǎn)接純化獲得純培養(yǎng)。用游標(biāo)卡尺準(zhǔn)確測(cè)定菌落直徑（d）和透明圈直徑（D），同時(shí)計(jì)算透明圈直徑與菌落直徑的比值（D/d）。選取D/d較大的菌株劃線純化4～5代后保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 3 菌株復(fù)篩 將初篩得到的菌株接種至20 mL種子培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min培養(yǎng)18 h，制成種子液。取1 mL種子液接入100 mL產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min培養(yǎng)3 d，于4 ℃、5000 r/min條件下離心20 min，取上清液測(cè)定纖維素酶活性。纖維素酶活性的測(cè)定采用DNS法，以每分鐘從底物溶液中分解產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量為1個(gè)酶活性單位（U）。

羧甲基纖維素酶（CMCase）測(cè)定：0.5 mL粗酶液與含1% CMC-Na的醋酸緩沖液（pH 4.8，0.1 mol/L）1.5 mL，放入≥25 mL刻度試管中，經(jīng)50 ℃恒溫水浴 30 min后，立即加入DNS 3 mL終止反應(yīng)。隨后將處理過(guò)的樣品煮沸5 min，冷卻至顏色穩(wěn)定，加入去離子水或蒸餾水至25 mL，540 nm處測(cè)定吸光值。記錄數(shù)據(jù)，計(jì)算纖維素酶活性。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：稱取100 mg分析純無(wú)水葡萄糖，定容至100 mL。分別吸取上述溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4 mL于干燥刻度試管中，補(bǔ)加蒸餾水至2.0 mL，再加3.0 mL DNS試劑，煮沸5 min后冷卻，并定容至25 mL，540 nm處測(cè)定吸光值。以葡萄糖含量（mg）為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.6963x-0.0224（R?=0.9991）。

1. 2. 4 菌株鑒定 菌株培養(yǎng)性狀及菌落形態(tài)觀察：以平板劃線法將篩選菌株培養(yǎng)于NA培養(yǎng)基上，置于28 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。觀察并記錄菌落的顏色、大小、形狀。

菌株的16S rDNA序列分析：16S rDNA序列的擴(kuò)增采用菌落PCR方法，培養(yǎng)供試菌株24 h，挑取少許菌落作為PCR模板。利用已報(bào)道16S rDNA序列通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3'），1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）進(jìn)行擴(kuò)增；擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序及菌株系統(tǒng)發(fā)育分析參照史國(guó)英等（2019）的方法進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，并用MEGA 7.0構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，確定菌株的種屬。

1. 2. 5 菌株對(duì)甘蔗葉的降解特性及降解能力測(cè)定 將篩選菌株接種至LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，按1%接種量接種到發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)液中，在恒溫?fù)u床上震蕩培養(yǎng)72 h后，按2%接菌量將篩選菌株的菌液轉(zhuǎn)接到甘蔗葉發(fā)酵培養(yǎng)液中，以加入未接菌的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)液為對(duì)照，每處理15瓶，28 ℃、150 r/min培養(yǎng)20 d。

甘蔗葉組織微結(jié)構(gòu)觀察：發(fā)酵第20 d時(shí)各處理隨機(jī)取1瓶，選取有代表性的葉片進(jìn)行微結(jié)構(gòu)觀察。參照滕堯等（2018）的方法制作石蠟切片，采用LEICA-DMLB型多功能生物顯微鏡觀察和拍照，顯微照片采用CaseViewer 2.4進(jìn)行分析、標(biāo)注；參照劉愷等（2020）的方法制備掃描電鏡樣品，采用HITACHI掃描電子顯微鏡觀察和拍照采圖。每處理樣本組織采集3小塊，制備20個(gè)切片。

甘蔗葉失重率測(cè)定：蔗葉降解過(guò)程中，每隔5 d取樣（每處理隨機(jī)取3瓶），分別用雙層紗布過(guò)濾后于80 °C烘至恒重，稱量后計(jì)算失重率。失重率（%）=（處理組蔗葉干重-對(duì)照組蔗葉干重）/對(duì)照組蔗葉干重×100。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2003和DPS 9.50進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 纖維素降解菌初篩結(jié)果

通過(guò)富集培養(yǎng)、剛果紅平板染色法初篩和菌株純化，得到8株具有明顯透明圈的菌株，分別命名為XW001～XW008，測(cè)定菌株的菌落直徑（d）及其對(duì)應(yīng)的透明圈直徑（D），D/d比值在3.56～4.98（圖1）。D/d比值可反映菌株纖維素酶活性的高低，比值越大，纖維素酶活性越高，菌株的纖維素降解能力越強(qiáng)。根據(jù)初步篩選結(jié)果，選擇D/d比值較高的4株細(xì)菌XW001、XW002、XW005和XW007進(jìn)行復(fù)篩試驗(yàn)。

