孫曉梅,王奕猛,徐 杰,毛秋彤,李明勛,藍賢勇

(1. 揚州大學 動物科學與技術學院,江蘇 揚州 225009;2. 西北農(nóng)林科技大學動物科技學院,陜西 楊凌 712100)

牛骨骼肌的生長發(fā)育及其遺傳特性直接決定了產(chǎn)肉率、肉品質和肉牛產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益。成肌細胞增殖分化是肌肉發(fā)育的關鍵環(huán)節(jié)[1],研究牛成肌細胞分化的調(diào)控機制對理解肌肉生長發(fā)育的生理基礎、肉牛的遺傳改良及進行精準的分子設計育種等具有重要的理論和實際意義。

肌細胞分化是由一系列轉錄因子參與的復雜而精細的程序化調(diào)控過程,受到眾多編碼基因、非編碼基因及其互作的調(diào)控[2-4]。研究顯示,長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)可在轉錄、翻譯和染色體水平等多層面調(diào)控基因表達[5-8],在骨骼肌發(fā)育過程中發(fā)揮著重要功能[9-13]。lncRNA可以通過順式作用或反式作用等方式作為支架分子、誘餌分子或指導分子靶向調(diào)控下游基因的表達[14-15]。前期研究鑒定到一個新的長鏈非編碼RNA lncMD,過表達和干擾試驗表明lncMD能夠顯著促進肌細胞分化[16]。利用UCSC基因組瀏覽器比對發(fā)現(xiàn),lncMD是miR-1的宿主基因,miR-1位于lncMD的第三外顯子區(qū)域,是一種在進化中高度保守的miRNA,在肌肉中特異性表達。據(jù)報道,配對盒基因7(paired box 7,Pax7)是miR-1的一個重要靶基因,miR-1可通過抑制Pax7的表達來調(diào)節(jié)肌衛(wèi)星細胞的生成[17]。miR-1還可以通過靶向調(diào)節(jié)細胞周期蛋白D1(CyclinD1),進而調(diào)控肌生成[18]。

lncMD與miR-1在基因組上的位置重疊會產(chǎn)生什么樣的調(diào)控關系以及l(fā)ncMD-miR-1下游的靶基因是什么等問題還有待深入研究。因此,本研究利用過表達、RNAi、雙熒光素酶報告系統(tǒng)和實時熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)等方法解析lncMD和miR-1的調(diào)控關系,確定牛肌細胞分化過程中miR-1的下游靶基因,解析lncMD對肌生成的調(diào)控作用,以期在牛肌肉發(fā)育的分子調(diào)控理論及應用方面取得重要進展,為肉牛的快速生長和優(yōu)質高效生產(chǎn)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)與誘導分化

采用膠原酶消化法培養(yǎng)牛原代肌細胞,具體步驟如下:無菌狀態(tài)下采集胎牛的背最長肌組織,將其置于含1%雙抗的無菌PBS中迅速帶回實驗室;用無菌剪刀剪成1 mm3小塊,放入50 mL離心管中;加入膠原酶Ⅰ消化,37 ℃水浴1.5 h,過濾并收集濾液; 1000 r/min離心5 min后去除上清液,收集沉淀;在DMEM完全培養(yǎng)基中重懸細胞,將細胞懸液接種到6 cm培養(yǎng)皿中;在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h,收集上層培養(yǎng)液于新的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng);鑒定后凍存?zhèn)溆没蜻M行細胞傳代。

誘導分化步驟:當細胞融合度達到約80%時,將生長培養(yǎng)基(DMEM高糖培養(yǎng)基、10% FBS)換為分化培養(yǎng)基(DMEM高糖培養(yǎng)基、2%馬血清),每天換一次細胞培養(yǎng)液。

1.2 雙熒光素酶活性檢測

1.3 載體構建

以骨骼肌的cDNA為模板,在lncMD序列的兩端分別引入Hind III和EcoR I酶切位點,擴增lncMD的全長,連接至pcDNA3.1+載體(Invitrogen, 上海),構建過表達載體pcDNA-lncMD。miR-1 mimics、miR-1 inhibitor、lncMD siRNA購自吉瑪生物(Genepharma,蘇州)。

1.4 RNA提取、cDNA合成及實時熒光定量PCR

根據(jù)操作說明,利用RNAiso Plus(TaKaRa,大連)提取細胞總RNA,NanoDrop 1000分光光度計檢測RNA質量。利用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa,大連)進行RNA反轉錄。在Bio-Rad CFX96實時熒光定量PCR儀上進行qRT-PCR反應。反應體系25 μL,包括12.5 μL SYBR Premix Ex Taq II,10 μM正向和反向引物,10 ng cDNA。反應程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s 40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCT方法計算基因表達水平[19]。利用Beacon Designer 8.12設計定量引物,引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物Table 1 Primers used for qRT-PCR