2. 2 復(fù)篩菌株纖維素酶活性比較

進(jìn)一步的復(fù)篩試驗(yàn)中，測(cè)定菌株XW001、XW002、XW005和XW007的纖維素酶活力，結(jié)果（圖2）表明，XW005菌株的纖維素酶活性最高，達(dá)80.51 U/mL，與其他菌株的纖維素酶活性差異極顯著（P<0.01），顯示出良好的應(yīng)用潛力。

2. 3 篩選菌株的分類鑒定結(jié)果

2. 3. 1 菌落培養(yǎng)性狀 菌落的培養(yǎng)性狀見(jiàn)圖3。菌株XW005在NA固體培養(yǎng)基上的菌落呈乳白色、圓形、光滑凸起、邊緣整齊、不產(chǎn)色素。

2. 3. 2 菌株XW005的16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系 將菌株XW005的16S rDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行在線同源比對(duì)，結(jié)果顯示，該菌株與多株Brucella intermedia細(xì)菌的相似性在99%～100%。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)結(jié)果（圖4）顯示，菌株XW005與已報(bào)道的B. intermedia（MK249656.1）自成一個(gè)分支，表明這2個(gè)菌株的親緣關(guān)系最近。因此，將菌株XW005鑒定為B. intermedia細(xì)菌（NCBI登錄號(hào)：MW538324.1）。

2. 4 篩選菌株對(duì)甘蔗葉的降解效果

通過(guò)掃描電鏡觀察甘蔗葉腐解的表面形態(tài)變化，結(jié)果顯示，未接菌對(duì)照處理的甘蔗葉，其表面結(jié)構(gòu)的蠟質(zhì)層光滑規(guī)則，平整且致密，甘蔗葉結(jié)構(gòu)較完整，緊密相連，纖維束均勻且伸展（圖5-A、圖5-B和圖5-C），表皮層未受破壞，組織結(jié)構(gòu)完整（圖5-D）；經(jīng)菌株XW005處理后，甘蔗葉表皮出現(xiàn)分解孔洞，進(jìn)而形成裂紋（圖5-E），破壞嚴(yán)重的部位維管束解體成絲狀結(jié)構(gòu)，總體出現(xiàn)蓬松化（圖5-F和圖5-G），石蠟切片可觀察到葉片的表皮細(xì)胞破裂，組織被破壞消解，呈松弛狀態(tài)（圖5-H）。

甘蔗葉發(fā)酵過(guò)程中每隔5 d采樣1次，對(duì)比不同發(fā)酵時(shí)間的腐解情況，發(fā)現(xiàn)甘蔗葉先從四周切面處開(kāi)始腐解，然后逐漸向葉片中間擴(kuò)展，最后將整段葉片腐解成粉末狀（圖6）。測(cè)定發(fā)酵5～20 d的甘蔗葉失重率，結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，甘蔗葉失重率呈逐漸上升趨勢(shì)；發(fā)酵至第20 d時(shí)，XW005菌株處理的甘蔗葉失重率達(dá)45.09%（圖7）。