1.5 統(tǒng)計分析

利用GraphPad Prism 6進行數(shù)據(jù)處理及Student's t檢驗,數(shù)據(jù)表示方式為平均數(shù) ± 標準誤,P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 長鏈非編碼RNA lncMD促進miR-1的表達

序列分析顯示lncMD第三外顯子與miR-1在基因組上位置重疊(圖1A)。采集牛腎臟、小腸、肺、肝臟、脾臟、骨骼肌、脂肪和心臟等組織進行定量分析,結果發(fā)現(xiàn)miR-1與lncMD的組織表達譜相似,都僅在牛肌肉組織中表達,且均是骨骼肌中高表達,心肌中少量表達(圖1B)。

在牛原代肌細胞中分別過表達和干擾lncMD,收集細胞,qRT-PCR檢測miR-1的表達量,結果如圖1C、1D所示。過表達lncMD極顯著增加lncMD的表達量,而干擾載體可以極顯著降低lncMD的表達量,說明lncMD的過表達和干擾成功,可用于后續(xù)研究。由圖1C可知,過表達lncMD后,miR-1的表達量極顯著上升(P<0.001);而干擾lncMD導致miR-1表達顯著下調(diào)(P<0.05,圖1D),提示lncMD可以促進miR-1的表達。

圖1 lncMD調(diào)控miR-1的表達A.生物信息學分析lncMD和miR-1的基因組位置特征;B. lncMD和miR-1的組織表達譜;C. 過表達lncMD檢測對miR-1表達量的影響;D. 干擾lncMD的表達檢測對miR-1的影響。 *表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001。下同。Fig.1 lncMD regulates the expression of miR-1A. Bioinformatics analysis of the genomic location of lncMD and miR-1; B. The tissue expression profiles of lncMD and miR-1;C. The effect of overexpression of lncMD on the expression levels of miR-1;D. The effect of interference with lncMD expression on miR-1 expression. *means P<0.05, ** means P<0.01, *** means P<0.001. The same below.

2.2 牛miR-1和Pax7基因的靶向關系驗證

利用TargetScan在線預測miRNA靶基因,結果如圖2A所示,牛Pax7基因3'UTR區(qū)共存在4個miR-1的結合位點。利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)和定點突變技術,驗證牛miR-1與Pax7的靶向關系。由圖2B-E可知,和對照組相比,試驗組熒光素酶活性顯著下降,說明miR-1結合到Pax7上,導致螢火蟲熒光素酶基因表達受阻,螢火蟲熒光素酶與海參熒光素酶活性比值下調(diào);分別突變Pax7基因3'UTR區(qū)4個miR-1結合位點(M1-M4),轉染突變型Pax7-MT雙熒光素載體后,熒光素酶活性與對照組無顯著區(qū)別。這是由于突變miR-1結合位點,解除了miR-1對靶基因Pax7的抑制,進一步證明Pax7 3'UTR區(qū)存在4個miR-1的結合位點,其是miR-1的靶基因。

2.3 lncMD可通過miR-1-Pax7途徑促進肌分化

為進一步驗證miR-1和Pax7的靶向關系,在牛骨骼肌細胞中分別轉染miR-1 mimics、miR-1 inhibitor,檢測Pax7基因的表達量。結果發(fā)現(xiàn),miR-1表達量增加可以降低Pax7的表達量,而miR-1表達量降低能夠提高Pax7表達量,說明miR-1可以負調(diào)控Pax7表達(圖3)。綜合雙熒光素酶試驗結果,表明lncMD可以通過自身編碼miR-1,抑制靶基因Pax7的表達,進而促進成肌細胞分化(圖4)。

3 討 論

牛肉的產(chǎn)量和質量與肌纖維的數(shù)量和體積緊密相關,肌纖維數(shù)量和體積的變化即肌細胞的增殖分化過程。細胞的增殖分化能力直接決定了組織器官的形成及動物個體的生長發(fā)育狀況。長鏈非編碼RNA在細胞分化、個體發(fā)育、干細胞維持、能量代謝等生命活動中發(fā)揮關鍵的調(diào)控功能[20-21],它能在轉錄、轉錄后等水平調(diào)控基因表達,參與染色質重塑、X染色體失活、基因組印記、核內(nèi)運輸、細胞周期調(diào)控、選擇性剪接調(diào)控和mRNA穩(wěn)定性調(diào)控等多種重要的生命過程[5-6,22-23]。當前,已明確鑒定的lncRNA數(shù)目還在繼續(xù)增長,但大多數(shù)lncRNA的功能和作用機制尚未闡明。

成肌細胞分化的相關信號轉導途徑及分子調(diào)控機制是畜牧學領域的熱點問題之一,lncRNA對成肌細胞的增殖至關重要[24]。?；蚪M結構被逐步解析,一些與肌肉發(fā)育調(diào)控相關的重要非編碼RNA相繼被發(fā)現(xiàn)。雖然牛上關于lncRNA已有很多研究,然而功能清晰的lncRNA數(shù)量還有限[25-27]。前期研究報道lncMD在牛的肌肉組織中特異性表達,并且在肌細胞分化過程表達量逐步升高,能夠顯著促進牛成肌細胞的分化[16]。本研究通過組織表達譜分析發(fā)現(xiàn),miR-1與lncMD都僅在牛的骨骼肌和心肌中表達,這和已有報道m(xù)iR-1僅在牛肌肉組織中表達相一致[28]。

lncRNA與基因組位置鄰近的miRNA可能具有兩種作用機制,lncRNA可以通過調(diào)控鄰近miRNA發(fā)揮功能,如miR-15a/16-1簇的表達受宿主基因lncRNA DLEU2啟動子的調(diào)控[29];在人和小鼠的成肌細胞中,沉默lncRNA H19導致其自身編碼的miR-675-3p和miR-675-5p表達量相應降低,H19通過miR-675-3p和miR-675-5p促進骨骼肌的分化和再生[30]。該作用機制與本研究中l(wèi)ncMD與miR-1的作用機制一致。lncRNA還可能與miRNA獨立轉錄,分別行使功能:如lncRNA MIR100HG是miR-100的宿主基因,在人的U2OS細胞系中,敲除MIR100HG導致細胞周期異常,但卻不改變miR-100表達[31];lncRNA lnc-31的第三外顯子與miR-31在基因組上位置重疊,lnc-31調(diào)控肌細胞增殖并不依賴于miR-31[32],兩者并無調(diào)控關系。本文進一步結合過表達、干擾試驗發(fā)現(xiàn),lncMD可以通過自身編碼miR-1促進牛成肌細胞分化。

圖2 雙熒光報告載體驗證miR-1和Pax7的靶向關系A. 在線預測miR-1和Pax7的結合位點。M1-M4分別代表Pax7基因的3' UTR區(qū)4個的miR-1結合位點的突變序列;B-E. HEK293T細胞中轉染miR-1 mimics和雙熒光素報告載體,48 h后檢測熒光活性Fig.2 The relationship between miR-1 and Pax7 verified by dual fluorescent reporter systemA. Online prediction of the binding sites of miR-1 and Pax7. M1-M4 respectively represent the mutated sequences of four miR-1 binding sites in the 3' UTR region of the Pax7 gene; B-E. HEK293T cells were transfected with miR-1 mimics and dual fluorescein reporter vectors, and after 48 hours, the fluorescence activity was detected

圖3 牛miR-1顯著抑制靶基因Pax7的表達 牛骨骼肌細胞中轉染miR-1 mimics(A)、miR-1 inhibitor(B) 后檢測靶基因Pax7表達量Fig.3 Bovine miR-1 significantly inhibits the expression of its target gene Pax7 After transfection of miR-1 mimics (A) or miR-1 inhibitor (B) into primary cultured bovine skeletal muscle cells, the expression level of the target gene Pax7 was detected, respectively

圖4 lncMD-miR-1-Pax7調(diào)控通路在促進 牛成肌細胞分化中的作用模式Fig.4 Model of the lncMD-miR-1-Pax7 pathway in promoting bovine muscle differentiation

此外,通過在線預測、雙熒光素報告系統(tǒng)結合定點突變技術發(fā)現(xiàn),牛Pax7基因是lncMD-miR-1促進肌分化過程的下游靶基因,與已有報道牛Pax7和HDAC4基因是miR-1的靶基因一致[33],而且Pax7基因在肌細胞增殖、分化及肌營養(yǎng)不良等方面發(fā)揮重要功能[34-35],這進一步證明本研究結果的可信性。本文以lncMD為研究對象全面開展分子機制研究,從lncMD-miR-1-靶基因互作的角度,解析lncMD調(diào)控牛肌肉生成的調(diào)控網(wǎng)絡。

4 結 論

本研究明確了lncMD對miR-1轉錄的調(diào)控作用,揭示lncMD通過正調(diào)控miR-1的表達,抑制其靶基因Pax7的功能,進而促進肌分化。