3 討論

產(chǎn)纖維素酶菌株在自然界中分布廣泛，利用選擇性培養(yǎng)基對(duì)纖維素降解菌進(jìn)行富集是篩選特定作物秸稈纖維降解微生物的常用方法。雷湘蘭等（2017）以椰糠作為唯一碳源，從紅樹(shù)林土壤中分離出1株高產(chǎn)纖維素酶菌株，該菌株對(duì)椰糠的降解率達(dá)39.88%；張?zhí)N琦等（2017）利用濾紙和水稻秸稈?cǎi)Z化出對(duì)濾紙纖維素和水稻秸稈纖維素均有較強(qiáng)降解能力的優(yōu)勢(shì)菌群，該菌群培養(yǎng)7 d時(shí)水稻秸稈的失重率達(dá)39.3%；孫美娜等（2018）以棉花秸稈為唯一碳源ISAM固體培養(yǎng)基對(duì)棉花秸稈纖維素降解菌菌株進(jìn)行篩選，獲得4株高效纖維素降解菌株，將篩選菌株接種到新鮮棉花秸稈進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)25 d的棉花秸稈失重率最高可達(dá)52.52%。為獲得針對(duì)甘蔗葉有較強(qiáng)降解功能的菌株，本研究借鑒前人研究經(jīng)驗(yàn)，選擇以甘蔗葉為唯一碳源的培養(yǎng)基富集篩選纖維素降解菌，通過(guò)羧甲基纖維素—?jiǎng)偣t染色法及DNS法對(duì)菌株產(chǎn)CMCase能力進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，有效提高了甘蔗葉纖維素降解菌的篩選效率；從腐爛的甘蔗葉中分離獲得了具有產(chǎn)纖維素酶活性的Brucella屬細(xì)菌菌株XW005，該菌株在28 ℃條件下產(chǎn)纖維素酶活性達(dá)80.51 U/mL。本研究結(jié)果進(jìn)一步豐富了產(chǎn)纖維素細(xì)菌的菌種資源，同時(shí)為蔗葉還田提供了具有潛在應(yīng)用前景的優(yōu)良菌株。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外已有一些關(guān)于Brucella屬細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶特性的相關(guān)報(bào)道，如Behera等（2016）從印度馬哈納迪河三角洲的紅樹(shù)林土壤中分離出1株產(chǎn)纖維素酶Brucella屬細(xì)菌，該菌株在以麥芽糖為碳源、酵母抽提物為氮源，發(fā)酵溫度35 ℃下產(chǎn)酶活性為96.37 U/mL；Li等（2021）從新疆4種鹽生植物中分離獲得4株Brucella屬細(xì)菌，其中有3株具有產(chǎn)纖維素酶活性；此外，有研究結(jié)果表明Brucella屬細(xì)菌菌株P(guān)S4可降解樂(lè)果，同時(shí)促進(jìn)植物在逆境和有利條件下生長(zhǎng)（Ahmad et al.，2022）。然而，由于Brucella屬細(xì)菌個(gè)別種是條件致病菌，可能會(huì)引發(fā)人類和動(dòng)物疾病（顧曉英，2017；Guzmán-Verri et al.，2019），因此，對(duì)Brucella屬細(xì)菌在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用還需保留謹(jǐn)慎態(tài)度。本研究獲得的菌株XW005雖來(lái)源于甘蔗田間，但若要將菌株做為活體菌劑或含有活菌的微生態(tài)制劑直接應(yīng)用，除要進(jìn)一步驗(yàn)證菌株在田間對(duì)甘蔗葉的實(shí)際腐解效果外，還需對(duì)其環(huán)境安全性進(jìn)行充分評(píng)價(jià)。

組織微結(jié)構(gòu)觀察可較直觀地反映菌株對(duì)秸稈的腐解情況，從而判斷其降解能力。本研究結(jié)果表明，接種XW005發(fā)酵液后，甘蔗葉由邊緣開(kāi)始腐解，結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，整體呈現(xiàn)斷裂狀的碎片狀態(tài)且結(jié)構(gòu)變得更加纖細(xì)化，出現(xiàn)大量條狀裂紋，其腐解狀態(tài)與李凌波等（2022）觀察的綠色木霉對(duì)油菜秸稈腐解過(guò)程相似，區(qū)別在于真菌對(duì)秸稈的腐解過(guò)程中菌絲體進(jìn)入秸稈組織內(nèi)部，加大與秸稈的接觸面，加劇秸稈斷裂，加快秸稈腐解（樸哲等，2011；孫玲，2018）。XW005菌株的作用破壞了甘蔗葉表面最初的完整結(jié)構(gòu)，形成一些小孔，凹陷的小孔表明細(xì)菌可水解秸稈并破壞其表面結(jié)構(gòu)。馬玲玲（2020）研究發(fā)現(xiàn)小麥秸稈在經(jīng)過(guò)細(xì)菌預(yù)處理后，麥稈的表皮觀察到類似現(xiàn)象。有研究表明，細(xì)菌進(jìn)入秸稈組織后需氧細(xì)菌如嗜纖維菌（Cytophaga hutchinsonii）主要通過(guò)分泌單獨(dú)的纖維素酶降解纖維素，而厭氧細(xì)菌如一些瘤胃細(xì)菌和熱纖維梭菌（Clostridiumthermo cellum）通過(guò)產(chǎn)生纖維素多酶復(fù)合物降解纖維素（Wilson，2008）。本研究中，通過(guò)掃描電鏡觀察到甘蔗葉表面的結(jié)構(gòu)變化，證明了菌株對(duì)甘蔗葉的降解作用，表明該菌株在甘蔗葉降解方面具有一定的研究開(kāi)發(fā)潛力。由于甘蔗的收獲季節(jié)氣溫偏低，后期將會(huì)進(jìn)一步對(duì)XW005菌株在15～20 ℃條件下對(duì)甘蔗葉的降解效果及降解甘蔗葉過(guò)程中的產(chǎn)酶特性、菌株的環(huán)境馴化等方面開(kāi)展研究，擬為菌株的實(shí)際應(yīng)用提供科學(xué)支持。

4 結(jié)論

本研究獲得的產(chǎn)纖維素酶菌株XW005來(lái)源于田間自然腐解的甘蔗葉，對(duì)蔗葉還田環(huán)境具有適應(yīng)性優(yōu)勢(shì)；此外，菌株在常溫條件下可對(duì)甘蔗葉進(jìn)行有效降解，在甘蔗葉田間高效生物腐解劑及纖維素酶制劑產(chǎn)品的研發(fā)上具有良好的應(yīng)用前景。

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（責(zé)任編輯 王 暉）